鉛對塿土細菌群落組成的影響研究

安鳳秋，呂家瓏，刁 展，李海紅，趙琪琪

（1.西北農(nóng)林科技大學資源環(huán)境學院，農(nóng)業(yè)部西北植物營養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室，陜西 楊凌 712100；2.西安工程大學環(huán)境與化學工程學院，西安 710048）

土壤是人類賴以生存的重要資源，近年來，我國土壤重金屬污染問題日趨突出。大量研究表明，重金屬進入土壤可改變土壤的微生物活性，使群落結構及多樣性發(fā)生變化[2－5]。閻姝等[5]報道了重金屬污染的稻田土壤微生物量顯著下降，細菌和真菌脂肪酸（PLFA）變化幅度達到30%以上。Gough等[6]報道長期受不同濃度重金屬污染的淡水沉積物中，土壤微生物群落結構發(fā)生了改變和重建。Deng等[7]研究表明，重金屬污染可對農(nóng)田土壤根際微生物的群落結構和多樣性產(chǎn)生顯著影響。

研究微生物群落結構的方法主要有Biolog微平板法[10]、脂肪酸法[4，7]和 PCR變性梯度凝膠電泳（DGGE）[9－10]等，這些方法在靈敏度和精確度方面有一定的局限性。高通量DNA測序技術用于研究土壤微生物群落結構在精確度和靈敏度方面較上述方法均有大幅度提高。Ye等[11]采用高通量測序技術研究了活性污泥和污水中的微生物群落結構，結果顯示變形菌綱和熱孢菌綱相對豐度較高，污水中分支桿菌屬和弧菌屬是優(yōu)勢菌群。目前高通量測序技術大多用于研究污泥、廢水、尾礦及森林等生態(tài)系統(tǒng)的微生物群落組成變化[11－13]，對重金屬污染土壤的細菌群落組成相關內(nèi)容的報道較少，有少數(shù)研究以重金屬復合污染和實驗室模擬污染土壤為研究對象[14－15]，探討了重金屬污染對土壤微生物群落的影響。目前，采用高通量技術對鉛污染的塿土農(nóng)田土壤細菌群落組成變化的研究還很有限。

鑒于此，本試驗采用高通量技術研究鉛對塿土細菌群落組成的影響，揭示土壤理化性質與細菌群落組成之間的關系，為重金屬污染土壤的早期預警和生物修復提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地點及試驗設計

田間試驗地位于陜西省楊凌示范區(qū)五泉鎮(zhèn)（34°17′51″N，108°00′48″E）國家黃土肥力和肥料效益監(jiān)測基地，該基地海拔524.7 m，年平均氣溫約13℃，年平均降水量為585 mm。供試土壤屬褐土類塿土亞類，紅油土屬，厚層紅油土種（土墊旱耕人為土），黃土母質。該試驗地周圍為農(nóng)田，無工業(yè)企業(yè)分布。

試驗設3個處理，每處理3個重復，分別為對照（WCK）、低鉛處理（WLOW）、高鉛處理（WHIGH）。低鉛處理添加 Pb（NO3）2濃度為 175 mg·kg－1；高鉛處理添加Pb（NO3）2濃度為 350 mg·kg－1；對照不添加 Pb（NO3）2溶液。共9個小區(qū)，每個小區(qū)長2 m，寬1 m，小區(qū)之間設寬度為0.5 m的隔離行，并在每個小區(qū)四周埋設深度為0.5 m水泥隔板。于2010年6月3日將對應濃度Pb（NO3）2溶液添加至相應小區(qū)耕層中，對照組添加等體積的水，通過人工耕翻使0～20 cm表層土壤混合均勻；土壤含水量為田間持水量的80%，老化。之后，在小區(qū)實施小麥－玉米輪作。小麥、玉米品種分別為小偃22和陜單16。試驗前在小區(qū)土壤中施氮磷鉀底肥，底肥用量：尿素 0.15 g·kg－1；Ca（H2PO4）20.05 g·kg－1；K2SO40.10 g·kg－1。

2013年12月，采用“梅花”5點取樣法，用土鉆采集土壤樣品，取樣深度為0～20 cm，每個小區(qū)采集土樣約0.5 kg，將土樣充分混勻后去除植物殘體及石礫，取其中約0.1 kg裝入滅菌的自封袋中，置冰盒中迅速帶回實驗室，過2 mm篩后保存于－80℃冰箱中進行分子生物學分析；其余土樣裝入自封袋中帶回實驗室，室溫下自然風干，過篩后測定土壤基本理化性質及重金屬含量。

