胰腺占位性病灶細(xì)針穿刺活檢標(biāo)本中ppENK和TFPI-2基因甲基化檢測(cè)的可行性及其應(yīng)用

齊 燦，黃 強(qiáng)，劉臣海，呂向微，劉 振，汪 超

目的檢測(cè)胰腺組織ppENK和TFPI-2基因甲基化狀態(tài)，探討胰腺占位性病灶細(xì)針穿刺活檢標(biāo)本中ppENK和TFPI-2基因甲基化檢測(cè)的可行性及其應(yīng)用。方法采用重亞硫酸鹽測(cè)序PCR(BSP)法檢測(cè)86例胰腺占位性病變組織中ppENK和TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)CPG島的甲基化狀態(tài)，采用單因素及多因素回歸Logistic回歸分析ppENK基因和TFPI基因甲基化檢測(cè)的診斷價(jià)值，以及EUS-FNA聯(lián)合基因甲基化檢測(cè)在胰腺占位性病變中的診斷意義。結(jié)果本研究86例病例中，甲基化成功率為91.9%(79/86)，TFPI-2和ppENK基因的甲基化檢測(cè)率分別為95.9%(75/79)和91.1%(72/79)。腫瘤組與炎癥組以及腫瘤組和對(duì)照組的甲基化率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而炎癥組與對(duì)照組甲基化率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。受試者工作特征曲線結(jié)果顯示：TFPI-2基因、ppENK基因甲基化水平診斷胰腺癌的敏感度分別為83.6%、74.6%，特異度分別為81.8%、86.4%，診斷率分別為89.7%、81.2%，以TFPI-2基因或ppENK基因甲基化水平診斷胰腺癌的敏感度為92.5%，特異度為79.8%，而以基因TFPI-2和ppENK甲基化水平進(jìn)行診斷，其敏感度為74.6%，特異度為91.7%。結(jié)論TFPI-2和ppENK基因在胰腺腫瘤組織中具有高甲基化水平，且具有良好的敏感性和特異性，是胰腺癌的有利診斷指標(biāo)，結(jié)合EUS-FNA，能夠有效提高胰腺占位性病變的術(shù)前診斷。

胰腺腫瘤；胰腺癌；前腦啡肽原基因；組織因子途徑抑制物-2基因；甲基化；超聲內(nèi)鏡

胰腺疾病中，胰腺占位性病變占大多數(shù)，而手術(shù)切除是治愈胰腺占位性病變的唯一方法，但由于胰腺占位性病變本身存在的高風(fēng)險(xiǎn)和巨創(chuàng)性，因此，選擇胰腺手術(shù)之前均需要慎重權(quán)衡。盡管隨著外科技術(shù)的發(fā)展，但胰腺手術(shù)的并發(fā)癥仍保持在30%～50%不等，死亡率約3%～5%[1-2]。超聲內(nèi)鏡下細(xì)針穿刺活檢(endoscopic ultrasonography guided fine needle aspiration,EUS-FNA)能夠微創(chuàng)地獲取胰腺病灶細(xì)胞或組織樣本，理論上可以獲得術(shù)前的病理診斷，但其診斷準(zhǔn)確度受諸多因素的影響，如取材的質(zhì)量與數(shù)量、病灶位置大小、操作者技術(shù)水平以及有無(wú)病理醫(yī)師在場(chǎng)[3]。一些抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化被認(rèn)為是在腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期階段導(dǎo)致其失活的重要因素，而早期檢測(cè)這些抑癌基因的甲基化狀態(tài)就可以作為檢測(cè)有無(wú)組織癌變的重要指標(biāo)[4-5]。該研究通過(guò)檢測(cè)70例病例的胰腺癌組織及癌旁組織，16例病例的慢性胰腺炎組織的抑癌基因前腦啡肽原基因(preproenkephalin,ppENK)與組織因子途徑抑制物-2基因(tissue factor pathway inhibitor 2,TFPI-2)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，探討ppENK和TFPI-2基因甲基化水平檢測(cè)對(duì)胰腺占位性病變臨床診斷的意義，并提出EUS-FNA聯(lián)合胰腺腫瘤相關(guān)基因甲基化水平檢測(cè)的新方案，以提高胰腺占位性病變的早期診斷率。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源 選取2011年1月～2015年5月于安徽省立醫(yī)院膽胰外科就診，行超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下EUS-FNA并成功獲得組織標(biāo)本的胰腺癌患者70例,慢性胰腺炎患者16例，所有86例病例進(jìn)行手術(shù)并獲得術(shù)后病理并有完整資料。86例獲得組織標(biāo)本的病例均進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè),其中明確診斷的為69例(80.2%)，其中明確給出病理學(xué)診斷的為52例(60.5%)，提示標(biāo)本中可見(jiàn)異形細(xì)胞的17例(19.8%)，無(wú)法給出診斷的有17例(19.8%)，進(jìn)行基因組DNA純化和甲基化處理后的PCR擴(kuò)增和測(cè)序，其中有79例標(biāo)本能夠獲得基因甲基化測(cè)序圖，進(jìn)行基因甲基化檢測(cè)的成功率達(dá)到91.9%(79/86)，其中腫瘤組67例，炎癥組12例，另取10例癌旁正常組織作為對(duì)照組，所有診斷結(jié)果獲得手術(shù)術(shù)后病理證實(shí)。

