肝豆扶木湯對(duì)TX小鼠肝纖維化TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響

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肝豆?fàn)詈俗冃?hepatolenticular degeneration，HLD)，即Wilson病(Wilson disease，WD)，是一種以進(jìn)行性銅代謝障礙為特征的常染色體隱性遺傳疾病，臨床表現(xiàn)為錐體外系癥狀、角膜色素環(huán)、肝硬化及腎功能損害等[1]。由于銅離子在體內(nèi)沉積的速度、部位和程度不同，臨床表現(xiàn)具有多樣性，但無(wú)論是腦型、肝型還是其他類型，肝纖維化幾乎是每一個(gè)WD病人肝臟的主要病理改變[2]。肝纖維化是發(fā)展成肝硬化的必經(jīng)階段，肝硬化以及在其基礎(chǔ)上的合并癥是WD病人死亡的最主要原因，抗纖維化治療可以阻止乃至逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)展[3-4]。

研究表明，目前臨床所用西藥對(duì)WD所致的肝纖維化多無(wú)逆轉(zhuǎn)作用，且常用的金屬絡(luò)合劑如青霉胺等長(zhǎng)期應(yīng)用后安全性差，不良反應(yīng)多。而傳統(tǒng)中藥治療WD療效顯著，不良反應(yīng)小，安全性高。肝豆扶木湯(gandoufumutang，GDFMT)是我科治療WD肝纖維化的效方，臨床療效顯著[5]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是促進(jìn)肝纖維化發(fā)展重要的細(xì)胞因子之一[6-7]。本研究采用肝豆扶木湯治療WD肝纖維化動(dòng)物模型——TX小鼠，觀察其肝纖維化血清指標(biāo)及肝組織TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白的表達(dá)，探討肝豆扶木湯治療WD肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物 TX小鼠種鼠從美國(guó) Jackson 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心引進(jìn)，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，SPF級(jí)，并進(jìn)行傳代繁殖。以基因檢測(cè)結(jié)果選取子代雄性TX小鼠24只，正常對(duì)照組DL小鼠8只。

肝豆扶木湯(由何首烏、三七、郁金、白芍、枸杞、土茯苓、柴胡等中藥組成)，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，每劑生藥重156 g；青霉胺，規(guī)格每片0.125 g，購(gòu)于上海醫(yī)藥集團(tuán)有限公司信誼制藥總廠，批號(hào)：H31022286。

1.2 主要儀器與試劑 透明質(zhì)酸(HA，南京森貝生物)，層粘連蛋白(LN，上海酶聯(lián)生物)，Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ，伊萊特生物)，Ⅳ型膠原(C-Ⅳ，上海古朵生物)，TGF-β1和Smad7(北京博奧森生物)，Smad2(美國(guó)Bioworld)，JW3021HR型離心機(jī)(安徽嘉文)，ZT-12M型自動(dòng)脫水機(jī)(湖北孝感亞光)，YB-7B型石蠟包埋機(jī)(湖北孝感亞光)，RM2135型切片機(jī)(德國(guó)Leica)，科力飛QP-B型切片漂烘儀(合肥電子科學(xué)研究所)，HEAL FORCE NW 10UF型純水儀(香港力康生物)，88-1型攪拌器(常州國(guó)華)，JD801型生物顯微攝像系統(tǒng)(江蘇省捷達(dá))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組 24只TX小鼠隨機(jī)分為模型組、青霉胺組、GDFMT組，每組8只，正常對(duì)照組DL小鼠8只。

1.3.2 給藥方法 青霉胺組研成粉劑，用蒸餾水配成混懸液按0.1 g/kg (按70 kg體重成人日用量的9倍計(jì)算)灌胃；GDFMT組按20.1 g/kg(按70 kg體重成人日用量的9倍計(jì)算)灌胃，正常對(duì)照組和模型組均用等量生理鹽水灌胃，每組每天灌胃1次，連續(xù)28 d。

1.3.3 標(biāo)本采集 灌胃4周結(jié)束后用3.3%的水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉處死小鼠，腹主動(dòng)脈取血，離心提取血清，剪取肝臟，制備石蠟切片，組織切片厚度4 μm ，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，一抗4 ℃孵育，聚合物增強(qiáng)劑室溫孵育15 min～20 min，辣根酶標(biāo)記聚合物室溫孵育15 min～20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片，鏡下觀察。

