微藻為營養(yǎng)源固定化硫酸鹽還原菌對含銅廢水動態(tài)去除試驗研究

李勇超，楊曉燕，李艷苓，耿 兵*

（1.湖南科技大學土木工程學院，湖南 湘潭 411201；2.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，農(nóng)業(yè)清潔領(lǐng)域團隊，北京100081）

隨著銅礦的開發(fā)利用，酸性銅礦廢水的產(chǎn)生量逐年增加。銅礦廢水pH值較低，含有Cu、Cd、As等多種金屬離子，且硫酸鹽濃度較高，對礦區(qū)及附近的水體、土壤等造成嚴重的污染[1]。傳統(tǒng)的處理方法主要是化學中和法，通過提高水體pH值，沉淀重金屬，然而實際操作和維持運行的費用昂貴[2]。

利用硫酸鹽還原菌（Sulfate－reducing bacteria，SRB）去除酸性礦山廢水中的重金屬受到環(huán)境工作者的廣泛關(guān)注。SRB是唯一能夠以作為最終電子受體進行無氧呼吸的微生物。SRB利用有機物作為電子供體，通過對有機物的分解代謝、電子傳遞、氧化等作用而獲取生存所需的能量，同時將還原為 S2－，而S2－可以與Cd2+和Cu2+等多種金屬離子作用生成CdS和CuS沉淀從而將其除去[3]。有機物不僅是SRB的碳源，也是其能量來源，是SRB生長和代謝必需的物質(zhì)[4－5]。但是酸性礦山廢水中溶解性有機碳含量通常較低，不利于進行生物修復[6]。因此，需要向廢水中投加有機物作為SRB生長的營養(yǎng)源。

目前學者認為乙醇[7]、乳酸[8]、葡萄糖[9]作為營養(yǎng)源成本較高。最近研究使用污水[10]、牲畜糞便[11]和蜜餞殘渣[12]等有機廢物作為外加有機物，但是它們很難被SRB全部利用，導致出水COD偏高，形成二次污染。同時金屬離子會對SRB，尤其是游離的SRB產(chǎn)生一定的毒害作用[13]，影響處理效果?？傊?，營養(yǎng)源及重金屬離子的毒害作用成為抑制SRB去除重金屬的主要因素。

微藻是自養(yǎng)型生物，以光能作為能源，可利用無機物質(zhì)合成復雜的有機質(zhì)，供自身需要，它是水體的初級生產(chǎn)者[14]。Oswald等[15]研究表明，高負荷氧化塘中的微藻經(jīng)過發(fā)酵會產(chǎn)生硫化氫氣體。而在其他水體和沉積物中微藻的分解同樣導致了硫化物的釋放，既微藻是硫酸鹽還原過程中的營養(yǎng)源[16]。此外，Boshoff等[17]發(fā)現(xiàn)，Spirulina spp.（螺旋藻）可以作為SRB的營養(yǎng)源，每克螺旋藻對硫酸鹽的還原能力在150 mg·d－1。另外，微藻能在光合作用的同時分泌細胞外聚合物，其主要成分是多聚糖（占胞外聚合物的40%～95%），與微藻本身相比這些物質(zhì)更容易被SRB所利用[15，18]。

基于此，本研究以微藻為SRB的營養(yǎng)源，并用特定材料將活性SRB與微藻包埋固定制備成小球，該微環(huán)境既有利于SRB對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，減少二次污染，又能降低重金屬離子對SRB的毒害作用。然后在上流式厭氧反應器操作條件下進行含銅廢水動態(tài)去除實驗，為水體重金屬污染SRB修復提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 硫酸鹽還原菌的富集、分離與鑒定

將取自延慶某牛場底泥按2%的接種量分裝到含有Postgate′s C培養(yǎng)基[19]的厭氧瓶中，通36 min氮氣，加塞放置在30℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，約7 d后，厭氧瓶內(nèi)呈現(xiàn)極濃的黑色，并散發(fā)出臭雞蛋氣味，表明硫酸鹽還原菌已經(jīng)大量繁殖。然后重新按2%的接種量接入另一厭氧瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復操作5次。

