不同月齡對(duì)雌性SD大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)行為及海馬TREM2表達(dá)的影響

韓引秀，陳 征，崔 珍，燕怡青，劉婉玉，王 凌，葛金芳

隨著生活節(jié)奏的加快和人口老齡化趨勢(shì)的增加，抑郁癥和老年性癡呆等神經(jīng)精神疾病已發(fā)展為威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題。建立可靠的動(dòng)物模型以探索其發(fā)病機(jī)制成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域和神經(jīng)精神學(xué)科的重要研究方向。SD大鼠以數(shù)量多、繁殖快、適應(yīng)力強(qiáng)等特點(diǎn)，成為藥理、毒理、藥效及GLP實(shí)驗(yàn)研究中常用動(dòng)物，采用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察SD大鼠的情緒及學(xué)習(xí)記憶能力是神經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)常用方法[1-2]。Benice et al[3]研究表明，性別和年齡因素均可影響小鼠的學(xué)習(xí)記憶。而目前的研究[4-5]中考察年齡因素影響多使用雄性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，且多關(guān)注青年或中年實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與老年實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的差別。

研究[6]顯示，髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體2(triggering receptors expressed on myeloid cells 2，TREM2)是阿爾茨海默病的高風(fēng)險(xiǎn)基因，tau蛋白過磷酸化、神經(jīng)元凋亡及突觸前蛋白SNAP25下調(diào)等密切相關(guān)[7]。提示TREM2的失衡在學(xué)習(xí)記憶損傷的影響?；诒菊n題組前期研究[8-9]顯示，綜合女性抑郁或認(rèn)知障礙的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于男性的文獻(xiàn)報(bào)道[10]，該研究以2月齡和6月齡雌性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察不同月齡對(duì)神經(jīng)精神行為的影響及海馬TREM2的蛋白表達(dá)，為抑郁癥和老年癡呆模型的建立、機(jī)制研究及藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡和6月齡SPF級(jí)雌性SD大鼠各9只，購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始行為學(xué)檢測(cè)。

1.1.2主要試劑 一抗Sirt1(美國(guó)Cell Signaling Technoogy公司)；β-actin(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG、山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3主要儀器 Western blot相關(guān)儀器設(shè)備(美國(guó)Biorad公司)。

1.2方法采用行為學(xué)方法檢測(cè)，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)參照本課題組常規(guī)方法在本院神經(jīng)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立進(jìn)行[11-12]，實(shí)驗(yàn)期間暗光照明且攝像機(jī)實(shí)時(shí)記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Any-maze行為學(xué)分析軟件分析。

1.2.1曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 黑色曠場(chǎng)高30 cm，為一邊長(zhǎng)100 cm的正方形封閉區(qū)域。用白線將其劃分為16個(gè)面積大小相等的正方形方格。中間4個(gè)方格定義為中央?yún)^(qū)域，外周12個(gè)則為周圍區(qū)域。將大鼠面壁由任一角落放入曠場(chǎng)中自由活動(dòng)5 min，記錄并分析其活動(dòng)距離、中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間、直立次數(shù)及理毛次數(shù)。

1.2.2高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 高架十字迷宮離地50 cm，由2個(gè)開放臂45 cm×10 cm×30 cm、2個(gè)閉合臂45 cm×10 cm×30 cm和1個(gè)中間區(qū)4 cm×4 cm組成。實(shí)驗(yàn)時(shí)每只大鼠放在中間(頭朝開放臂)，允許其自由探索5 min，記錄并分析其在不同區(qū)域的停留時(shí)間、活動(dòng)距離及潛伏期。

1.2.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 迷宮為一圓形池，內(nèi)壁呈黑色，? 1.6 m、高度為50 cm。實(shí)驗(yàn)期間注入水并用食用色素將池水染成黑色，保持水深30 cm、水溫(22～23)℃，實(shí)驗(yàn)期間平臺(tái)位置及迷宮外參照物保持不變，實(shí)驗(yàn)的迷宮被劃分為四等分區(qū)域，依次定義為第一、二、三、四象限，實(shí)驗(yàn)分定位航行和空間搜索兩部分。定位航行期間大鼠連續(xù)接受為期3 d的訓(xùn)練，每天4次，記錄大鼠60 s內(nèi)分別從4個(gè)不同象限入水點(diǎn)入水找到平臺(tái)所需的時(shí)間，即逃生潛伏期，4次實(shí)驗(yàn)的平均成績(jī)記為當(dāng)日最終成績(jī)，進(jìn)入最后統(tǒng)計(jì)。第4天進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，即撤除平臺(tái)，從平臺(tái)的對(duì)側(cè)象限入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，記錄60 s內(nèi)的游泳軌跡并進(jìn)行分析。