1.2 樣品分析

土壤pH值測定的土水比（質量∶體積）為1∶2.5；土壤有機質的測定采用重鉻酸鉀外加熱法；速效鉀的測定用火焰光度法；速效磷采用0.5 mol·L－1的NaHCO3浸提、鉬銻抗比色分光光度法測定；堿解氮采用堿解擴散法測定，上述方法均參照鮑士旦[16]的分析方法。

鉛全量采用 HNO3－HCl－HClO4消解火焰原子吸收（PE，AA800，美國）光譜法測定[16]，有效態(tài)鉛（APb）采用 EDTA 浸提[17]ICP－MS（Thermo，XseriesⅡ，美國）測定，每個樣品設置3個重復，取其平均值計算每個處理的相關指標。

1.3 DNA提取、PCR擴增和測序

采用DNA試劑盒提取土壤總DNA，型號為FastDNARspin kit（MP bio，Santa Ana，美國）。DNA濃度和質量采用超微量核酸蛋白測定儀檢測（Thermo，NanoDrop ND 2000，美國），將符合試驗要求的DNA送深圳華大基因公司擴增，通過Illumina MiSeq平臺完成高通量測序。PCR擴增采用16S rDNA基因V4區(qū)的通用引物 515F（5′－GTG CCA GCM GCC GCG GTAA－3′）和 806R（5′－GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT－3′）。PCR反應條件如下，預變性：95℃保持3 min；變性：95 ℃保持 30 s；退火：56 ℃保持 30 s；延伸：72℃保持45 s，共30個循環(huán)；72℃延伸20 min。序列平均長度253 bp，已提交NCBI數(shù)據(jù)庫，序列號SRP075183。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Mothur（V.1.36.1）過濾數(shù)據(jù)，獲得高質量的優(yōu)化序列，利用軟件USEARCH（v7.0.1090）在97%相似度下進行聚類得到可操作分類單元（OTU）的代表序列；通過RDP classifer（v2.2）軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫比對進行物種注釋，統(tǒng)計每個樣品在每個OTU中的豐度信息。

采用SPSS 22.0軟件對樣品的土壤基本理化性質、細菌豐度與多樣性指數(shù)、組間差異物種進行單因素方差分析（LSD法）和斯皮爾曼（Spearman）相關性分析。應用CANOCO 4.5軟件對環(huán)境因素和細菌群落結構進行冗余分析（RDA）。

2 結果與分析

2.1 土壤性質

土壤理化性質和鉛含量見表1。3個處理的土壤含水量、有機質、速效磷、速效鉀、有效態(tài)鉛和總鉛含量有顯著差異（P＜0.05），pH和堿解氮含量無顯著差異（P＞0.05）。

1.2.1 儀器 使用GE-VolusonE8型彩色多普勒超聲診斷儀(GE，美國)，陰道探頭RIC5-9-D，頻率5～9 MHz，常規(guī)腹部探頭4C-D，頻率1.7～6.2 MHz，經(jīng)腹三維容積探頭RA B4-8-D，占用率2.4～5.8 MHz。檢查中保持每例患者參數(shù)設定一致。宮腔鏡為Olympas 4.5 cm、6.5 cm連續(xù)灌流宮腔鏡(Olympas，日本)。

2.2 土壤細菌群落組成

9個土壤樣品高通量測序共得到153 653條高質量序列，平均每個樣品獲得17 073條序列。以97%相似度劃分共得到14 414個OTU，樣品中OTU數(shù)目范圍為1574～1652，平均每個樣品中有1601個OTU。

表2為3個處理的序列數(shù)及多樣性指數(shù)。方差分析結果顯示：WCK與WHIGH處理的序列數(shù)有顯著性差異（P＜0.05）；WLOW和WHIGH處理的豐富度指數(shù)（Chao和 ACE）具有顯著性差異（P＜0.05），且WLOW處理的豐富度指數(shù)大于WHIGH處理的相應值，說明WLOW處理的細菌群落豐富度高于WHIGH；比較多樣性指數(shù)（Shannon和 Simpson），WCK、WLOW 和WHIGH處理之間均無顯著性差異（P＞0.05）。

在97%的OTU相似度下，3個處理共得到2582個OTU（圖1），其中WCK和WLOW處理共有1822個OTU，WCK和WHIGH處理共有1796個OTU，WLOW和WHIGH處理共有1814個OTU，其中1697個OTU為3個處理共有，且WHIGH處理特有OTU數(shù)為204個，高于WCK和WLOW處理。