利用Hungate滾管技術(shù)[20]完成SRB菌的分離。滾管前，先將各厭氧試管中4.5 mL Fe（NH4）2（SO4）2·6H2O的固體培養(yǎng)基在沸水浴中融化。用移液槍吸取0.5 mL菌液，注入第1支試管內(nèi)，快速混勻后，再從第1支試管吸取0.5 mL菌液注入第2支試管，同時將第1支試管水平放置在冰浴中均勻滾動30 s。重復以上操作，將富集培養(yǎng)后的菌液稀釋成 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7共 7 個梯度，30 ℃遮光培養(yǎng)，直到管內(nèi)長出黑色菌落。從中挑取長勢良好、濃黑色的單菌落，接種于液體培養(yǎng)基中，將變黑的菌液繼續(xù)平板劃線，挑取單菌落，作進一步的純化。如此交替純化直至平板菌落形態(tài)一致。

分別從2組平行實驗中取對數(shù)生長期的新鮮SRB菌液，離心收集菌體，按試劑盒（北京普博欣生物）說明書提取菌株DNA，采用通用引物進行PCR擴增，16S rDNA 序列的引物 27F：5′－AGAGTTTGATCCT GGCTCAG－3′，1492R：5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′。委托北京三博遠志生物技術(shù)有限責任公司進行16S rDNA測序。

1.2 微藻的培育與水解發(fā)酵

普通小球藻、斜生柵藻、羊角月牙藻、螺旋魚腥藻從中國科學院武漢水生植物所購得，采用含有BG－11培養(yǎng)基[21]的營養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

取出一定量的培養(yǎng)3 d后微藻溶液，多次離心分離，洗滌。將富集后的微藻放置500 mL厭氧瓶中，投加一定量的土壤上清液，通氮氣20 min后，密封放入恒溫培養(yǎng)箱進行發(fā)酵，測定溶液COD值和脂肪酸的含量。

1.3 以微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球的制備

取1.342 g培養(yǎng)至對數(shù)期的微藻，滅活、離心后，與聚乙烯醇（PVA）投入到100 mL去離子水，加熱至80℃，然后加入海藻酸鈉、二氧化硅，形成凝膠溶液。待其冷卻至30℃時，取一定體積的SRB菌液（1×108cfu·mL－1），棄去上清液與凝膠溶液混合均勻。將凝膠菌藻溶液用膠頭滴管滴入到含有2%～8%氯化鈣的飽和硼酸溶液中，在室溫下硬化24 h后取出，用7%生理鹽水洗2～3次，冷藏備用。同時制備未投加微藻的固定化SRB微球作為對照實驗。

設(shè)計一個五因素四水平正交實驗，見表1，以硫酸鹽的去除率為主要指標，以微球的成球情況、質(zhì)量傳遞、機械強度為輔助指標，對正交實驗結(jié)果進行分析，確定固定化SRB微球的最佳制備條件。具體方法如下，機械強度測試：將固定化SRB小球放入100 mL注射器中，加一定的壓力，觀察小球的破損情況，其中小球外型完整記為機械強度極好，小球破裂數(shù)小于5個記為機械強度好，小球破裂數(shù)大于5個記為機械強度差。傳質(zhì)性能的測定：取數(shù)粒SRB固定化小球投入盛有200 mL自來水的錐形瓶中，滴加兩滴亞甲藍，定時觀察亞甲藍進入小球的情況，5 min內(nèi)球心被染為藍色傳質(zhì)性能記為極好，10 min內(nèi)浸入球心傳質(zhì)性能記為好，20 min及以上傳質(zhì)性能記為差。硫酸根還原能力的測定：將固定化小球在500 mL錐形瓶底部鋪勻，約2～3 cm厚，加滿Na2SO4溶液，密封靜置，測定去除率。

表1 正交實驗因素水平表Table1 The level and value range of different factors

1.4 動態(tài)實驗

采用上流式厭氧生化反應器進行微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球處理含銅廢水。上流式厭氧生化反應器為有機玻璃制成的圓柱，高420 mm，內(nèi)徑70 mm，徑高比為 1∶6，凈空體積約為 750 mL，反應器設(shè)有直徑為5 mm的進出水口。使用純水配制濃度為 1000 mg·L－1、Cu2+濃度為 100 mg·L－1的模擬廢水作為實驗進水，調(diào)節(jié)初始pH為5.5，氮氣除氧30 min。首先將微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球填充到整個反應器中，然后使用蠕動泵自下而上泵入含銅廢水，以0.5 mL·min－1速度均勻通過反應器，水力停留時間為25 h，按照一定的時間間隔取樣，測定出水中、Cu2+濃度以及COD值。兩組反應器同時運行，各裝置使用聚四氟乙烯管連接，見圖1。此外將未投加微藻的固定化SRB微球投入反應器，相同條件下運行，作為對照實驗。

