卵黃蛋白原的產(chǎn)生及其非營養(yǎng)功能的研究現(xiàn)狀

霍巖 陳曉英 方榮祥 張莉莉

（1. 植物基因組學(xué)國家重點實驗室，北京 100101；2. 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

卵黃蛋白原（Vitellogenin，Vg），分子量約200 kD，在卵生動物體中是一種重要的營養(yǎng)蛋白。在卵形成過程中，Vg攜帶修飾在蛋白上的營養(yǎng)物質(zhì)一并經(jīng)運輸入卵，在卵內(nèi)被加工成為成熟的卵黃蛋白（Vitellin，Vn）。Vn在卵內(nèi)積累，為后期胚胎的發(fā)育提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、磷、硫及微量元素等［1-4］。作為一種生殖營養(yǎng)蛋白，Vg一般在卵黃發(fā)育期受到激素的誘導(dǎo)［5-7］，在昆蟲雌性成蟲的脂肪體、魚類的肝臟或者其他的動物的特定組織中特異性地大量表達(dá)，并通過定位于卵巢的Vg受體（Vg receptor，VgR）所介導(dǎo)的內(nèi)吞作用入卵［8-11］。Vg準(zhǔn)確的時空特異性表達(dá)決定了卵的正常發(fā)育［12］。Vg在卵巢外組織中翻譯為前體蛋白之后，會經(jīng)歷一系列加工過程，包括蛋白修飾、剪切、分泌、運輸、受體識別等。不同的Vg剪切形式及其時空表達(dá)，能介導(dǎo)不同的生物學(xué)功能。例如，在Vg運輸過程中，在血淋巴內(nèi)，特定剪切形式的Vg被證明與病毒表面蛋白互作［13］，將病毒攜帶入卵實現(xiàn)其垂直傳播的過程；對于病原微生物，Vg通過與病原蛋白的分子互作直接殺菌，或間接介導(dǎo)昆蟲對微生物的免疫識別［14-16］。本文將綜述Vg的基本結(jié)構(gòu)、加工運輸及近年來在Vg非營養(yǎng)功能方面的新進(jìn)展，旨為后續(xù)Vg的功能研究提供指導(dǎo)。和灰飛虱體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)大量的Vg小亞基單獨由脂肪體分泌并向卵巢運輸?shù)默F(xiàn)象，Vg在該區(qū)域的高度修飾有可能在其介導(dǎo)的營養(yǎng)輸送中發(fā)揮主要功能。DUF和vWD兩個結(jié)構(gòu)域均具有與病毒或細(xì)菌互作的性質(zhì)，對微生物進(jìn)行識別并介導(dǎo)微生物的清除或垂直傳播［13，21］。在三維結(jié)構(gòu)上，位于N末端的VitN的主要結(jié)構(gòu)是N-折疊；其后是一段α螺旋結(jié)構(gòu)，其和位于C端結(jié)構(gòu)域的序列，形成一個“脂穴”結(jié)構(gòu)，是脂肪分子結(jié)合的主要部位［12］。

1 Vg的基本結(jié)構(gòu)

不同來源的Vg在結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性：其N端為引導(dǎo)蛋白分泌的信號肽序列，從N端到C端依次編碼3個結(jié)構(gòu)域：卵黃蛋白原N端結(jié)構(gòu)域（Vitellogenin N domain，VitN），未知功能結(jié)構(gòu)域（Unknown function domain，DUF）和血管性血友病因子結(jié)構(gòu)域（von Willebrand domain，vWD）［8］。VitN結(jié)構(gòu)域的主要特點包括：（1）多數(shù)Vg同源蛋白在該結(jié)構(gòu)域內(nèi)編碼兩個由連續(xù)絲氨酸組成的絲氨酸聚集區(qū)，是Vg的主要磷酸化位點，兩個絲氨酸聚集區(qū)之間具有保守的Arg-X-Arg/Lys-Arg（RXR/KR）酶切位點，幾乎所有Vg均能在該位點被特異的蛋白酶剪切形成N端小亞基和C端大亞基，剪切后的Vg亞基以聚合體形式一起分泌至血淋巴中；（2）該結(jié)構(gòu)域內(nèi)具有分泌信號肽和Vg與VgR的互作位點，因此單獨的Vg小亞基能夠完成向卵母細(xì)胞內(nèi)的運輸功能，絲氨酸的磷酸化對Vg的剪切及Vg-VgR的識別具有重要作用［17-18］；（3）該結(jié)構(gòu)域是重要的蛋白修飾區(qū)域，高達(dá)16%（W/W）位置被酯化，能結(jié)合25-40個脂肪；2/3的區(qū)域被磷酸化［19-20］。在蜜蜂