表1 土壤理化性質和鉛含量Table1 Characteristics of soil samples and lead content

表2 不同處理間土壤細菌豐度與多樣性指數(shù)Table2 Soil bacterial abundance and diversity indices between different treatments

圖1 3個處理的Venn圖（OTUS0.03）Figure1 Venn diagram shared bacterial OTU among three treatments（OTUS0.03）

2.3 細菌群落組成

2.3.1 門水平上的群落組成

3個處理的細菌群落組成大體相似，分別屬于27個門，31個綱，39個目，43個科，13個屬，但各種細菌所占比例略有差異。如圖2所示：變形菌門（Proteobacteria，平均相對豐度為25%）為最主要優(yōu)勢菌群，第二優(yōu)勢菌為放線菌門（Actinobacteria，平均相對豐度為18.60%），其他相對豐度較高的菌群有：酸桿菌門（Acidobacteria，平均相對豐度為17.82%），擬桿菌門（Bacteroidetes，平均相對豐度為12.04%），綠彎菌門（Chloroflexi，平均相對豐度為5.84%），浮霉菌門（Planctomycetes，平均相對豐度為5.27%），厚壁菌門（Firmicutes，平均相對豐度為5.22%）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，平均相對豐度達3.59%）。放線菌門（Actinobacteria）在 WHIGH處理中含量略高于WLOW 和 WCK處理，酸桿菌門（Acidobacteria）在WLOW處理中的含量略高于WCK和WHIGH處理，其余菌群在3個處理中差別不大。

2.3.2 綱水平上的群落組成

2.3.3 目水平上的群落組成

目分類水平上共得到39個菌群，放線菌目（Actinomycetales，平均相對豐度為9.74%）是優(yōu)勢菌群，相對豐度大于3%的菌群還有：藍藻菌目（Cytophagales），Saprospirales目，乳酸桿菌目（Lactobacillales），鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）。WHIGH處理中的放線菌目（Actinomycetales）和藍藻菌目（Cytopha gales）相對豐度在3個處理中最高。

圖2 細菌在門水平上的群落結構組成Figure2 The taxonomic composition distribution in samples of phylum－level

圖3 細菌在屬水平上的群落組成結構Figure3 The taxonomic composition distribution in samples of genus－level

2.3.4 屬水平上的群落組成

屬分類水平上共得到15個菌群（圖3），未分類菌群平均相對豐度達77%，表明土壤中存在大量新類群。相對豐度小于0.5%歸為其他種類的菌群達8.65%。乳球菌屬（Lactococcus）是優(yōu)勢菌群，且在WCK處理中的相對豐度居3個處理之首。

對3個處理的OTU進行PCA分析（圖4），第一主軸和第二主軸的貢獻率分別為15.64%和15.09%。WCK和WLOW處理均處于主軸下方，距離較近，表明兩者土壤中細菌的OTU組成相近，WHIGH距WCK和WLOW處理較遠，表明其細菌在OTU水平上的群落組成與WCK和WLOW處理差異較大。

圖4 不同濃度處理下的土壤細菌OTU主成分分析Figure4 Principal component analysis（PCA）of OUT in soil bacterial among three treatments

2.4 組間差異物種分析

在屬分類水平上對3個處理進行一維方差分析，結果如圖5所示。3個處理間共有9個屬具有顯著性差異（P＜0.05），除假單胞菌屬（Pseudomonas）和紅弧菌屬（Skemanella）相對豐度較高外，其余7個屬的相對豐度較低（＜0.3%）；WHIGH和WCK處理相比，3個屬有顯著差異（P＜0.05），分別是：假單胞菌屬（Pseudomonas），紅弧菌屬（Skemanella）和水棲菌屬（Enhydrobacter）；WLOW 和 WCK 處理相比，水棲菌屬（Enhydrobacter）、Lacibacter和貪噬菌屬（Variovorax）具有顯著差異（P＜0.05）；WHIGH與WLOW處理之間有5個屬具有顯著差異（P＜0.05），分別是：Balneimonas、壤霉菌屬（Agromyces）、水棲菌屬（Enhydrobacter）、Devosia和 Flavihumibacter。水棲菌屬（Enhydrobacter）在3個處理間差異均顯著；壤霉菌屬（Agromyces）和Devosia在WHIGH處理中的相對豐度大于WLOW和WCK處理，這兩個屬分別屬于放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）。3個處理在屬分類水平上呈現(xiàn)較多的低豐度差異顯著物種，WHIGH和WCK處理差異物種較多。