圖1 含銅廢水動態(tài)去除實驗裝置圖Figure1 The experimental setup diagram for wastewater treatment in the bench－scale continuous runs

1.5 測定方法

2 結(jié)果與討論

2.1 分離硫酸鹽還原菌株的形態(tài)及16SrDNA序列分析

經(jīng)過富集分離，得到一株硫酸鹽還原菌，命名為GSRB，含鐵固體培養(yǎng)基上呈凸起黑色，菌落直徑1～3 mm，該菌株革蘭氏染色呈陽性，無芽孢，菌株為弧形，做波浪式運動，大小為（0.4～0.5）μm×（2.0～2.3）μm。

菌株GSRB的16S rDNA序列分析所得到的堿基序列在GenBank上登錄，登錄號為MF521825。利用GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源序列搜索，并將細菌GSRB的16S rDNA序列與最接近的種系群體的16S rDNA序列進行對比，通過鄰接法構(gòu)建了它和同源性較高的6個菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。據(jù)此初步斷定，GSRB為脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）的一個分支，它與Desulfovibrio sp.Strain KRS1的同源性達到83%，但系統(tǒng)發(fā)育樹顯示兩者并不在種群的同一個分支。

2.2 微藻發(fā)酵產(chǎn)物的測定

圖3為微藻在發(fā)酵過程中每天溶液COD值的變化?？梢钥闯觯捎诎l(fā)酵前投加了一定量的土壤上清液，第 1 d 溶液 COD 值為 1480～1620 mg·L－1，第 2 d，除了普通小球藻，其他微藻溶液中的COD值開始增加。這表明在共存水解發(fā)酵菌的作用下發(fā)酵開始進行，隨著反應的進行，雖然溶液COD值出現(xiàn)了波動，但總體來說，經(jīng)過6 d發(fā)酵，發(fā)酵液COD值都有所增加。因為各微藻的成分不同，所以發(fā)酵容易程度和產(chǎn)物不盡相同，COD值也各不相同。盡管本研究沒有對水解發(fā)酵細菌進行分離鑒定，但是實驗現(xiàn)象表明了微藻的水解發(fā)酵確實存在。同時Zhang等[23]也指明，SRB與發(fā)酵細菌之間的協(xié)同作用可能是影響高效利用復雜有機質(zhì)作為SRB碳源的關(guān)鍵。

圖2 以16S rDNA為基礎(chǔ)的菌株GSRB的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure2 Neighbor－joining phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

圖3 普通小球藻、斜生柵藻、羊角月牙藻、螺旋魚腥藻發(fā)酵6 d后溶液COD值Figure3 COD value of solution after six days fermentation of microalgae（Chlorella vulgaris，Scenedesmus obliquus，Selenastrum capricornutum，Anabaena spiroides）

表2 四種微藻五日發(fā)酵產(chǎn)物Table2 Fermentation product measured in the reaction solution

表2為發(fā)酵5 d后，各微藻溶液中的發(fā)酵產(chǎn)物?？梢钥闯?，普通小球藻的發(fā)酵產(chǎn)物67%為丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸；斜生柵藻經(jīng)過分解后88%為丙酸、丁酸、戊酸等；羊角月牙藻經(jīng)過發(fā)酵，大部分分解產(chǎn)物為丁酸和碳酸；螺旋魚腥藻76%以上分解產(chǎn)物為丙酸和戊酸。這說明各微藻在發(fā)酵菌的作用下易分解形成小分子脂肪酸。Cao等[24]考察了乙醇、揮發(fā)性脂肪酸、碳水化合物分別作為電子供體時，SRB生長情況及活性，結(jié)果表明小分子脂肪酸作為電子供體時，硫酸鹽還原能力最強，其中以甲酸條件下，硫酸鹽去除率最大，且最為經(jīng)濟。雖然本研究各微藻發(fā)酵產(chǎn)物幾乎都不含甲酸和乙酸，但是丙酸、丁酸、戊酸同為小分子揮發(fā)性脂肪酸，所以最終選用發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性脂肪酸比例最高的斜生柵藻作為SRB的包埋營養(yǎng)源。