1.1.2主要試劑及儀器 96#PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自杭州博日科技有限公司；紫外分析儀和穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購(gòu)自上海天能科技有限公司；3730測(cè)序列分析儀購(gòu)自美國(guó) ABI公司；臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自上海醫(yī)療器械有限公司；微型電泳槽購(gòu)自上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠；微型旋渦混合儀購(gòu)自江蘇省海門(mén)市美林貝爾有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)自蕪湖金瑞特計(jì)量檢測(cè)儀器有限公司；2×Master Mix購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；DNA抽提試劑盒、克隆試劑盒和DNA Marker購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；甲基化處理試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen 公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒和核酸染料購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的重亞硫酸鹽處理和純化

1.2.1.1 甲基化處理 將標(biāo)本分為腫瘤組、炎癥組及對(duì)照組，按照以下步驟處理：① 分別提取TFPI-2、ppENK基因的DNA 1 000 ng，置入95 ℃恒溫水浴鍋中5 min；② 分別加入DNA protect Buffer 35 μl，置入60 ℃恒溫水浴鍋中15 min；③ 分別加入Bisulfite Solution 85 μl，置入95 ℃恒溫水浴鍋中5 min；④ 分別加入除RNA酶的水補(bǔ)足到140 μl，置入60 ℃恒溫水浴鍋中15 min；⑤ 再置入30 ℃恒溫水浴鍋中10 min。

1.2.1.2 純化 ① 處理后液體直接轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管中，加入310 μl的BL液，再加入250 μl的無(wú)水乙醇；② 震蕩15 s混勻，轉(zhuǎn)入吸附柱，靜置5 min， 13 000 r/min離心1 min；③ 加入500 μl BW液，13 000 r/min 離心1 min，棄廢液；④ 加入500 μl BD液，室溫靜置15 min， 13 000 r/min 離心1 min，棄廢液；⑤ 加入500 μl BW液，13 000 r/min 離心1 min，棄廢液；⑥ 重復(fù)步驟⑤；⑦ 加入250 μl無(wú)水乙醇，13 000 r/min 離心1 min，棄廢液；⑧ 換新收集管，13 000 r/min 離心2 min；⑨ 將吸附柱放入1.5 ml EP管中，開(kāi)蓋，60 ℃干浴5 min；⑩ 在吸附柱膜上懸空滴加15 μl EB，靜置5 min，13 000 r/min 離心2 min收集DNA。處理后DNA， -20 ℃保存。

