結(jié)核分枝桿菌耐藥性相關(guān)膜蛋白MmpL6的表達(dá)與純化

崔克樂，李 靜，孫安源

在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的RND超家族中，MmpL家族蛋白已經(jīng)成為研究棒狀細(xì)菌細(xì)胞包膜相關(guān)功能的重要切入點(diǎn)[3-4]。結(jié)核分枝桿菌的基因組編碼有13個MmpL蛋白[3]，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測表明MmpL家族具有典型的12次跨膜結(jié)構(gòu)。然而MmpL6(Rv1557)預(yù)測只有6次跨膜，因此是MmpL家族中較為特殊的一個成員，目前對于其功能尚未有明確報道。該研究將構(gòu)建MmpL6蛋白的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)目的蛋白，為進(jìn)一步制備蛋白，研究其結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能，設(shè)計針對MmpL家族的抗結(jié)核藥物提供線索和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試劑與菌株P(guān)rimeSTAR?HS DNA Polymerase、dNTP Mixture、100 bp DNA Marker、限制性內(nèi)切酶Nde I、Xho I、T4 DNA Ligase等購自大連寶生物工程有限公司；TIANprep mini plasmid kit(50次)購自北京天根生化科技有限公司；Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System、anti-His抗體購自美國Promega公司；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)購自美國Sigma-Aldrich公司；N-十二烷基-β-D-麥芽糖苷(n-dodecyl-β-D-maltoside, DDM)、十二烷基二甲基氧化胺 (lauryl-dimethylamine-N-oxide, LDAO)等去垢劑購自美國Anatrace公司；PageRuler Protein Ladder購自美國Thermo公司；Ni-NTA蛋白純化凝膠以及Superdex200 10/300GL色譜柱、AKTA Purifier液相層析系統(tǒng)購自美國GE公司。引物合成與DNA測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2方法

1.2.1MmpL6表達(dá)載體的構(gòu)建 運(yùn)用PCR方法，從結(jié)核分枝桿菌M.tuberculosisH37Ra菌株基因組中擴(kuò)增得到MmpL6(Rv1557)全長DNA片段，所用引物序列為5′-AGGAATTCCATATGGTGCAGGGGATTTCAGTGACTG-3′(正向引物)，引入NdeⅠ酶切位點(diǎn)(酶切位點(diǎn)用下劃線標(biāo)注)；5′-ATCCGCTCGAGACGGTGGG TAGCCACCTGAG-3′(反向引物)，引入Xho I酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min 、98 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min、循環(huán)30次、72 ℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收大小為1 194 bp左右MmpL6目的片段，將目的片段及pET21b載體分別經(jīng)Nde I/Xho I雙酶切后，采用T4連接酶16 ℃連接12 h，轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞中，挑取卡那霉素(50 μg/ml)陽性平板上的克隆，以通用引物T7/T7 Terminate進(jìn)行PCR擴(kuò)增，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切及測序鑒定。

1.2.2MmpL6蛋白的表達(dá)條件篩選及優(yōu)化 將構(gòu)建成功的pET21b-MmpL6表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)、RP、Rosetta等表達(dá)菌株中。挑取單克隆菌落接種至4 ml液體LB培養(yǎng)基，加入終濃度為100 μg/ml的氨芐青霉素，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)。按1 ∶50的比例將過夜培養(yǎng)的菌液接種至10 ml含抗生素的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床中震蕩培養(yǎng)至600 nm光吸收(optical delnsity, OD600)值約為0.6，再分別轉(zhuǎn)移至不同溫度(37、25、12 ℃)的搖床中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600≈0.8，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；37、25、12 ℃條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)4、12、24 h。收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，14 000 r/min離心5 min后去除上清液，菌體沉淀用500 μl lysis buffer (70 mmol/L Tris pH 8.0、300 mmol/L NaCl、5 mmol/L imidazole) 重懸并在冰浴中超聲裂解。裂解后的菌液14 000 r/min、 4 ℃條件下離心20 min，保留上清液。將上述細(xì)菌上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含3% BSA的PBS封閉過夜，加入1 ∶2 000的anti-His 鼠源IgG單克隆抗體(一抗)，4 ℃孵育2 h后洗去一抗；加1 ∶5 000的羊抗鼠IgG抗體(二抗)孵育2 h；洗去二抗，加入辣根過氧化酶/堿性磷酸酶顯色劑孵育后進(jìn)行化學(xué)顯色檢測。