2.3 微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球體系優(yōu)化

以硫酸鹽轉(zhuǎn)化率為主要指標，以機械強度、傳質(zhì)性能、成球難易為輔助性指標，考察微藻為營養(yǎng)源固定化SRB小球體系最佳制備條件。表3為正交實驗結(jié)果與極差分析，其中k1、k2、k3和k4代表硫酸鹽去除率的平均值，R代表該列的極差[25]。結(jié)果表明，實驗2和15硫酸鹽去除效果最好，硫酸鹽去除率分別達93.4%和98.6%。各因素對硫酸鹽去除率的影響由主到次排列為 D＞A＞C＞E＞B（即二氧化硅用量＞PVA 用量＞氯化鈣用量＞SRB包埋量＞海藻酸鈉用量）?？梢姡趸栌昧?、PVA用量對硫酸鹽去除能力的影響較大。通過對表3中的k1、k2、k3和k4值進行比較，可知固定化SRB微球最優(yōu)制備方案為A1B2C3D2E4，即PVA用量2%、海藻酸鈉1%、CaCl26%、二氧化硅1%、SRB包埋量50 mL。

各因素水平對硫酸鹽去除效應曲線見圖4。首先CaCl2中的Ca2+在包埋固定化過程中可與海藻酸根離子螯合形成不溶于水的海藻酸鈣凝膠，從而將細胞固定，當CaCl2濃度較低時，會出現(xiàn)溶脹現(xiàn)象，不利于SO2－4的還原，當CaCl2濃度過大又會影響小球的傳質(zhì)性，降低SRB菌的活性。其次是PVA的用量，當PVA的用量由2%到6%逐漸增加時還原率不斷降低，這是因為微球網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中交聯(lián)點過多，結(jié)構(gòu)致密，降低了微球的傳質(zhì)性能，從而影響到污染物的去除[26]，當PVA含量達到8%時還原率稍微增加，可能是PVA增加到一定程度，小球?qū)Φ奈阶饔迷鰪姟．敹趸韬繛?%時，小球?qū)€原率最高。SRB包埋量越大的還原效果越好，但微生物包埋量不可過大，否則其在微球內(nèi)部大量繁殖，可能導致細胞泄露，對水體造成二次污染[27]。海藻酸鈉可改善使用PVA造成的成球困難和傳質(zhì)阻力大的不足，防止粘結(jié)，但它對的還原影響最小。

表3 正交實驗結(jié)果和分析Table3 Analysis and results of Orthogonal experimental design for immobilized beads

圖4 5種因素對硫酸鹽去除率的影響趨勢Figure4 Effect of five factors on sulfate reduction rate

2.4 微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球的形態(tài)結(jié)構(gòu)

以斜生柵藻為營養(yǎng)源在最優(yōu)制備條件下制備固定化SRB微球。圖5（a）和圖5（b）分別為新鮮制備的微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球和浸泡14 d后固定化微球的數(shù)碼照片，圖5（c）為未投加微藻的SRB微球數(shù)碼照片。可以看出，新鮮制備的微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球表面光滑，成球性好，無拖尾，粒徑為2～3 mm，相對均勻。在水溶液中浸泡14 d后，微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球雖然出現(xiàn)了溶脹現(xiàn)象，但是整體來說微球沒有發(fā)生破裂，機械強度較好，微生物細胞不會發(fā)生泄漏。然而空白微球因不含微藻，顏色較淺，呈規(guī)則球形。

圖5 新鮮制備的微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球（a）、水中浸泡14 d后的微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球（b）和新鮮制備的空白SRB微球（c）的數(shù)碼照片F(xiàn)igure5 Digital photograph of fresh prepared immobilized SRB bead with microalgae as nutrient source（a），soaked in the water for 14 day（b），and immobilized SRB beads without microalgae as nutrient source（c）

