CT-1042對SGC-7901人胃腺癌細(xì)胞抗癌效應(yīng)的體外研究

楊 軍，袁守軍

胃癌是全球常見的惡性腫瘤，預(yù)后相對較差，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。正常體細(xì)胞中基因組一旦不穩(wěn)定就會啟動凋亡系統(tǒng)。然而，在腫瘤細(xì)胞中盡管基因組不穩(wěn)定仍能保持存活并不斷分裂增殖，原因在于腫瘤細(xì)胞存在能夠抵抗凋亡的因子[2]，其中凋亡抑制蛋白家族(inhibitors of apoptosis，IAPs)發(fā)揮了重要的作用。人IAPs家族主要包括8個(gè)成員：cIAP-1、cIAP-2、XIAP、NAIP、Survivin、apollon、livin以及ILP-2[3-4]。因此抑制IAPs的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞走向凋亡是癌癥治療的一大策略。

伊立替康是一種喜樹堿類似物的抗腫瘤藥物，其作用靶點(diǎn)為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ，其通過與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ-DNA復(fù)合物結(jié)合，阻止斷裂單鏈的再連接，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。赤峰賽林泰藥業(yè)有限公司對于IAPs的研究已有多年的工作基礎(chǔ)，通過對伊立替康進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，篩選出一種既可以靶向作用于Survivin蛋白，又有很強(qiáng)活性的小分子候選藥物—CT-1042(圖1A)。該研究通過體外一系列試驗(yàn)來評價(jià)CT-1042對人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901的抗腫瘤作用，為其成藥性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。

1.2受試藥及試劑CT-1042注射用濃溶液和CT-1042附加溶劑(赤峰賽林泰藥業(yè)有限公司)；四氮唑藍(lán)(北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司)；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；Annexin V-FITC/PI、JC-1試劑盒、Hoechst 33342染色液(北京貝博生物公司)；RNase(北京天根生化科技有限公司)。

1.3主要儀器CO2氣體培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；XDS-1B倒置顯微鏡(中國重光公司)；SPECTROstarNano酶標(biāo)儀(德國BMG LABTECH公司)；Guava easyCyte 流式細(xì)胞儀(德國Millipore公司)；LumaScope 熒光顯微鏡(美國Etaluma公司)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)SGC-7901人胃腺癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中(補(bǔ)充青鏈霉素原液5 ml/500 ml)，置于37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每2 d換液1次，用0.25%胰酶消化、傳代和收集細(xì)胞。

1.5細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)將對數(shù)生長期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，活細(xì)胞計(jì)數(shù)后按每孔3 000個(gè)細(xì)胞(100 μl)加入到96孔板中。培養(yǎng)過夜后，每孔加入含不同濃度CT-1042的培養(yǎng)基100 μl，濃度設(shè)置為0.039 062 5、0.156 25、0.625、2.5、10、40 nmol/L，每個(gè)濃度4個(gè)平行孔。培養(yǎng)72 h后棄上清液，每孔加入100 μl新鮮配制的含0.5 mg/ml四氮唑藍(lán)的無血清培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4 h后棄上清液。每孔加200 μl DMSO溶解甲臜，輕度震蕩15 s后，用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸光度值。計(jì)算各濃度下CT-1042對SGC-7901細(xì)胞的生長抑制率，并用Origin 8.5繪圖軟件中的Logistic程序擬合細(xì)胞生長抑制曲線，得出半數(shù)有效抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)值。

1.6Hoechst33342染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化用0、1、2、4 nmol/L的CT-1042分別作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后，去除上層培養(yǎng)基；每孔加入1 ml 4%多聚甲醛避光固定20 min，去除固定液，PBS洗2次；每孔加入1 ml Hoechst 33342染色液(3 μg/ml)，染色10 min；去除染色液，PBS洗2次，于熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.7AnnexinV和PI雙染檢測藥物對細(xì)胞凋亡率的影響用0、1、2、4 nmol/L的CT-1042分別作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，PBS洗2次，離心；每孔加入100 μl 結(jié)合緩沖液，加入1 μl Annexin V，再加入2 μl PI，避光反應(yīng)20 min；離心，PBS洗一遍，離心，每孔加入400 μl結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.8JC-1探針檢測藥物對細(xì)胞線粒體膜電位的影響用0、0.5、1、2 nmol/L的CT-1042分別作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，PBS洗2次，離心；用事先配置好的500 μl JC-1染色工作液將細(xì)胞重懸，于CO2培養(yǎng)箱孵育15 min；離心，用500 μl事先配好且預(yù)熱的孵育緩沖液將細(xì)胞重懸，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞線粒體膜電位下降率。