1.2.2PCR擴(kuò)增

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì) ppENK F:5′-TTTGTTTAGAGG GTAATGTTGG-3′，R:5′-CACCTTTCCATCTATAACCATT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物：481 bp，PCR反應(yīng)條件：54 ℃。ppENK有 26個(gè)CpG位點(diǎn)。TFPI-2 F:5′-TAGGAGAAAGTTTGGGAGGTAGG-3′， R:5′-TTTCTATCCTCCAACAAACATCAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物：363 bp，PCR反應(yīng)條件：59 ℃。TFPI-2有26個(gè)CpG位點(diǎn)。

1.2.2.2 PCR反應(yīng)體系 ① 將純化處理后的DNA加入2×Master Mix 25 μl，置入95 ℃升溫水浴鍋中10 min；② 加入Mg2+4 μl，置入95 ℃升溫水浴鍋中30 s；③ 加入PCR特異引物F(10 μmol/L) 1 μl，置入72 ℃恒溫水浴鍋中30 s；④ 加入PCR特異引物R(10 μmol/L)1 μl置入72 ℃恒溫水浴鍋中30 s；⑤ 加入ddH2O至總體積為50 μl，置入72 ℃恒溫水浴鍋中10 min；⑥ 4 ℃保存。

1.2.2.3 電泳檢測(cè)及回收 1.5%糖凝膠電泳觀察結(jié)果(部分)，電泳圖見(jiàn)圖1、2。

圖1 ppENK電泳檢測(cè)圖

圖2 TFPI-2電泳檢測(cè)圖

1.2.3PCR純化產(chǎn)物連接到pGM-T載

1.2.3.1 連接反應(yīng)體系 取2×Rapiligation Mix 5 μl，加入pGM-T Fast Vector 1 μl，再加入PCR Product 50 ng，最后加入ddH2O 補(bǔ)足到10 μl(16 ℃連接過(guò)夜)。

1.2.3.2 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 ① 100 μl感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上，完全解凍后輕輕將細(xì)胞均勻懸浮；② 加入10 μl連接液，輕輕混勻。冰上放置30 min；③ 42 ℃水浴熱激90 s。冰上放置2～3 min；④ 加500 μl LB培養(yǎng)基(無(wú)抗性)，180 r/min、37 ℃ 振蕩培養(yǎng)1 h；⑤ 室溫下6 000 r/min離心2 min，用槍頭吸掉400 μl上清液，用剩余的培養(yǎng)基將細(xì)胞懸??；⑥ 將細(xì)菌涂布在預(yù)熱的氨芐青霉素LB培養(yǎng)基平板(含抗性)上，37 ℃ 倒置培養(yǎng)12～16 h。

1.2.4陽(yáng)性克隆鑒定和質(zhì)粒提取與測(cè)定(sangon B518188) ① 用牙簽將長(zhǎng)出的菌落挑至LB液體培養(yǎng)基(含抗性)，200 r/min、37 ℃ 振蕩培養(yǎng)12～16 h；② 將目的片段TA克隆的菌液PCR鑒定(1.5%糖凝膠電泳檢測(cè))；③ 將鑒定為陽(yáng)性克隆的菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提；④ 按圖譜對(duì)質(zhì)粒M13+/引物測(cè)序。

1.2.5甲基化率的計(jì)算方式 BSP產(chǎn)物為啟動(dòng)子區(qū)的CpG島部位，包含了26個(gè)CpG位點(diǎn)，采取克隆測(cè)序每一個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析，每個(gè)樣本測(cè)10個(gè)克隆，計(jì)算其CpG位的甲基化率。甲基化率計(jì)算為所有甲基化的CG位點(diǎn)在所有CG位點(diǎn)中的百分比。即甲基化CG位點(diǎn)個(gè)數(shù)/(甲基化CG位點(diǎn)個(gè)數(shù)+非甲基化位點(diǎn)個(gè)數(shù))。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，對(duì)腫瘤組與炎癥組及正常組的比較行χ2檢驗(yàn)。用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)分析TFPI-2基因、ppENK基因的敏感度、特異度和曲線下面積(area under curve,AUC)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1穿刺獲得的少量組織條進(jìn)行基因甲基化水平檢測(cè)的可行性86例獲得組織標(biāo)本的病例中，進(jìn)行基因組DNA純化和甲基化處理后的PCR擴(kuò)增和測(cè)序，其中有79例標(biāo)本能夠獲得基因甲基化測(cè)序圖，進(jìn)行基因甲基化檢測(cè)的成功率達(dá)到91.9%(79/86)。BSP法檢測(cè)基因甲基化水平的示意圖見(jiàn)圖3。