圖6 微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球連續(xù)化處理含銅廢水變化Figure6 Sulfate content in the effluent from anaerobic reactor filled with immobilized SRB beads with microalgae as nutrient source

圖7 微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球連續(xù)化處理含銅廢水Cu2+變化Figure7 Copper ion content in the effluent from anaerobic reactor filled with immobilized SRB beads with microalgae as nutrient source

圖8 微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球連續(xù)化處理含銅廢水出水COD值Figure8 COD value of the effluent from anaerobic reactor filled with immobilized SRB beads with microalgae as nutrient source

2.5 微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球?qū)~廢水的動態(tài)去除

按照正交實驗最優(yōu)配比制備SRB微球，其中斜生柵藻的用量為1.432 g，硬化24 h，生理鹽水洗滌3次后，裝入上流式厭氧生化反應器內(nèi)，監(jiān)測出水COD值離子濃度，結(jié)果見圖 6、圖 7、圖 8。從圖 6可以看出，第1 d，由于海藻酸鈉微粒表面吸附作用導致對照實驗和微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球填充反應器中出水硫酸鹽濃度從1000 mg·L－1迅速降低至200 mg·L－1。隨著含銅高硫酸鹽廢水連續(xù)進入反應器，對照組出水含量在第2 d迅速上升到751.96 mg·L－1，隨后呈現(xiàn)出平穩(wěn)增加的趨勢，第45 d出水濃度為 967.32 mg·L－1，接近進水濃度。對于微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球來說，經(jīng)過第1 d吸附飽和后，第2 d出水中含量又重新升高，但是第5 d過后開始下降，第 21 d 最低至 389.03 mg·L－1，后又緩慢上升，至第39 d出水含量同對照組相差不多。這主要是微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球中SRB經(jīng)過5 d適應了環(huán)境，同時微藻易在共存發(fā)酵菌的作用下水解發(fā)酵，產(chǎn)生的小分子脂肪酸可被SRB菌作為營養(yǎng)源，將廢水中經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)換為S2－。經(jīng)過20 d后大部分可降解微藻已被利用，再加上Cu2+不斷累積造成對SRB菌的毒害，致使SRB菌的活性逐漸降低，還原能力下降濃度開始逐漸上升，經(jīng)過40 d左右的時間，上流式厭氧反應器中的固定化SRB微球徹底失效，出水濃度上升至對照水平。整體來說，在此運行條件下每克微藻作為營養(yǎng)源對的平均去除能力為182.17 mg·d－1。

圖8顯示，固定化微球填充厭氧反應器運行1 d后出水的COD值為56 mg·L－1，從第2 d開始COD的值開始增加，這再次證明了共生的發(fā)酵細菌對微藻降解生成了有機物，但是前期SRB仍然處于停滯期，對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率小于微藻的降解速率。隨著反應的進行，SRB適應了環(huán)境，硫酸鹽還原能力大幅增強，對有機物的需求量增加，從而導致出水COD值在第6 d達到最大值，隨后開始降低。第15 d以后，出水COD值為 173～263 mg·L－1。此外，對照組 SRB 由于缺乏營養(yǎng)物質(zhì)，出水COD值一直較低。Boshoff等[17]通過實驗室規(guī)模的上流式厭氧反應器研究表明31%的Spirulina spp（.螺旋藻屬）干固體可以作為SRB的碳源，當進水 COD為8∶1時，最高的硫酸鹽去除率達到90.3%，出水 COD 的值高達 3000～5600 mg·L－1。雖然固定化SRB微球?qū)α蛩猁}的去除率不如文獻[17]高，但是Boshoff等[17]在進水中投加了一定量的無機營養(yǎng)物可促進SRB的生長，其次，從其出水中較高的COD值可以看出此研究投加了大量的Spirulina spp（.螺旋藻屬）干固體。盡管斜生柵藻水解后的脂肪酸并沒有被SRB全部利用，但是它既保證了較高的硫酸鹽還原力，而且出水COD值相對較低。綜上，以微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球的形成，不僅可以減少含銅廢水對SRB的毒害作用以得到滿意的處理效果，而且可保證出水中含有較低的有機物，減少二次污染。