1.2.4Y迷宮 Y迷宮由一個(gè)中心區(qū)域和周圍連接的三條完全相同的封閉臂48 cm×10 cm×20 cm組成,三臂互為120°角，呈三等分輻射狀。將其中一個(gè)臂封閉起來作為新異臂，另外兩個(gè)臂中固定放入動(dòng)物的為起始臂，則余下一個(gè)為熟悉臂。正式實(shí)驗(yàn)之前需先進(jìn)行訓(xùn)練期實(shí)驗(yàn)，訓(xùn)練期將大鼠放入起始臂，使其在起始臂和熟悉臂探索10 min。24 h后進(jìn)入檢測(cè)期實(shí)驗(yàn)，此時(shí)開放新異臂，允許大鼠自由探索5 min，記錄并分析大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡，根據(jù)公式計(jì)算新異臂優(yōu)先指數(shù)。新異臂優(yōu)先指數(shù)=新異臂停留時(shí)間/熟悉臂停留時(shí)間。

1.2.5強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)裝置為一個(gè)高60 cm，? 25 cm的圓柱型透明容器，實(shí)驗(yàn)時(shí)控制水溫在(22～23)℃，水深30 cm。每只大鼠游泳5 min，觀察指標(biāo)包括：① 不動(dòng)時(shí)間：指大鼠基本不做主動(dòng)的活動(dòng)，身體基本呈筆直狀態(tài)漂浮不動(dòng)，僅僅在必要的時(shí)候用后肢碰觸底面避免窒息，水面平靜無起伏；② 掙扎時(shí)間：指大鼠積極主動(dòng)的活動(dòng)，四肢無秩序運(yùn)動(dòng)，尤其前爪在水面上下不斷運(yùn)動(dòng)，努力向桶壁上方掙扎，水面起伏不停；③ 游泳時(shí)間：指大鼠在桶內(nèi)主動(dòng)的環(huán)繞游泳，身體彎曲，背部拱起。

1.3Westernblot方法檢測(cè)大鼠海馬TREM2的表達(dá)RIPA裂解液裂解右側(cè)海馬，勻漿后進(jìn)行蛋白定量。取勻漿后，等量組織加入蛋白變性劑，在沸水中煮沸10 min進(jìn)行蛋白變性。變性后取50 μg蛋白用15% SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5% 脫脂牛奶封閉1 h后，孵育相應(yīng)一抗(TREM2及β-actin濃度均為1 ∶1 000)并4 ℃過夜、洗脫后加二抗37 ℃孵育2 h，洗脫后ECL顯色、曝光并進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1不同月齡對(duì)SD雌鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)的影響2月齡大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的活動(dòng)總距離平均21.8 m，平均速度7.2 s，中央停留時(shí)間平均2.9 s，直立次數(shù)平均26.0次，理毛次數(shù)平均1次；6月齡大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的活動(dòng)總距離平均21.9 m，平均速度7.3 s，中央停留時(shí)間平均5.7 s，直立次數(shù)平均27.6次，理毛次數(shù)平均2次?？梢姡瑑山M大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的活動(dòng)距離和速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與2月齡相比，6月齡SD雌鼠的中央停留時(shí)間、直立次數(shù)和理毛次數(shù)均有增加趨勢(shì)，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2不同月齡對(duì)SD雌鼠在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)的影響與2月齡SD雌鼠比較，6月齡SD雌鼠在開臂的停留時(shí)間(圖1A)和活動(dòng)距離(圖1B)顯著增加，但進(jìn)入開臂和閉臂的潛伏期無顯著差異(圖1C)。

2.3不同月齡對(duì)SD雌鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)的影響兩組大鼠在Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中找到水下平臺(tái)所需時(shí)間(逃生潛伏期)(圖2A)。重復(fù)測(cè)量的單因素方差分析結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)天數(shù)(F=19.697，P<0.001)和月齡(F=6.956，P=0.018)均對(duì)SD雌鼠的逃生潛伏期有顯著影響。兩者之間無交互效應(yīng)。與2月齡SD雌鼠比較，6月齡SD雌鼠的逃生潛伏期縮短。

空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩組大鼠在1 min自由游泳時(shí)間內(nèi)的游泳總距離和游泳速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與2月齡SD雌鼠比較，6月齡SD雌鼠在目標(biāo)象限(定位航行實(shí)驗(yàn)中逃生平臺(tái)所在象限)的停留時(shí)間和游泳距離均顯著增加(圖2B、2C)。提示6月齡SD雌鼠的學(xué)習(xí)記憶能力優(yōu)于2月齡SD雌鼠。