1.3.4 肝纖維化血清學(xué)指標(biāo) 按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性放免分析法檢測(cè)血清HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量。

1.3.5 肝組織TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白的表達(dá) 采用免疫組化法檢測(cè)肝組織TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 GDFMT對(duì)小鼠血清肝纖維化指標(biāo)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組血清肝纖維化HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，青霉胺組和GDFMT組血清肝纖維化HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量均降低(P<0.05或P<0.01)；與青霉胺組比較，GDFMT組血清肝纖維化HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量均降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

2.2 GDFMT對(duì)小鼠肝組織TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組TGF-β1和Smad2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，Smad7蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，青霉胺組和GDFMT組TGF-β1和Smad2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，Smad7蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與青霉胺組比較，GDFMT組TGF-β1和Smad2蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，Smad7蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表2，圖1～圖3。

組別nTGF?β1 Smad2 Smad7正常對(duì)照組80．40±0．030．44±0．011．13±0．05模型組81．17±0．071)1．24±0．101)0．42±0．061)GDFMT組80．68±0．022)3)0．74±0．052)3)0．84±0．032)3)青霉胺組80．76±0．012)0．81±0．042)0．72±0．042) 與正常對(duì)照組比較，1)P<0．01；與模型組比較，2)P<0．01；與青霉胺組比較，3)P<0．05。

注：A代表正常對(duì)照組；B代表模型組；C代表GDFMT組；D代表青霉胺組。

注：A代表正常對(duì)照組；B代表模型組；C代表GDFMT組；D代表青霉胺組。

注：A代表正常對(duì)照組；B代表模型組；C代表GDFM組；D代表青霉胺組。

3 討 論

WD是常染色體隱性遺傳的單基因疾病，主要導(dǎo)致銅代謝障礙，促使體內(nèi)銅離子沉積，影響肝、大腦、腎等臟器結(jié)構(gòu)及功能，肝臟是銅代謝的樞紐器官，銅離子沉積常導(dǎo)致肝纖維化，甚至肝硬化等[1]。中醫(yī)無(wú)肝豆?fàn)詈俗冃砸辉~，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，多歸屬“肝風(fēng)”“積聚”“癥瘕”等病證范疇。先前臨床研究表明，WD肝纖維化多是由于肝腎虧虛、痰瘀互結(jié)所致，采用補(bǔ)益肝腎、袪痰化瘀法，創(chuàng)制GDFMT，正是針對(duì)WD肝纖維化肝腎虧虛，痰瘀互結(jié)病機(jī)而設(shè)的組方。本方由何首烏、枸杞、土茯苓、白芍、三七、郁金及柴胡等藥組成。其中何首烏、枸杞補(bǔ)益肝腎、扶正固本；三七、郁金、土茯苓活血化瘀、解毒除濕；白芍、柴胡柔肝斂陰、調(diào)達(dá)肝氣，諸藥合用，共奏補(bǔ)益肝腎、豁痰化瘀之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，何首烏中所含的二苯乙烯苷對(duì)肝臟具有保護(hù)作用[8]。枸杞多糖可以通過(guò)阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及解毒，有助于損傷肝細(xì)胞的恢復(fù)及再生[9]。三七總皂苷能抑制肝臟膠原纖維合成與沉積，具有抗肝纖維化作用[10]。柴胡皂苷是柴胡屬植物中主要的有效成分，具有保肝作用，與傳統(tǒng)中醫(yī)記載的柴胡疏肝解郁功效一致[11]。郁金揮發(fā)油可以改善肝功能，促進(jìn)肝細(xì)胞再生[12]。白芍總苷為白芍的有效部位，具有抗急性肝損傷、非酒精性脂肪肝、慢性肝纖維化及抗肝癌等多種作用[13]。WD纖維化是由于銅離子沉積導(dǎo)致的慢性肝損傷后的一種損傷修復(fù)反應(yīng)，其本質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成與降解失衡[14-15]。WD是一種遺傳性銅代謝障礙疾病，銅離子在肝臟內(nèi)沉積，通過(guò)氧化應(yīng)激作用刺激肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)增殖[16]，HSC是肝纖維化發(fā)展中的一個(gè)重要事件，因?yàn)樗荅CM產(chǎn)生的主要細(xì)胞來(lái)源[17]。