3 結(jié)論

（1）從牛場底泥中篩選分離出一株硫酸鹽還原菌菌株，經(jīng)16S rDNA測序，發(fā)現(xiàn)該菌株為脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）的一個分支。

（2）普通小球藻、斜生柵藻、羊角月牙藻、螺旋魚腥藻在發(fā)酵細菌作用下能夠生成丙酸、丁酸、戊酸等小分子有機酸，可為SRB代謝提供碳源和能源，其中斜生柵藻發(fā)酵產(chǎn)物最佳，選為包埋微藻。

（3）以硫酸鹽轉(zhuǎn)化率為主要指標，正交實驗表明微藻為營養(yǎng)源固定化SRB微球的最佳制備條件為PVA用量2%、海藻酸鈉1%、CaCl26%、二氧化硅1%、SRB包埋量50 mL。在該條件下，固定化SRB微球成球性好、粒徑（2～3 mm）相對均勻、水中浸泡14 d無破裂。

（4）將新鮮制備的固定化微球填充到上流式厭氧反應器，在進水濃度為 1000 mg·L－1、Cu2+濃度為100 mg·L－1、pH 為 5.5、水力滯留時間為 25 h 的條件下，運行36 d之前出水Cu2+含量維持在0.29～1.43 mg·L－1，達到《污水綜合排放標準》對總銅的要求；而且出水COD值較低，大幅降低了二次污染。

[1]Cai L M,Xu Z C,Qi J Y,et al.Assessment of exposure to heavy metals and health risks among residents near Tonglushan mine in Hubei,China[J].Chemosphere,2015,127：127－135.

[2]Hlabel P,Maree J,Bruinsma D,et al.Barium carbonate process for sul－phate and metal removal from mine water[J].Mine Water and the Environment,2007,26（1）：14-22.

[3]McCauley C A,O′Sullivan A D,Milke M W,et al.Sulfate and metal removal in bioreactors treating acid mine drainage dominated with iron and aluminum[J].Water Research,2009,43（4）：961-970.

[4]Zagury G J,Kulnieks V I,Neculita C M.Characterization and reactivity assessment of organic substrates for sulphate-reducing bacteria in acid mine drainage treatment[J].Chemosphere,2006,64（6）：944-954.

[5]Martins M,Faleiro M L,Barros R J,et al.Biological sulphate reduction using food industry wastes as carbon sources[J].Biodegradation,2009,20（4）：559-567.

[6]Li Y C,Hu X X,Ren B R.Treatment of antimony mine drainage：Challenges and opportunities with special emphasis on mineral adsorption and sulfate reducing bacteria[J].Water Science&Technology,2016,73（9）：2039-2051.

[7]Pagnanelli F,Cruz Viggi C,Cibati A,et al.Biotreatment of Cr（VI）contaminated waters by sulphate reducing bacteria fed with ethanol[J].Journal of Hazardous Materials,2012,199/200（2）：186-192.

[8]Najib T,Solgi M,Farazmand A,et al.Optimization of sulfate removal by sulfate reducing bacteria using response surface methodology and heavy metal removal in a sulfidogenic UASB reactor[J].Journal of Environmental Chemical Engineering,2017,5（4）：3256-3265.

[9]Singh R,Kumar A,Kirrolia A,et al.Removal of sulphate,COD and Cr（VI）in simulated and real wastewater by sulphate reducing bacteria enrichment in small bioreactor and FTIR study[J].Bioresource Technology,2011,102（2）：677-682.

[10]McCullough C D,Lund M A,May J M.Field-scale demonstration of the potential for sewage to remediate acidic mine waters[J].Mine Water&the Environment,2008,27（1）：31-39.

[11]Zhang M L,Wang H X.Organic wastes as carbon sources to promote sulfate reducing bacterial activity for biological remediation of acid mine drainage[J].Minerals Engineering,2014,69（69）：81-90.

[12]Das B K,Roy S,Dev S,et al.Improvement of the degradation of sulfate rich wastewater using sweetmeat waste（SMW）as nutrient supplement[J].Journal of Hazardous Materials,2015,300：796-807.

[13]Hao T W,Xiang P Y,Mackey H R,et al.A review of biological sulfate conversionsinwastewatertreatment[J].W aterResearch,2014,65：1-21.