2.5 細菌群落與土壤性質的關系

細菌OTU水平群落組成與土壤性質冗余分析（RDA）如圖6所示。不同處理下第一主軸和第二主軸對細菌群落相對豐度方差的解釋比例分別為14.5%和14.4%，兩者共解釋28.9%的方差變化。有效態(tài)鉛和總鉛含量、土壤有機質、速效磷和含水量與土壤細菌OTU水平群落組成相關性較大。其中，有效態(tài)鉛和總鉛含量與WHIGH（Pb21W/Pb22W）處理的細菌OTU水平群落組成具有較強的正相關性，而與WCK（CK1W/CK2W/CK3W）和 WLOW（Pb11W/Pb12W）處理的細菌OTU水平群落組成呈較強負相關，WCK（CK1W/CK2W）處理的細菌OTU水平群落組成還與土壤有機質含量呈正相關。

圖5 屬分類水平上具有顯著性差異的物種分析Figure5 Analysis of significant differences at the genus－level

圖6 不同鉛濃度處理下土壤細菌群落與土壤理化指標的冗余分析Figure6 Redundancy analysis（RDA）of the relationship between the structure of soil microbial communities（relative abundances of OTUs）and environmental variables

在門分類上對菌群（相對豐度＞5%）進行Spearman相關性分析，結果如表3所示。有5種細菌與環(huán)境因素顯著相關，厚壁菌門（Firmicutes）與含水量顯著正相關，與速效鉀、有效態(tài)鉛和總鉛含量顯著負相關，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）與速效鉀含量顯著負相關，疣微菌門（Verrucomicrobia）與pH顯著負相關；速效磷、有效態(tài)鉛和總鉛含量與綠彎菌門（Chloroflexi）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）顯著正相關，而硝化螺旋菌門（Nitrospirae）與含水量顯著負相關。

表3 門分類水平上細菌群落與土壤性質的Spearman分析（相對豐度＞0.5%）Table3 Spearman′s rank correlations between abundant taxa of phylum－level（RA＞0.5%in all samples combined）and soil properties

3 討論

3.1 土壤鉛處理對細菌群落組成的影響

土壤受重金屬污染后，微生物群落組成可發(fā)生明顯變化[2，5，18]，但這種影響因土壤類型、重金屬污染劑量和污染周期長短而異[10，14，19]。Niklińska 等[19]報道長期受重金屬污染的森林土壤微生物群落組成變化不大。本研究的PCA分析顯示W(wǎng)CK和WLOW處理的細菌群落結構主成分相似，但WHIGH處理與二者有差異；通過對比豐富度指數(shù)（Chao和ACE），也顯示出WLOW和WCK處理之間無顯著差異，但WLOW與WHIGH處理之間呈顯著差異；WHIGH處理的Shannons指數(shù)略高于WLOW和WCK處理的相應值，其特有的OTU數(shù)為204個（圖1），因此WHIGH處理細菌群落多樣性略高于WLOW和WCK處理。Golebiewski等[14]報道重金屬污染的土壤樣品在門和綱的分類水平上不能充分表現(xiàn)出微生物群落變化，需要更低的分類單元描述微生物群落變化，本文在門分類水平上，細菌群落組成除放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）在三個處理間略有差異外，其余類群在3個處理間大體相似，這與Golebiewski等結論相似；而在屬分類水平上，不同處理間才呈現(xiàn)出較多的差異顯著物種（圖5）；且WHIGH與WLOW具有顯著差異的屬達5種（P＜0.05），均為低豐度物種（相對豐度＜0.3%），可見本文細菌群落組成的變化主要體現(xiàn)在低豐度菌群發(fā)生了顯著改變。這也表明高通量技術比常規(guī)方法具有更高的靈敏度，能夠探測到微生物群落結構的細微變化。

一定程度的重金屬污染能改變原有群落內(nèi)部種群之間的競爭關系，導致優(yōu)勢種群的變更或者產(chǎn)生一部分對重金屬有抗性的微生物，從而使土壤微生物群落多樣性增加[20]。有文獻報道放線菌是PAHs和重金屬Pb、Cu和Zn污染土壤中的優(yōu)勢菌群[21]。本文在門、綱和目的分類單元下，放線菌均為優(yōu)勢菌群，其在WHIGH處理的相對豐度高于WLOW和WCK處理，該結果與前人研究結論一致。本文WHIGH處理的β－變形菌綱（Betaproteobacteria）和藍藻菌綱（Cytophagia）相對豐度均高于WLOW和WCK處理。變形菌門（Proteobacteria）是重金屬污染土壤中的優(yōu)勢細菌，可能與其降解代謝及生境廣泛有關[15，22－23]，藍藻菌綱（Cytophagia）通常用于處理重金屬污染的水體，其可在細胞壁外分泌胞外多糖，從而螯合污染物中的重金屬離子[24－25]。WHIGH比WLOW和WCK處理中含有更多的抗性菌，這也可能是WHIGH處理多樣性豐富的原因之一。本文抗性菌群的解毒機制有待于今后深入研究。