2.2胰腺癌組織、慢性胰腺炎組織、癌旁組織中TFPI-2和ppENK基因甲基化檢測(cè)結(jié)果本研究79例成功獲得基因甲基化測(cè)序圖的標(biāo)本中，腫瘤組為67例，炎癥組12例，另取10例癌旁正常組織作為對(duì)照組。本研究對(duì)79例穿刺標(biāo)本的TFPI-2和ppENK基因進(jìn)行了甲基化檢測(cè)，結(jié)果顯示：TFPI-2和ppENK基因的甲基化檢測(cè)率分別為95.9%(75/79)和91.1%(72/79)，同時(shí)通過(guò)對(duì)該基因組DNA測(cè)序顯示，該兩個(gè)基因CpG島中有26個(gè)CpG位點(diǎn)。腫瘤組中TFPI-2基因甲基化率為(6.97±4.15)%， ppENK基因甲基化率為(5.25±2.97)%，炎癥組中TFPI-2基因甲基化率(2.49±1.96)%，ppENK基因甲基化率(2.87±2.81)%，而對(duì)照組中，TFPI-2基因甲基化(1.25±1.21)%， ppENK基因甲基化率(1.55±1.39)%，腫瘤組與炎癥組和對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而炎癥組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1～3。

圖3 BSP法檢測(cè)基因甲基化水平的示意圖

表1 基因TFPI-2、ppENK的甲基化水平 (n=79)

表2 各組中基因TFPI-2、ppENK的甲基化水平及其比較

表3 多重比較

2.3TFPI-2基因、ppENK基因甲基化水平診斷胰腺癌的敏感度與特異度分析結(jié)果ROC曲線結(jié)果顯示：TFPI-2基因、ppENK基因甲基化水平診斷胰腺癌的敏感度分別為83.6%、74.6%，特異度分別為81.8%、86.4%，診斷率分別為89.7%、81.2%，以TFPI-2基因或ppENK基因甲基化水平診斷胰腺癌的敏感度為92.5%，特異度為79.8%，而以基因TFPI-2和ppENK甲基化水平進(jìn)行診斷，其敏感度為74.6%，特異度為91.7%。見(jiàn)圖4、表4。

圖4 TEPI-2和ppENK基因甲基化水平的ROC曲線

2.4評(píng)價(jià)TFPI-2和ppENK基因甲基化水平對(duì)EUS-FNA診斷失敗病例中的診斷價(jià)值將17例穿刺無(wú)法獲得明確病理診斷的病例單獨(dú)分析，結(jié)果顯示有2例無(wú)法獲得滿意的基因測(cè)序圖，予以剔除，15例完成TFPI-2和ppENK基因甲基化的檢測(cè)，其中腫瘤11例，4例慢性胰腺炎，腫瘤組中，TFPI-2甲基化率大約>3.3%的為8例(72.7%)，ppENK甲基化率大約>3.52%的為5例(45.5%)，而慢性炎癥組中TFPI-2甲基化率大約>3.3%的為0例，ppENK甲基化率大約>3.52%的為1例(25%)，TFPI-2基因甲基化對(duì)胰腺腫瘤的診斷敏感度為72.7%，特異度為100.0%，而ppENK甲基化對(duì)胰腺腫瘤的診斷敏感度為45.5%，特異度為75.0%。將兩者結(jié)合進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，腫瘤組中TFPI-2或ppENK基因高甲基化水平的高達(dá)10例(90.9%)，TFPI-2和ppENK基因高甲基化水平僅為6例(54.5%)，而炎癥組中TFPI-2或ppENK基因高甲基化水平有1例，而TFPI-2和ppENK基因高甲基化水平為0例。見(jiàn)表5。