[14]劉林林,黃旭雄,危立坤,等.15株微藻對豬場養(yǎng)殖污水中氮磷的凈化及其細胞營養(yǎng)分析[J].環(huán)境科學學報,2014,34（8）：1986-1994.

LIU Lin-lin,HUANG Xu-xiong,WEI Li-kun,et al.Removal of nitrogen and phosphorus by 15 strains of microalgae and their nutritional values in piggery sewage[J].Acta Scientiae Circumstantiae,2014,34（8）：1986-1994.

[15]Oswald W J,Golueke C G,Cooper R C,et al.Water reclamation,algal production and methane fermentation in waste ponds[J].Advances in Water Pollution Research,1964,7（3）：119-157.

[16]Nedergaard R I,Risgaard-Peterson N,Finster K.The importance of sulfate reduction associated with Ulva lactuca thalli during decomposition：a mesocosm experiment[J].Journal of Experimental Marine Biology&Ecology,2002,275（1）：15-29.

[17]Boshoff G,Duncan J,Rose P D.The use of micro-algal biomass as a carbonsourceforbiologicalsulfatereducingsystems[J].Water Research,2004,38（11）：2659-2666.

[18]Kalin M,Wheeler W N,Meinrath G.The removal of uranium from mining wastewater using algal microbial biomass[J].Journal of Environmental Radioactivity,2005,78（2）：151-177.

[19]Postgate J R.The sulfate-reducing bacteria[M].2nd Edition.UK Cambridge：Cambridge University Press,1984.

[20]Hungate R E,Macy J.The roll-tube method for cultivation of strict anaerobes[J].Bulletins from the Ecological Research Committee,1973,3（17）：123-126.

[21]沈丹丹.富油及富淀粉微藻培養(yǎng)與奶牛場廢水處理相結(jié)合的效果研究[D].廣州：暨南大學,2013.

SHEN Dan-dan.Integrated the biomass production of oleaginous and starch-rich microalgae and dairy wastewater treatment[D].Guangzhou：Jinan University,2013.

[22]國家環(huán)境保護總局.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].四版.北京：中國環(huán)境科學出版社,2002：211-212.

State Environmental Protection Administration.Methods for monitoring and analysis of water and wastewater[M].4th Edition.Beijing：China Environmental Science Press,2002：211-212.

[23]Zhang M L,Wang H X,Han X M,et al.Preparation of metal-resistant immobilized sulfate reducing bacteria beads for acid mine drainage treatment[J].Chemosphere,2016,154：215-223.

[24]Cao J Y,Zhang G J,Mao Z S,et al.Influence of electron donors on the growth and activity of sulfate-reducing bacteria[J].International Journal of Mineral Processing,2012,106-109：58-64.

[25]張鴻郭,李 猛,羅海玲,等.固定化硫酸鹽還原菌除鉛包埋條件優(yōu)化研究[J].環(huán)境科學與技術(shù),2017,40（2）：9-12.

ZHANG Hong-guo,LI Meng,LUO Hai-ling,et al.Optimizing embedding conditions of immobilized sulfate reducing bacteria for lead removal[J].Environmental Science&Technology,2017,40（2）：9-12.

[26]鄭 佩,陳芳艷,唐玉斌.固定化菌藻微球的制備、表征及其對富營養(yǎng)化湖水的修復[J].環(huán)境工程學報,2014,8（5）：1999-2005.

ZHANG Pei,CHEN Fang-yan,TANG Yu-bin.Preparation,characterization of immobilized bacteria-algae microspheres and bioremediation of eutrophic lake water[J].Chinese Journal of Environmental Engineering,2014,8（5）：1999-2005.

[27]Ruiz-Marin A,Mendoza-Espinosal L G,Stephenson T.Growth and nutrient removal in free and immobilized green algae in batch and semicontinuous cultures treating real wastewater[J].Bioresource Technology,2010,101（1）：58-64.

[28]Bayramoglu G,Arica M Y.Construction a hybrid biosorbent using Scenedesmus quadricauda and Ca-alginate for biosorption of Cu（Ⅱ）,Zn（Ⅱ）and Ni（Ⅱ）：Kinetics and equilibrium studies[J].Bioresource Technology,2009,100（1）：186-193.