圖2 不同月齡SD雌鼠在Morris迷宮實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn) A：定位航行實(shí)驗(yàn)的逃生潛伏期；B：探索實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)象限游泳距離；C：探索實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)象限停留時(shí)間；與2月齡組比較：*P<0.05

2.4不同月齡對(duì)SD雌鼠在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)的影響與2月齡SD雌鼠比較，6月齡SD雌鼠在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中的新異臂優(yōu)先指數(shù)顯著增加。提示6月齡SD雌鼠的學(xué)習(xí)記憶能力優(yōu)于2月齡SD雌鼠。見圖3。

圖3 不同月齡SD雌鼠在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn) 與2月齡組比較：*P<0.05

2.5不同月齡對(duì)SD雌鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)的影響兩組大鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間均較短，提示兩組大鼠均無行為絕望樣表現(xiàn)，且兩組大鼠的不動(dòng)時(shí)間、游泳時(shí)間和掙扎時(shí)間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

圖4 不同月齡SD雌鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)

2.6不同月齡對(duì)SD雌鼠海馬TREM2表達(dá)的影響與2月齡SD雌鼠比較，6月齡SD雌鼠海馬TREM2表達(dá)顯著降低。Pearson檢驗(yàn)結(jié)果表明，海馬TREM2的表達(dá)與大鼠在Morris水迷宮空間搜索實(shí)驗(yàn)中的目標(biāo)象限游泳距離呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.724，P=0.042)。見圖5。

圖5 不同月齡SD雌鼠海馬TREM2的表達(dá) 1～4：2月齡組；5～8：6月齡組；與2月齡組比較：*P<0.05

3 討論

模型動(dòng)物的神經(jīng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)是在神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)領(lǐng)域重要和常用的實(shí)驗(yàn)手段。除了應(yīng)激刺激、藥物干預(yù)等暴露因素之外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品系、年齡、性別等自然因素也會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的表現(xiàn)。本研究以SD雌鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察不同月齡對(duì)其神經(jīng)行為學(xué)的影響。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)被廣泛用于檢測(cè)大、小鼠的自主活動(dòng)、焦慮及探究行為[13]。本研究中，2月齡和6月齡SD雌鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中均適度活動(dòng)，且活動(dòng)距離和速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩組大鼠的自主活動(dòng)狀態(tài)正常且無差別。與2月齡SD雌鼠比較，6月齡SD雌鼠的中央停留時(shí)間、直立次數(shù)和理毛次數(shù)均有增加趨勢(shì)，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)是利用動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究特性和對(duì)高懸敞開臂的恐懼，形成矛盾沖突行為來考察動(dòng)物的焦慮狀態(tài)[14]。通常認(rèn)為，進(jìn)入開放臂次數(shù)及停留時(shí)間與大鼠的焦慮情緒成負(fù)相關(guān)，進(jìn)入開放臂次數(shù)越少，停留時(shí)間越短，說明老鼠的焦慮情緒越嚴(yán)重。本研究中，6月齡SD雌鼠在開臂的停留時(shí)間和活動(dòng)距離均高于2月齡SD雌鼠，提示6月齡SD大鼠更不焦慮。除了可以評(píng)價(jià)焦慮狀態(tài)之外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在開臂的活動(dòng)狀態(tài)也反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究欲望。綜合其在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中直立次數(shù)增多的行為，本研究結(jié)果顯示6月齡SD雌鼠探究行為較2月齡增多。

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的絕望行為，可用于抑郁癥動(dòng)物模型評(píng)價(jià)及抗抑郁藥物篩選。本研究中，2組大鼠的不動(dòng)時(shí)間均較短，且兩組大鼠的不動(dòng)時(shí)間、游泳時(shí)間及掙扎時(shí)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩組大鼠無行為絕望表現(xiàn)。

Morris水迷宮和Y迷宮是評(píng)估嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶能力的經(jīng)典方法[14-16]，品系、性別和年齡均為影響其實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素之一[17]。本研究中，與2月齡SD雌鼠比較，6月齡SD雌鼠在Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)中的逃生潛伏期縮短、空間探索實(shí)驗(yàn)中的目標(biāo)象限停留時(shí)間及游泳距離增加，提示其學(xué)習(xí)記憶能力優(yōu)于2月齡組。與此相一致的是，6月齡SD雌鼠在Y迷宮中的新臂優(yōu)先指數(shù)也顯著高于2月齡組。與此相對(duì)應(yīng)，在人類的成長(zhǎng)過程中，從少年到青壯年時(shí)期的學(xué)習(xí)記憶能力也逐漸增強(qiáng)，隨年齡進(jìn)一步增長(zhǎng)至老年時(shí)期則學(xué)習(xí)記憶能力逐漸下降。