2.5EUS-FNA聯(lián)合TFPI-2和ppENK基因甲基化檢測(cè)對(duì)胰腺占位性病變的臨床診斷價(jià)值聯(lián)合EUS-FNA和基因甲基化水平測(cè)定，結(jié)果顯示聯(lián)合檢測(cè)的診斷率高達(dá)93.0%，較單獨(dú)檢測(cè)高(P<0.05)，但是如果檢測(cè)TFPI-2和ppENK基因甲基化均陽(yáng)性作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，則其與單純檢測(cè)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表6。

3 討論

胰腺癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展涉及到多種抑癌基因的異常沉默或失活。

表4 曲線下的區(qū)間

表5 TFPI-2和ppENK基因在穿刺無(wú)法明確病理的病例中的甲基化水平(n=15)

表6 EUS-FNA聯(lián)合TFPI-2和ppENK基因甲基化檢測(cè)在胰腺占位性病變的臨床診斷價(jià)值(n=86)

EUS-FNA通過(guò)其優(yōu)勢(shì)將活檢的準(zhǔn)確性提高了很多，但由于其收集的組織標(biāo)本較少，仍然存在較高的假陰性率，出現(xiàn)假陰性率的原因分析包括獲取的組織標(biāo)本少、病理科醫(yī)師技術(shù)水平和穿刺的準(zhǔn)確性等。據(jù)報(bào)道，EUS-FNA的診斷敏感度和準(zhǔn)確度隨著各個(gè)胰腺中心的穿刺經(jīng)驗(yàn)和病理科診斷水平的不同而不同，從75%～95%不等[5-6]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展及深入研究，表觀遺傳修飾的異常導(dǎo)致的基因突變或缺失被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的主要原因，由此出現(xiàn)了表觀遺傳修飾異常標(biāo)志物在診斷腫瘤中的應(yīng)用，微陣列技術(shù)先后應(yīng)用于乳腺癌、肺癌和胰腺癌等腫瘤CpG島甲基化研究,獲得的CpG島甲基化譜不僅可作為早期診斷指標(biāo),還與腫瘤的病理分型、藥物治療敏感性和預(yù)后判斷相關(guān)[7]。本研究通過(guò)采用BSP法檢測(cè)EUS-FNA獲得的胰腺病灶組織條中ppENK和TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)CPG島的甲基化狀態(tài)，結(jié)果提示穿刺獲得的組織條完全能夠滿足基因甲基化水平的檢測(cè)。

ppENK基因位于8號(hào)染色體，所編碼的阿片類(lèi)生長(zhǎng)因子在延遲細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制癌細(xì)胞增長(zhǎng)的過(guò)程中起重要作用[8-9]。據(jù)報(bào)道，超過(guò)90%的胰腺癌ppENK基因甲基化異常[10]。TFPI-2又稱(chēng)胎盤(pán)蛋白-5，是由位于7q22染色體上的TFPI-2基因所編碼的一種絲氨酸蛋白酶抑制物[11]。可以通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)纖維蛋白溶酶和胰蛋白酶的活性抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，激活金屬蛋白酶和細(xì)胞外基質(zhì)的降解[12-13],另外，還可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞凋亡[14]。腫瘤組、炎癥組及正常對(duì)照組的甲基化率結(jié)果提示腫瘤組患者的TFPI-2和ppENK基因甲基化率明顯高于炎癥組及正常對(duì)照組患者。這表明甲基化水平是影響抑癌基因(TFPI-2基因與ppENK基因)表達(dá)的重要因素，胰腺癌患者抑癌基因處于高表達(dá)狀態(tài)，而非胰腺癌患者處于未表達(dá)狀態(tài)。ROC曲線結(jié)果提示TFPI-2基因和ppENK基因的甲基化水平對(duì)于診斷胰腺癌具有較高的靈敏度與特異度。此外，根據(jù)對(duì)于TFPI-2和ppENK基因甲基化水平對(duì)EUS-FNA診斷失敗病例中的診斷價(jià)值的分析可以發(fā)現(xiàn)聯(lián)合TFPI-2或ppENK基因甲基化檢測(cè)可以明顯提高胰腺占位性病變的腫瘤診斷率。