1.2.3MmpL6蛋白純化去垢劑的篩選 選取小量表達(dá)篩選到的最適表達(dá)條件表達(dá)約1 L菌液，離心收集菌體沉淀，并用適量 lysis buffer (50 mmol/L Tris pH 8.0、500 mmol/L NaCl、5 mmol/L imidazole，5% glycerol) 重懸，進(jìn)行超聲破碎。將超聲破碎后的菌液14 000 r/min, 4 ℃下離心20 min，取上清液。剩余上清分成若干份，分別加入不同種類的去垢劑，包括SDS、Empigen、Triton-X100、DM、DDM、LDAO、C12E8、C8E4、β-OG等，終濃度1%～2% (w/v)，在室溫下混合約1 h。將混合液在32 000 r/min, 4 ℃條件下超速離心1 h，取超速離心前后的上清樣品用于Western blot檢測。比較超速離心前后樣品上清液中蛋白的含量，判定去垢劑對膜蛋白的溶解能力。

1.2.4MmpL6蛋白的Ni-NTA磁珠親和純化 轉(zhuǎn)化有pET21b-MmpL6表達(dá)載體的表達(dá)菌株接種至LB培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)至OD600約為0.6，隨后轉(zhuǎn)至12 ℃搖床中，培養(yǎng)至OD600≈0.8，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，繼續(xù)在12 ℃搖床中培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)。收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，4 000 r/min離心20 min后去除上清液，菌體沉淀用適量 lysis buffer [50 mmol/L Tris pH 8.0、500 mmol/L NaCl、5 mmol/L β-ME]重懸 (1 L菌液約50 ml lysis buffer)。將重懸后的菌液放至冰水浴中冷卻并進(jìn)行超聲裂解。裂解后的菌液在14 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，保留上清液。向上清液中加入終濃度為1% (w/v) 的LDAO， 4 ℃條件下混合孵育約2 h。隨后向溶液中加入4 ml Ni-NTA凝膠，在4 ℃條件下混合約30 min。將混合液加入25 ml層析柱中讓其自然流穿。待液體全部流穿后，逐步加入10 倍柱體積的washing buffer I [50 mmol/L Tris pH 8.0、500 mmol/L NaCl、5 mmol/L β-ME、0.1% (w/v) LDAO]洗脫未結(jié)合的雜蛋白。隨后逐步加入10倍柱體積的washing buffer II [50 mmol/L Tris pH 8.0、500 mmol/L NaCl、5 mmol/L β-ME、0.1% (w/v) LDAO、20 mmol/L imidozole]洗脫非特異結(jié)合的雜蛋白。最后，逐步加入5倍柱體積的elution buffer [50 mmol/L Tris pH 8.0、500 mmol/L NaCl、5 mmol/L β-ME、0.2% (w/v) LDAO、200 mmol/L imidozole]洗脫目的蛋白，收集全部洗脫液。上述步驟所用buffer均在冰水中預(yù)冷。

1.2.5MmpL6蛋白的大量純化 將Ni-NTA親和純化得到的蛋白洗脫液轉(zhuǎn)入截留分子量為10 ku的超濾離心管中，3 200 r/min、4 ℃條件下離心至終體積約1 ml。將濃縮后的蛋白溶液在14 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，使用ATKA Purifier液相層析系統(tǒng)進(jìn)行凝膠過濾色譜(gel-filtration chromatography)純化。選用Superdex75 10/300GL 色譜柱層，流動相成分為50 mmol/L Tris pH 8.0、500 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT、0.1% (w/v) LDAO，5% (v/v) glycerol；實(shí)驗(yàn)溫度10 ℃。根據(jù)280 nm吸收曲線收集狀態(tài)均一的蛋白洗脫液，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