2 Vg的表達(dá)、加工及運輸

2.1 Vg的表達(dá)

Vg傳統(tǒng)上被認(rèn)為是在雌性個體處于卵巢發(fā)育期時特異性地誘導(dǎo)表達(dá)［6］，卵生脊椎動物的肝臟和昆蟲的脂肪體是Vg的主要合成加工部位。以昆蟲為例，在幼蟲期Vg不表達(dá)或表達(dá)水平很低，或Vg在非脂肪體細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)；變成成蟲后進(jìn)入了生殖生長階段，脂肪體中的Vg開始跳躍式地高表達(dá)，并且在產(chǎn)卵過程中一直維持很高的水平。對于沒有交配的雌蟲，Vg的表達(dá)則明顯降低［22-23］。除了脂肪體，在卵巢發(fā)育過程中，卵巢上的濾泡細(xì)胞也會合成部分Vg，為卵發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)［24］。

近年來對多個物種的Vg研究發(fā)現(xiàn)，除在卵巢發(fā)育期為了供給營養(yǎng)使得Vg大量表達(dá)之外，在幼蟲、雄蟲、或者各齡期昆蟲的其它組織中也發(fā)現(xiàn)有一定量的Vg表達(dá)。在功能性不育的蜜蜂的工蜂體內(nèi)，其下咽腺及與之毗鄰的頭部脂肪體細(xì)胞均能合成Vg，暗示了Vg用于育雛食物的功能；Bombus hypocrita的蜂后、工蜂及雄蜂從蛹到成蟲的各個發(fā)育階段Vg都能以不同的水平表達(dá)［25］；Camponotus festinatus的Vg在蜂后及工蜂體內(nèi)以不同豐度進(jìn)行表達(dá)，在成蟲羽化前Vg的合成水平較低［26］。Leucophaea maderae的雌性和雄性脂肪體細(xì)胞均有Vg表達(dá)［27］；我們近期對灰飛虱的研究發(fā)現(xiàn)在灰飛虱體內(nèi)，雄蟲和幼蟲都能穩(wěn)定表達(dá)Vg，與雌蟲不同，非雌性昆蟲的Vg僅表達(dá)于其血細(xì)胞內(nèi)，而在Vg主要合成組織脂肪體內(nèi)則完全沒有表達(dá)［28］。