研究[8-9]顯示，TREM2的基因多態(tài)性和表達(dá)改變與阿爾茨海默病等認(rèn)知障礙性疾病的發(fā)病密切相關(guān)，阿爾茨海默病患者腦內(nèi)TREM2表達(dá)上調(diào)并與神經(jīng)病理學(xué)改變密切相關(guān)。本研究中，6月齡SD雌鼠海馬TREM2表達(dá)低于2月齡組，且與大鼠在Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中的目標(biāo)象限游泳距離成負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)TREM2在學(xué)習(xí)記憶中的作用。

綜上所述，與2月齡SD雌鼠比較，6月齡SD雌鼠的探究行為增多，學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)，其機(jī)制可能與兩組大鼠海馬TREM2的表達(dá)差異有關(guān)。然而，本研究的不足在于沒有同時(shí)觀察模擬人類老齡階段的SD雌鼠行為學(xué)改變，也沒有同時(shí)關(guān)注性別差異。這些因素有待于以后的研究中進(jìn)一步觀察和分析。

[1] Russo E, Citraro R, Davoli A, et al. Ameliorating effects of aripiprazole on cognitive functions and depressive-like behavior in a genetic rat model of absence epilepsy and mild-depression comorbidity [J]. Neuropharmacology,2013, 64:371-9.

[2] Chen Z, Xu Y Y, Wu R, et al. Impaired learning and memory in rats induced by a high-fat diet: involvement with the imbalance of nesfatin-1 abundance and copine 6 expression[J]. J Neuroendocrinol,2017, 29(4).

[3] Benice T S, Rizk A, Kohama S, et al. Sex-differences in age-related cognitive decline in 57BL/6J mice associated with increased brain microtubule-associated protein 2 and synaptophysin immunoreactivity[J]. Neuroscience,2006,137(2): 413-23.

[4] Kougias D G, Hankosky E R, Gulley J M,et al. Beta-hydroxy-beta-methylbutyrate (HMB) ameliorates age-related deficits in water maze performance, especially in male rats[J]. Physiol Behav,2017,170:93-9.

[5] Gocmez S S, Gacar N, Utkan T, et al. Protective effects of resveratrol on aging-induced cognitiveimpairment in rats[J]. Neurobiol Learn Mem,2016,131:131-6.

[6] Guerreiro R, Wojtas A, Bras J, et al. TREM2 variants in alzheimer's disease[J]. N Engl J Med,2013,368(2):117-27.

[7] Lue L F, Schmitz C T, Serrano G, et al. TREM2 protein expression changes correlate with alzheimer's disease neurodegenerative pathologies in post-mortem temporal cortices[J]. Brain Pathol, 2015,25(4): 469-80.

[8] Ge J F, Qi C C, Qiao J P, et al. Sex differences in ICR mice in the morris water maze task[J]. Physiol Res,2013, 62(1): 107-17.

[9] Bimonte H A, Hyde L A, Hoplight B J, et al. In two species, females exhibit superior working memory and inferior reference memory on the water radial-arm maze[J]. Physiol Behav, 2000,70(3-4): 311-7.

[10] 謝雙燕，胡佳佳，周伯榮，等．鹽酸帕羅西汀對(duì)卵巢切除大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及血清雌激素水平的影響[J]．安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，50 (11)：1602-5．

[11] Ge J F, Xu Y Y, Qin G, et al. Nesfatin-1, a potent anorexic agent, decreases exploration and induces anxiety-like behavior in rats without altering learning or memory[J]. Brain Res,2015, 1629:171-81.

[12] 秦 干，徐亞運(yùn)，程江群，等．白藜蘆醇改善亞臨床甲狀腺功能減退癥大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及其可能機(jī)制[J]．安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，51(3)：378-82．

[13] Boyko M, Kutz R, Grinshpun Y, et al. Establishment of an animal model of depression contagion[J]. Behav Brain Res,2015 , 281:358-63.

[14] Walf A A, Frye C A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents[J]. Nat Protoc, 2007, 2(2):322-8.

[15] Vorhees C V, Williams M T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory[J]. Nat Protoc,2006,1(2):848-58.

[16] Deacon R M, Rawlins J N. T-maze alternation in the rodent[J]. Nat Protoc,2006, 1(1):7-12.

[17] 宿艷敏．Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中三種小鼠的學(xué)習(xí)能力及其性別差異[D]．石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2013．