2 結(jié)果

2.1原核表達(dá)載體pET21b-MmpL6的構(gòu)建及鑒定以結(jié)核分枝桿菌M.tuberculosisH37Ra菌株基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增，檢測到大小位于1 200 bp附近的條帶(圖1A)，與目的蛋白MmpL6的基因片段(1 194 bp)大小一致。PCR產(chǎn)物連接至pET21b載體后，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選，獲得能夠擴(kuò)增出1 200 bp大小基因片段的陽性克隆(圖1B)；進(jìn)一步提取PCR陽性克隆中的重組質(zhì)粒并用Nde I/Xho I對進(jìn)行雙酶切鑒定，產(chǎn)生的兩個片段大小與預(yù)期結(jié)果相符合(pET21b載體大小為5 442 bp，MmpL6基因?yàn)? 194 bp )(圖1B)。最后的測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒中的MmpL6序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列完全一致，證明pET21b-MmpL6質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2pET21b-MmpL6的誘導(dǎo)表達(dá)為獲取MmpL6蛋白在E.coli不同菌株中的最優(yōu)表達(dá)條件，分別檢測了在BL21(DE3)、 RP、 Rosetta表達(dá)菌株中，在37、25、12 ℃條件下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)量。用anti-His抗體進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示，BL21(DE3)菌株在3個溫度條件下均未檢測到目的蛋白條帶；RP菌株中，37 ℃和12 ℃下檢測到極弱的目的蛋白條帶；Rosetta菌株中，37、25、12 ℃ 三個溫度條件下均檢測到目的蛋白的表達(dá)，在25 ℃和12 ℃條件下表達(dá)量較高。因此最終確定MmpL6蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件為pET21b載體，Rossetta菌株，25 ℃下0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12 h或12 ℃下0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)24 h。見圖2。

圖1 原核表達(dá)載體pET21b-MmpL6的構(gòu)建及鑒定

A：MmpL6基因的PCR擴(kuò)增；M：100 bp DNA Marker；1：PCR產(chǎn)物；B：菌液PCR及雙酶切鑒定；1：pET21b-MmpL6質(zhì)粒；2：pET21b-MmpL6 Nde I/Xho I 雙酶切；3：菌液PCR產(chǎn)物

圖2 Western blot檢驗(yàn)pET21b-MmpL6表達(dá)MmpL6蛋白

2.3MmpL6蛋白純化去垢劑的選擇MmpL6蛋白是結(jié)核分支桿菌細(xì)胞膜上的蛋白，體外需借助去垢劑幫助才能在溶液中保持穩(wěn)定且均一的狀態(tài)，因此對用于MmpL6純化的去垢劑進(jìn)行了篩選，以獲取最合適的純化條件。分別檢測了在SDS、DM、DDM、LDAO、AZ312、AZ314、AZ316、Emipgen、β-OG、C12E8、C8E4、Triton-X100等去垢劑。通過Western blot檢測去垢劑溶解前與溶解后溶液中蛋白含量(如圖3，分別對應(yīng)各去垢劑條件下第一與第二個樣品)，結(jié)果顯示SDS、LDAO、AZ312、AZ314、AZ316、Emipgen、C12E8、C8E4等去垢劑對MmpL6的提取能力較好，而DM、DDM較弱，Triton-X100、β-OG幾乎不能將MmpL6蛋白從E.coli細(xì)胞膜上提取出來。因此，后續(xù)將使用常用的LDAO對MmpL6蛋白進(jìn)行純化。見圖3。

圖3 Western blot法檢測不同去垢劑對MmpL6蛋白提取效果

2.4MmpL6蛋白的大量純化及凝膠排阻色譜分析大量表達(dá)MmpL6蛋白，采用Ni-NTA親和層析純化，對純化各步驟樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測。經(jīng)過含20 mmol/L 咪唑的緩沖液洗去雜蛋白，最后用含200 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白(圖4A)，在SDS-PAGE圖上可以看到明顯的蛋白條帶，位于35～45 ku,與MmpL6蛋白的理論分子量42.4 ku相符合(圖4B)。

圖4 MmpL6蛋白Ni-NTA親和純化結(jié)果

A：MmpL6蛋白Ni-NTA親和層析純化譜圖；峰1：含20 mmol/L咪唑緩沖液洗脫；峰2：含20 mmol/L咪唑緩沖液洗脫；B：MmpL6蛋白Ni-NTA親和層析純化的SDS-PAGE檢測；1：全細(xì)胞裂解液；2：全細(xì)胞裂解液14 000 r/min離心后沉淀；3：全細(xì)胞裂解液14 000 r/min離心后上清液；4：加入LDAO提取后的上清液；5：Ni-NTA結(jié)合后流穿液；6：含20 mmol/L咪唑緩沖液洗脫；7：含200 mmol/L咪唑緩沖液洗脫；M：Marker