2.2 Vg的表達(dá)調(diào)節(jié)

Vg通常在特定的發(fā)育時期大量表達(dá)，其產(chǎn)生、加工甚至運輸均依賴激素的調(diào)節(jié)作用［2-3，10］。調(diào)節(jié)Vg產(chǎn)生的激素主要為保幼激素（Juvenile hormone，JH），某些物種中蛻皮素和神經(jīng)肽也能協(xié)助JH調(diào)節(jié)Vg［29-30］。在調(diào)節(jié)卵巢發(fā)育及Vg產(chǎn)生相關(guān)的基因的上游通常結(jié)合有重要的應(yīng)答原件，包括激素受體。在卵巢發(fā)育期，JH增多并作為配體分子與激素受體結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)相應(yīng)基因的表達(dá)。飛蝗脂肪體中的伴侶蛋白Grp78（78 kD glucose-regulated protein）能協(xié)助Vg在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上翻譯產(chǎn)生時正確折疊，JH能夠誘導(dǎo)Grp78基因的表達(dá)，從而對Vg的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控［31］。JH同時能調(diào)節(jié)蝗蟲的Cdc6（cell-divisioncycle 6）基因，促使脂肪體和卵泡細(xì)胞的多倍體化，誘導(dǎo)Vg的表達(dá)和卵巢的正常發(fā)育［32］。對于大多數(shù)昆蟲，JH能通過調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)并最終促進(jìn)Vg的產(chǎn)生，而蜜蜂中，JH對Vg的產(chǎn)生是負(fù)調(diào)控作用——JH抑制Vg的表達(dá)［33］。利用激素對Vg的調(diào)節(jié)作用，人為干擾生物體內(nèi)的激素水平，甚至可以導(dǎo)致生物的“變性”，在雄性個體中誘發(fā)Vg的表達(dá)。當(dāng)在雄性蟑螂體內(nèi)注射入JH時，也能誘發(fā)Vg的產(chǎn)生，盡管產(chǎn)生的Vg后期加工與雌蟲不同［34］。這類情況不止發(fā)生在昆蟲中，在魚類也會發(fā)生：受水體到外界污染時，雄魚體內(nèi)JH會上調(diào)，能誘發(fā)Vg的表達(dá)［35-36］。

昆蟲的卵黃發(fā)育需要營養(yǎng)物質(zhì)供給，營養(yǎng)狀態(tài)決定了卵黃發(fā)育水平，尤其在蚊子這類吸血昆蟲中，只有在攝取了血液后，才能開啟Vg表達(dá)和卵巢發(fā)育［37］。研究表明無論JH對Vg是正調(diào)控還是負(fù)調(diào)控，營養(yǎng)物通過調(diào)控激素水平間接地正向調(diào)控Vg的表達(dá)。褐飛虱中，氨基酸營養(yǎng)能通過促進(jìn)JH的合成來促進(jìn)Vg的合成［38］。而在蜜蜂中，缺乏營養(yǎng)時，IIS（Insulin-IGF-1 signaling）表達(dá)上調(diào)，IIS和受體結(jié)合，激發(fā)下游的激酶活性，磷酸化FOXO，從而解除其對JH的抑制功能，導(dǎo)致JH上調(diào)，從而抑制Vg的表達(dá)［39］。

2.3 Vg的剪切

Vg的剪切通過枯草芽孢桿菌酶及其同工酶完成，該類酶具有furin結(jié)構(gòu)域，識別RXXR位點并在第四位R之后發(fā)生剪切［40］。大多數(shù)Vg同源蛋白具有一個或以上的RXXR位點，其中最保守的RXR/KR位于N端兩個絲氨酸聚集區(qū)之間，在該位點的酶切產(chǎn)生N端小亞基和C端大亞基［8］。對具有多個RXXR位點的Vg同源蛋白，其酶切發(fā)生于部分RXXR位點，需要通過實驗對酶切位點進(jìn)行驗證。例如，褐飛虱Vg有3個RXXR位點，僅在最保守的位點進(jìn)行剪切［41］；蟑螂Vg有5個酶切位點，剪切發(fā)生在其中3個位點之后［42］。除位點特異性剪切外，Vg也會被組織特異性或發(fā)育階段特異性剪切。例如淡水蝦的Vg在脂肪體中被枯草芽孢桿菌酶切產(chǎn)生大小兩個亞基，并分泌至血淋巴中，在血淋巴中，Vg大亞基進(jìn)一步被剪切為兩個中等大小的亞基［43］；蟑螂雌性和雄性血淋巴中含有種類不同的Vg亞基［29］。經(jīng)剪切的Vg亞基在進(jìn)入卵巢之后會進(jìn)一步加工并最終形成成熟的卵黃蛋白。本實驗室最近的研究發(fā)現(xiàn)灰飛虱Vg有5個RXXR位點，酶切可以發(fā)生在其中兩個位點之后，N端保守RXRR位點的酶切發(fā)生在入卵之前，C端大亞基的二次酶切則發(fā)生在入卵之后［28］；在雄性灰飛虱體內(nèi)，Vg僅由血細(xì)胞表達(dá)且不發(fā)生剪切，以全長形式分布于血細(xì)胞和血淋巴中，在水稻條紋病毒RSV的水平傳播中發(fā)揮功能［28］。由于Vg是多亞基組成的蛋白，剪切產(chǎn)生的含有不同亞基組成的Vg片段是否發(fā)揮不同的生物學(xué)功能是未來Vg研究的重要內(nèi)容之一。我們對灰飛虱Vg的不同分子形式進(jìn)行功能鑒定，發(fā)現(xiàn)其脂肪體加工產(chǎn)生的Vg N端小亞基可以分泌并入卵，但是由于缺乏與病毒RSV互作的vWD及DUF結(jié)構(gòu)域，不能介導(dǎo)病毒的傳播；而其血細(xì)胞產(chǎn)生的Vg含有C端RSV互作結(jié)構(gòu)域，因而在體內(nèi)發(fā)揮傳播RSV的功能［28］。