1.9藥物對細(xì)胞周期分布的影響用0、0.5、1、2 nmol/L的CT-1042分別作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，PBS洗2次，離心；每孔加500 μl PBS重懸，并加500 μl無水乙醇混合后，冰浴1 h；離心，去上清液，每孔800 μl PBS重懸，并加入10 μl RNase(10 mg/ml)，37 ℃孵育30 min；離心，去上清液，加入500 μl PBS和25 μl(1 mg/ml)PI，避光反應(yīng)5 min，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期分布，并用MODFIT軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1CT-1042對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響MTT試驗(yàn)結(jié)果表明，CT-1042在終濃度0.039 062 5、0.156 25、0.625、2.5、10、40 nmol/L時(shí)，暴露于SGC-7901細(xì)胞72 h后，對細(xì)胞生長抑制呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，兩次試驗(yàn)的IC50值分別為(0.94±0.06)nmol/L和(1.02±0.04) nmol/L，最大抑制率分別為88.5%和84.5%，所設(shè)藥物濃度基本涵蓋了藥效作用窗口；且CT-1042的體外活性相比鹽酸伊立替康提高了10 000倍左右(P<0.001)(圖1B、表1)。

表1 兩種藥物對SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用(n=2)

2.2CT-1042對SGC-7901細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響不同濃度CT-1042(0、1、2、4 nmol/L)作用于SGC-7901細(xì)胞24 h。結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，且細(xì)胞核固縮、碎裂增多以及部分可見細(xì)胞核中染色體匯集于兩端，呈劑量依賴效應(yīng)，如紅色箭頭所示。提示受試細(xì)胞發(fā)生了凋亡，且受試藥物對于細(xì)胞周期分布可能具有一定的影響(圖2)。

圖2 CT-1042對SGC-7901細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響 Hoechst×40

注：紅色箭頭所指為陽性染色細(xì)胞;A：空白對照組；B～D：1、2、4 nmol/L CT-1042

2.3CT-1042對SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響不同濃度CT-1042(0、1、2、4 nmol/L)作用于SGC-7901細(xì)胞24 h，Annexin V標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞，PI標(biāo)記晚期凋亡和死亡的細(xì)胞。結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞的比例(早期+晚期)呈現(xiàn)濃度依賴性升高，空白、低、中和高劑量的凋亡率分別為(1.36%+2.82%)、(4.03%+20.41%)、(10.16%+32.89%)和(14.38%+35.41%)，可見受試藥中高劑量組的凋亡率顯著高于空白對照組，說明CT-1042能誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡(P<0.001)。見圖3。

2.4CT-1042對SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位的影響不同濃度CT-1042(0、0.5、1、2 nmol/L)作用于SGC-7901細(xì)胞24 h。結(jié)果顯示，細(xì)胞線粒體膜電位隨藥物濃度的升高呈依次下降趨勢，空白對照組的下降比例為6.67%，而在2 nmol/L時(shí)，比例已經(jīng)上升到35.28%(P<0.01)。提示此時(shí)細(xì)胞已發(fā)生早期凋亡，這與2.3的結(jié)果相一致。見圖4。

2.5CT-1042對SGC-7901細(xì)胞周期分布的影響不同濃度CT-1042(0、0.5、1、2 nmol/L)作用于SGC-7901細(xì)胞24 h。結(jié)果顯示，正常的SGC-7901細(xì)胞G0/G1期、S期、G2/M期分布比例分別為57.78%、28.12%和14.10%；隨著藥物濃度的增高，受試藥組G0/G1期細(xì)胞的比例在逐漸減少，G2/M期的比例在逐漸升高，且在2 nmol/L時(shí)，G0/G1期、S期、G2/M期分布比例分別為0、9.54%和90.46%(P<0.001)。說明CT-1042能有效誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生G2/M期阻滯，呈現(xiàn)一定劑量效應(yīng)關(guān)系。提示細(xì)胞的周期阻滯進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡可能是其抗腫瘤的機(jī)制之一。見圖5。