對Ni-NTA親和層析純化得到的MmpL6進(jìn)行凝膠過濾色譜(分子篩)分析。經(jīng)Superdex75 10/300色譜柱純化后，在280 nm波長下出現(xiàn)兩個明顯的吸收峰，分別位于8.05 ml及11.04 ml(圖5A)。8.05 ml位于色譜柱外水體積附近，是高度聚集的(分子量超過200 ku)蛋白組分；根據(jù)標(biāo)定的色譜柱標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得出11.54 ml對應(yīng)的蛋白表觀分子量約為39.5 ku，與MmpL6蛋白的理論分子量42.4 ku一致，表明MmpL6蛋白在溶液中以單體形式存在。凝膠過濾色譜圖上目的蛋白吸收峰形狀對稱，表明蛋白均一性很好；SDS-PAGE結(jié)果顯示經(jīng)凝膠過濾色譜純化后的目的蛋白純度達(dá)到了95%以上(圖5B)。

圖5 MmpL6蛋白凝膠過濾色譜純化結(jié)果

A：MmpL6蛋白凝膠過濾色譜純化譜圖；B：MmpL6蛋白凝膠過濾色譜純化的SDS-PAGE檢測；1～6：對應(yīng)A圖各收集管數(shù)；7：1～6管混合后樣品；M：Marker

3 討論

由細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者外排泵蛋白參與的物質(zhì)外排，被認(rèn)為是細(xì)菌耐藥的重要機(jī)制。與其他RND蛋白一致，如被廣泛研究的大腸桿菌多藥物外排泵蛋白AcrB (AcrAB-TolC外排泵系統(tǒng)的主要功能分子)[5]，結(jié)核分枝桿菌MmpL轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有典型的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，同樣需要內(nèi)膜電化學(xué)質(zhì)子梯度以發(fā)揮功能[6-7]。然而，不同于介導(dǎo)外源化合物外排的AcrAB-TolC系統(tǒng)，MmpL蛋白質(zhì)似乎傾向于以較高的底物特異性輸出內(nèi)源親脂性分子[8-9]。目前已有的研究[10]顯示，MmpL家族蛋白參與多種物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，如海藻糖單環(huán)孢菌素(MmpL3)；聚酮化合物硫青霉烯二肌酸酯(MmpL7)[11]，磺脂酰-1(MmpL8)[12]；?；Ｔ逄堑霓D(zhuǎn)運(yùn)(MmpL10)[13],二甲?；视秃头翘撬狨?MmpL11)[14]。另外，MmpL5和MmpL7 參與藥物外排過程也得到了證實(shí)[15]。外排泵賦予一種或幾種藥物耐受性的研究已經(jīng)在分枝桿菌中得以證實(shí)。但是，這些研究多限于野生株及其實(shí)驗(yàn)突變株，有關(guān)泵的底物與耐藥表型的關(guān)系還未完全明確。

拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測表明MmpL家族具有典型的12次跨膜結(jié)構(gòu)，然而MmpL6(Rv1557)預(yù)測只有6次跨膜，是MmpL家族中較為特殊的一個成員。理論上，6次跨膜蛋白在功能上能夠行使物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，因此推測MmpL6可能代表了MmpL家族蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能的最小單元。目前，對于MmpL6的研究并不透徹，其結(jié)構(gòu)模式、轉(zhuǎn)運(yùn)分子以及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制仍有待揭示。本項目的研究成功實(shí)現(xiàn)了MmpL6蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中的高表達(dá)，純化結(jié)構(gòu)也顯示了MmpL6蛋白在體外的狀態(tài)穩(wěn)定性和均一性，為后續(xù)深入研究其結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。

以MmpL6的表達(dá)純化為基礎(chǔ)，將能夠借助生物化學(xué)手段對MmpL6的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及相關(guān)藥物外排功能進(jìn)行鑒定，闡明結(jié)核分枝桿菌耐藥性發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機(jī)制。這些研究也將對抗結(jié)核病新型藥物的開發(fā)產(chǎn)生影響，諸如改進(jìn)藥物設(shè)計、避免藥物成為外排泵的底物、增加藥物的持續(xù)內(nèi)流、篩選有效的外排泵特異抑制劑，這些都將為臨床上更有效地預(yù)防和治療疾病有價值的線索。

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