2.4 Vg的運輸

卵巢到達(dá)卵黃發(fā)育期，VgR在激素誘導(dǎo)下表達(dá)，開始介導(dǎo)Vg向卵內(nèi)的運輸［44-45］。Vg通過卵泡細(xì)胞的間隙到達(dá)卵母細(xì)胞表面，其VitN結(jié)構(gòu)域與VgR結(jié)合，通過內(nèi)吞作用將Vg運輸?shù)铰褍?nèi)［17］。Vg被VgR介導(dǎo)內(nèi)吞進(jìn)入卵細(xì)胞，快速被運輸?shù)匠跫墐?nèi)涵體，在內(nèi)涵體中，v-ATPase介導(dǎo)的酸性環(huán)境，使Vg和VgR分離［10］。內(nèi)涵體的酸性環(huán)境活化其內(nèi)的組織蛋白酶活性，對Vg進(jìn)行切割，加工成為成熟的Vn，Vn在卵內(nèi)聚集在光鏡可見的卵黃體中，后期，為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)。此外，除了直接被卵細(xì)胞上的VgR識別，有些物種內(nèi)，卵巢的其他種類細(xì)胞也可以吸收Vg，如在灰飛虱中，Vg除直接被卵細(xì)胞吸收之外，還可以進(jìn)入滋養(yǎng)區(qū)的營養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)，通過營養(yǎng)細(xì)胞與卵細(xì)胞相連的營養(yǎng)絲間接運輸至卵母細(xì)胞內(nèi)［13］。

3 Vg的非營養(yǎng)功能

3.1 Vg介導(dǎo)微生物的垂直傳播

卵生動物及昆蟲體內(nèi)均攜帶多種共生或病原微生物，包括細(xì)菌與真菌性共生菌，病毒病原菌等。作為卵生動物最重要的營養(yǎng)運輸?shù)鞍祝琕g被微生物劫持實現(xiàn)自身入卵傳播的研究得到了越來越多的例證（表1）。如在褐飛虱的血淋巴及卵巢中，酵母類共生菌周圍有大量的Vg聚集，暗示其入卵運輸與Vg的密切關(guān)系［46］；果蠅體內(nèi)的ZAM病毒是一種卵傳病毒，在感染ZAM病毒的卵巢中，ZAM出現(xiàn)在含Vg的內(nèi)吞小泡中，干擾果蠅VgR同時影響了Vg及ZAM病毒的入卵過程［47-48］；果蠅細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌Spiroplasma poulsonii在血淋巴中與Vg互作并因此被運輸至卵黃體中［49］；干擾蜱蟲的VgR會影響其卵巢發(fā)育，進(jìn)而影響Vg及巴貝西蟲的入卵能力［50］。