圖3 細(xì)胞凋亡

A：CT-1042對SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響；B：SGC-7901細(xì)胞狀態(tài)分布圖；1：空白對照組；2：1 nmol/L；3：2 nmol/L；4：4 nmol/L；與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

全球超過70%的胃癌新發(fā)病例發(fā)生在發(fā)展中國家，約50%的病例發(fā)生在亞洲東部，主要集中在中國，胃癌目前已經(jīng)成為我國第三大常見腫瘤，并且是嚴(yán)重危害中國居民健康的主要疾病[5-6]。因此，迫切需要一種新型抗胃癌藥物的出現(xiàn)。凋亡是細(xì)胞程序性死亡，是最具有特性化的細(xì)胞死亡過程之一，細(xì)胞增殖和凋亡的平衡失調(diào)被看成是一種促進(jìn)腫瘤形成的信號[7-9]。凋亡性細(xì)胞死亡作為天然屏障在維持組織穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的作用[10]。一旦組織穩(wěn)態(tài)被打破，則會出現(xiàn)器官形態(tài)及功能的異常，腫瘤發(fā)生較為常見[2]。腫瘤細(xì)胞之所以能夠保持存活并不斷分裂增殖，和其強(qiáng)大的抗凋亡能力分不開。降低腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力，已經(jīng)極大地激起人們的研究興趣，如干預(yù)BCL-2家族[11-12]和IAPs，共同的目的都是促使腫瘤細(xì)胞走向凋亡。赤峰賽林泰藥業(yè)有限公司提供的CT-1042注射液能靶向抑制Survivin，降低受試細(xì)胞的抗凋亡能力，在體外能有效抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖作用，平均IC50值為0.98 nmol/L。

圖4 線粒體膜電位

A： CT-1042對SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位的影響；B：SGC-7901線粒體膜電位下降率變化；1：空白對照組；2：0.5 nmol/L；3：1 nmol/L；4：2 nmol/L；與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

本研究采用Annexin V和PI雙染檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，在藥物濃度為4 nmol/L時(shí)，可以誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡，凋亡誘導(dǎo)率為49.79%；并且相應(yīng)濃度下，細(xì)胞核發(fā)生固縮、碎裂的情況大量增加。此外，線粒體膜電位的下降是細(xì)胞發(fā)生早期凋亡的一個(gè)標(biāo)志性事件[13]，JC-1是一種檢測線粒體膜電位的理想熒光探針，對于正常細(xì)胞，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中發(fā)出紅色熒光，但隨著線粒體膜電位的下降會逐漸發(fā)出綠色熒光。本研究采用JC-1熒光探針來檢測受試藥對SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位的影響，研究顯示在藥物濃度為2 nmol/L時(shí)，已有35.28%的細(xì)胞發(fā)生線粒體膜電位的下降，指示早期凋亡的發(fā)生。并且通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布，顯示隨著藥物濃度的增加，CT-1042逐漸阻滯細(xì)胞的周期進(jìn)展，使之停滯于G2/M期。提示該化合物可能是通過將細(xì)胞阻滯在G2/M期而干擾細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，進(jìn)而啟動凋亡機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。

圖5 周期分布

A：CT-1042對SGC-7901細(xì)胞周期分布的影響；B：SGC-7901細(xì)胞周期分布圖；1：空白對照組；2：0.5 nmol/L；3：1 nmol/L；4：2 nmol/L；與空白對照組比較：*P<0.05，***P<0.001

受試藥CT-1042體外對人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901有很強(qiáng)的抑癌活性，在伊立替康的基礎(chǔ)上提高了10 000倍左右，并能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和阻滯腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)展來發(fā)揮抗腫瘤作用。本文只對CT-1042注射液進(jìn)行了初步的研究，對于其促凋亡的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

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