3.2 細菌群落結構與土壤性質之間的關系

RDA結果顯示，有效態(tài)鉛和總鉛含量與WHIGH處理的細菌OTU水平群落組成具有較強的正相關性，與WCK和WLOW處理的細菌OTU水平群落組呈負相關，此結果進一步印證了WHIGH處理含有較多的抗逆菌群。WCK處理的細菌OTU水平群落組成與有機質正相關，有機質可改變土壤孔隙度、通氣度與土壤團粒，具有顯著的緩沖作用和持水力，可為土壤細菌提供適宜的生長環(huán)境[26]。Spearman分析結果顯示，土壤pH值、含水量、重金屬含量及速效磷、有效鉀均與相應的微生物類群有相關性。土壤pH值和含水量主要影響土壤理化反應，從而影響微生物的微生態(tài)生存環(huán)境，微生物的生長代謝產(chǎn)生一定的化學物質反過來又影響了土壤中化學物質的存在形態(tài)和濃度[27－28]。

外源鉛進入土壤后受各種物理、化學作用的影響，總體上是由不穩(wěn)定態(tài)向穩(wěn)定態(tài)轉變，活性和毒性呈降低趨勢[29]。與嚴重重金屬污染土壤，如礦區(qū)土壤相比，本試驗所添加的重金屬含量屬于中低等水平，且添加鉛已長達3年，雖然3個處理間的鉛用量有差異，但并未引起土壤中的細菌群落組成發(fā)生顯著的劑量效應，此結論與夏月等[20]結論較一致。本文細菌群落組成未發(fā)生顯著的劑量效應，可能是由于地上部分有作物種植，依據(jù)本實驗室前期的研究結果，地上部分種植的作物對土壤中的重金屬有不同程度的吸收作用[30]；還有可能是因為在重金屬影響下，根際環(huán)境中的pH值、Eh值、根系分泌物也發(fā)生了變化，根分泌的粘膠物質與根際中的Pb2+、Cu2+、Cd2+等重金屬離子絡合，形成穩(wěn)定的螯合體，將污染物固定在土壤中，進而影響到重金屬在土壤－植物－微生物中的遷移轉化行為[7，31]，使重金屬生物可利用毒性降低，從而對土壤微生物群落多樣性的影響減小，但具體機制還有待于今后更加深入地研究。本文3個處理間的土壤細菌群落組成有差異，重金屬鉛應該是造成這個差異的主要因素，土壤環(huán)境因素對細菌菌群的改變也產(chǎn)生了一定程度的影響。由于本文添加外源鉛濃度較低且經(jīng)過了較長的周期，土壤微生物可通過改變其群落組成來修復自然界中較低濃度的重金屬污染，為今后深入研究微生物修復提供了理論依據(jù)。

4 結論

（1）對照和低鉛處理的OTU組成較相似，而高鉛處理的OTU與前二者差異較大。變形菌門（Proteobacteria，25%）和放線菌門（Actinobacteria，18.60%）在3個處理中均為優(yōu)勢菌群，相對豐度較高的菌群還有酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）和浮霉菌門（Planctomycetes）；放線菌綱（Actinobacteria）、β－變形菌綱（Betaproteobacteria）和藍藻菌綱（Cytophagia）在高鉛處理中相對豐度最高。

（2）在屬分類水平上具顯著差異的菌群有9個（P＜0.05），除假單胞菌屬（Pseudomonas）和紅弧菌屬（Skemanella）外（相對豐度＞0.6%），Balneimonas、壤霉菌屬（Agromyces）、水棲菌屬（Enhydrobacter）、Devosia、貪噬菌屬（Variovorax）、Flavihumibacter和 Lacibacter均為低豐度菌群（相對豐度＜0.3%）。

（3）土壤有效鉛和總鉛含量與高鉛處理的細菌OTU水平群落組呈正相關，而與對照和低鉛處理的細菌OTU水平群落組呈負相關；對照的細菌OTU水平群落組成與土壤有機質含量正相關。在門分類水平上，厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、綠彎菌門（Chloroflexi）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）與土壤環(huán)境因素顯著相關（P＜0.05）。

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