表1 Vg的非營養(yǎng)功能

在植物病毒經(jīng)介體昆蟲傳播的過程中，病毒經(jīng)卵傳播至子代，在幼蟲體內(nèi)過冬并在來年侵染植物，增加了植物病毒病害的防治難度，也使得對病毒在介體昆蟲體內(nèi)的垂直傳播機(jī)理成為重要的研究內(nèi)容。近年來在植物病毒經(jīng)介體昆蟲卵傳的研究取得了一系列重要的成果。其中之一為RSV在灰飛虱體內(nèi)的垂直傳播過程。研究發(fā)現(xiàn)RSV的入卵傳播路徑與灰飛虱Vg進(jìn)入滋養(yǎng)區(qū)營養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)而進(jìn)入卵母細(xì)胞的過程高度一致，機(jī)理研究表明RSV的結(jié)構(gòu)蛋白能與灰飛虱Vg的DUF和vWD結(jié)構(gòu)域發(fā)生體外分子互作，在體內(nèi)，RSV與Vg的C端大亞基在血細(xì)胞中結(jié)合并分泌至血淋巴［28］，運輸至卵巢滋養(yǎng)區(qū)，RSVVg復(fù)合體通過Vg與營養(yǎng)細(xì)胞表面VgR的分子互作，突破卵巢屏障，并最終進(jìn)入到卵母細(xì)胞內(nèi)，垂直傳播至子代灰飛虱［13］。水稻黑條矮縮病毒也能經(jīng)灰飛虱進(jìn)行水平傳播，但不能垂直傳播至子代，我們的工作發(fā)現(xiàn)該病毒的結(jié)構(gòu)蛋白不能與灰飛虱Vg發(fā)生分子互作。

這種植物病毒借助Vg運輸途徑進(jìn)行垂直傳播的機(jī)制在植物病毒的傳播中有一定的共性。最新近的研究證明了煙粉虱Vg在雙生病毒垂直傳播過程中的功能，為昆蟲Vg介導(dǎo)的病毒卵傳提供了新的例證［51］。番茄黃化卷葉病毒TYLCV能以持久循環(huán)方式經(jīng)由其介體煙粉虱進(jìn)行傳播，TYLCV進(jìn)入煙粉虱生殖器官的能力與煙粉虱卵巢的發(fā)育階段密切相關(guān)，隨著煙粉虱成蟲蟲齡的增加，TYLCV垂直傳播至子代昆蟲的幾率大大增加。機(jī)理研究表明了該病毒外殼蛋白與昆蟲Vg的分子互作，干擾Vg表達(dá)水平能抑制病毒的入卵幾率。與灰飛虱傳水稻黑條矮縮病毒相似，煙粉虱的Vg與中國番木瓜曲葉病毒的外殼蛋白不發(fā)生互作，該病毒也因此不能被煙粉虱垂直傳播至子代。

3.2 Vg的免疫功能及介導(dǎo)隔代免疫

血液或淋巴液是動物的循環(huán)系統(tǒng)，也是免疫作用的主要場所之一，Vg在通過血液或血淋巴進(jìn)行運輸?shù)倪^程中發(fā)揮免疫功能，直接或間接清除病原微生物的性質(zhì)首先在魚類研究中得到了較多的例證。魚的Vg可以作為模式識別分子，識別細(xì)菌細(xì)胞壁脂多糖和脂磷壁酸，直接促使細(xì)菌裂解［52］；在體外實驗中，將魚的Vg添加至細(xì)菌生長液中，抑制細(xì)菌的生長［53］；魚的Vg也可以作為調(diào)理素分子激活Fcγ受體介導(dǎo)的吞噬作用對病原菌進(jìn)行間接的清除［54］；在與病毒互作的研究中，Vg被發(fā)現(xiàn)能結(jié)合至病毒表面，通過對病毒粒子進(jìn)行交聯(lián)而將其中和［55］。昆蟲Vg的免疫相關(guān)功能首先在蚊子中得到解析，蚊子的含硫酯鍵蛋白（Thioester-containing protein 1，TEP1）介導(dǎo)瘧原蟲的免疫清除，Vg通過降低TEP1的表達(dá)間接調(diào)控了蚊子對瘧原蟲的清除效力［16］；蜜蜂的Vg受傷口誘導(dǎo)，并與壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合激發(fā)溶酶體的消化功能，加速細(xì)胞的清除過程［56-57］；蜜蜂血細(xì)胞的生長需要重要的微量元素鋅，Vg作為營養(yǎng)物質(zhì)能和健康的血細(xì)胞互作，為其提供鋅離子，以維持血細(xì)胞的生長及功能［58］。