綜上所述，胰腺癌患者的TFPI-2基因和ppENK基因處于高甲基化水平，其與EUS-FNA聯(lián)合檢測(cè)能提高診斷率，對(duì)于診斷胰腺癌有重要作用，可作為臨床胰腺癌術(shù)前診斷的重要指標(biāo)。但該方法需要超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下EUS-FNA取得胰腺癌的標(biāo)本，EUS-FNA穿刺的準(zhǔn)確性將決定本研究方法的可行性。此外，本研究尚缺乏TFPI-2和ppENK基因啟動(dòng)子甲基化是否與基因表達(dá)相關(guān)，其具體作用機(jī)制有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。

[1] Hidalgo M. Pancreatic cancer[J].N Engl J Med,2010,362(17):1605-17.

[2] Bassi C,Dervenis C,Butturini G,et al. Postoperative pancreatic fistula : An international study group (ISGPF) definition[J]. Surgery,2005,138(1): 8-13.

[3] Levy M J, Oberg T N, Campion M B, et al. Comparison of methods to detect neoplasia in patients undergoing endoscopic ultrasound-guided fine-needle aspiration[J]. Gastroenterology,2012,142(5):1112-21.

[4] Sun F K,Sun Q,Fan Y C,et al.Methylation of tissue factor pathway inhibitor 2 as a prognostic biomarker for hepatocellular carcinoma after hepatectomy[J]. J Gastroenterol Hepatol,2016，31(2):484-92.

[5] Buscail L,Faure P,Bournet B,et al. Interventional endoscopic ultrasound in pancreatic diseases[J]. Pancreatology， 2006，6(1-2):7-16.

[6] Al-Haddad M,Eloubeidi M A. Interventional EUS for the diagnosis and treatment of locally advanced pancreatic cancer[J]. JOP，2010，11(1):1-7.

[7] Issa J P. CpG island methylator phenotype in cancer[J]. Nat Rev Cancer,2004，4(12):988-93.

[8] Ohtsubo K,Watanabe H,Yao F,et al. Preproenkephalin hypermethylation in the pure pancreatic juice compared with p53 mutation in the diagnosis of pancreatic carcinoma[J]. J Gastroenterol,2006，41(8):791-7.

[9] Jiao L,Zhu J,Hassan M M,et al. K-ras mutation and p16 and preproenkephalin promoter hypermethylation in plasma DNA of pancreatic cancer patients: in relation to cigarette smoking[J]. Pancreas,2007，34(1):55-62.

[10] Ueki T,Toyota M,Skinner H,et al. Identification and characterization of differentially methylated CpG islands in pancreatic carcinoma[J]. Cancer Res,2001，61(23):8540-6.

[11] Rollin J,Iochmann S,Bléchet C,et al. Expression and methylation status of tissue factor pathway inhibitor-2 gene in non-small-cell lung cancer[J]. Br J Cancer，2005，92(4):775-83.

[12] Gerecke C,Scholtka B,L?wenstein Y,et al. Hypermethylation of ITGA4,TFPI2 and VIMENTIN promoters is increased in inflamed colon tissue: putative risk markers for colitis-associated cancer[J]. J Cancer Res Clin Oncol，2015，141(12):2097-107.

[13] Hubé F,Reverdiau P,Iochmann S,et al. Transcriptional silencing of the TFPI-2 gene by promoter hypermethylation in choriocarcinoma cells[J]. Biol Chem,2003，384(7):1029-34.

[14] Yu J,Liu R L,Luo X P,et al. Tissue factor pathway inhibitor-2 gene polymorphisms associate with coronary atherosclerosis in chinese population[J]. Medicine (Baltimore)，2015，94(42):1675.