Vg經(jīng)血淋巴傳播至子代的過程中，與其結(jié)合的微生物分子被攜帶入卵，則會介導(dǎo)免疫信號的隔代傳遞［15］?？绱庖咚兀═rans-generational immune priming，TGIP）將母體內(nèi)的免疫記憶傳給后代，以對后代起到初始保護(hù)作用。在脊椎動物中，母體以抗體作為TGIP傳遞免疫記憶，而昆蟲則將其體內(nèi)誘發(fā)先天免疫的病原微生物抗原作為TGIP，通過卵將免疫記憶傳給后代。以蜜蜂為例，其Vg與芽孢桿菌的細(xì)胞壁脂磷壁酸及大腸桿菌的細(xì)胞壁脂多糖互作，攜帶這些微生物碎片入卵，促進(jìn)子代昆蟲的免疫系統(tǒng)初建［15］。

圖1 卵黃蛋白原的產(chǎn)生、運輸及功能

3.3 Vg的行為調(diào)節(jié)功能

在對社會型昆蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，Vg對昆蟲的覓食行為有重要的調(diào)節(jié)作用［59］。對甲殼蟲研究發(fā)現(xiàn)，其大腦能表達(dá)VgR，Vg因此能運輸?shù)酱竽X中，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)來實現(xiàn)對昆蟲行為的調(diào)節(jié)［60］，這種機(jī)制對于了解Vg在多種完全社會型及半社會型昆蟲中的行為調(diào)節(jié)能力具有指導(dǎo)意義。Vg對自由基的結(jié)合，能保護(hù)健康細(xì)胞免于傷害，從而對蜜蜂的壽命起到重要的調(diào)節(jié)作用，Vg表達(dá)水平的不同，導(dǎo)致夏季生工蜂的壽命僅有6周，而冬季生工蜂能存活數(shù)月［61］。在蜜蜂的社會分工中，蜂王的功能是繁育后代，社會地位高，獲得比工蜂和雄蜂更多的營養(yǎng)供給。充分的營養(yǎng)物質(zhì)能降低IIS（Insulin-IGF-1 signaling），抑制保佑激素的產(chǎn)生，解除JH對Vg的抑制功能，提高Vg表達(dá)水平及蜂王的產(chǎn)卵能力［39］。

4 總結(jié)及討論

Vg作為卵黃蛋白的前體，其產(chǎn)生、加工及運輸過程在不同的動物間比較保守：在動物肝臟或昆蟲脂肪體細(xì)胞中，Vg的mRNA翻譯合成Vg蛋白前體，通過糖基化、磷酸化、酯化等修飾及枯草芽孢桿菌酶剪切，形成亞基，分泌至血淋巴并運輸至卵巢，其N端的VgR識別位點與VgR結(jié)合，通過內(nèi)吞作用運輸?shù)铰鸭?xì)胞中，為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)。Vg在從血淋巴向卵巢運輸過程中，會與微生物發(fā)生多種形式的互作，通過直接或間接的免疫功能清除病原微生物，或通過與微生物的互作攜帶微生物進(jìn)行垂直傳播，或通過與微生物碎片的互作，將免疫信號傳遞給子代（圖1）。對Vg非營養(yǎng)功能的研究集中于Vg與微生物互作及由此引發(fā)的促進(jìn)微生物傳播或通過免疫清除微生物的過程，深入了解Vg的非營養(yǎng)功能，需要了解Vg在卵巢外的多種剪切策略；由此產(chǎn)生的不同Vg分子形式，將介導(dǎo)多樣化的生物學(xué)功能。

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