TGF-β1是促進(jìn)肝纖維化發(fā)展的關(guān)鍵因子，它可以激活HSC并促進(jìn)其表達(dá)ECM。Smad蛋白是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中重要的胞內(nèi)信號(hào)分子。Smad蛋白有8種，根據(jù)功能不同分為3類：受體調(diào)節(jié)型Smad (R-Smad)，有Smad1，2，3，5，8；通用型Smad(Co-Smad)，有Smad4；抑制型Smad(I-Smad)，有Smad6，7[18]。TGF-β1與HSC膜表面的Ⅰ型、Ⅱ型受體結(jié)合后磷酸化激活Smad2，3，活化的Smad2，3與胞質(zhì)中的Smad4結(jié)合形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，在核內(nèi)調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄[19]。磷酸化的Smad2，Smad3誘導(dǎo)Tβ1R/Smad復(fù)合物形成，促使HSC活化為成纖維細(xì)胞(myofibroblaster，MFB)，激活的HSC通過(guò)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)及其抑制物(inhibitors of metalloproteinases，IMP)，抑制ECM降解，誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生[20-21]。Smad7是負(fù)性調(diào)控因子，它可以抑制HSC的轉(zhuǎn)化和ECM的合成與分泌[22]?；赥GF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化發(fā)展過(guò)程中的重要意義，用藥物干預(yù)該信號(hào)通路可以為防治肝纖維化提供新的方法[23]。

TX小鼠是由同系繁殖到F68的DL小鼠所產(chǎn)生的自然突變品系，其致病基因與WD致病基因——ATP7B基因的同源性達(dá)82%，能較好地模擬WD臨床征象，是理想的WD模型動(dòng)物。本研究采用TX小鼠作為研究對(duì)象，通過(guò)肝纖維化TGF-β1/Smad信號(hào)通路來(lái)觀察中藥GDFMT對(duì)其的影響，結(jié)果表明，GDFMT能有效地降低TX小鼠肝纖維化血清指標(biāo)從而發(fā)揮抗纖維化的作用，其作用機(jī)制可能是GDFMT抑制TGF-β1和Smad2蛋白的表達(dá)，上調(diào)Smad7蛋白的表達(dá)。表明GDFMT可以通過(guò)TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

[1] 孫忠人，楊文明. 神經(jīng)病學(xué) [M]. 第2版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2016：110-116.

[2] 孫艷玲，趙景民，李文淑，等. 兒童Wilson病的臨床病理特征及其肝纖維化機(jī)制探討[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2005，30(4)：300-302.

[3] Trautwein C，F(xiàn)riedman SL，Schuppan D，et al. Hepatic fibrosis：concept to treatment[J]. Journal of Hepatology，2015，62(1 Suppl)：S15-S24.

[4] 吳蘭婷，劉文蘭. 肝纖維化逆轉(zhuǎn)機(jī)制的研究進(jìn)展及治療概況[J]. 世界華人消化雜志，2017，25(23)：2123-2132.

[5] 楊文明，方芳，汪美霞，等. 肝豆扶木湯治療Wilson病肝纖維化的臨床研究[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志，2014，26(11)：1111-1113.

[6] 李頂春，李武. TGF-β/Smad、MAPK/ERK、NF-κB信號(hào)通路對(duì)肝纖維化的影響[J]. 現(xiàn)代免疫學(xué)，2017，37(5)：427-432.

[7] 譚淑萍，吳曉東. 肝纖維化與TGF-β和以其為靶位點(diǎn)的治療策略[J]. 世界華人消化雜志，2006，14(32)：3126-3130.

[8] 羅瑞芝，賈偉，趙利斌，等. 何首烏研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2005，36(7)：1097-1100.

[9 ] 張敏，張新華. 枸杞子抗衰老保肝等實(shí)驗(yàn)研究綜述[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2000，11(4)：373-375.

[10] 甘雨，徐惠波，孫曉波. 三七總皂苷的藥理作用研究進(jìn)展[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18(5)：1251-1252.

[11] 盧偉，楊光義，杜士明，等. 竹葉柴胡化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，35(2)：164-168.

[12] 尹國(guó)平，張清哲，安月偉，等. 溫郁金化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志，2012，37(22)：3354-3360.

[13] 左志燕，詹淑玉，黃嬛，等. 白芍總苷保肝作用的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志，2017，42(20)：3860-3865.

[14] Wells RG. Cellular sources of extracellular matrix in hepatic fibrosis[J]. Clinics in Liver Disease，2008，12(4)：759-768.

[15] Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis，an integrated cellular response to tissue injury[J]. The Journal of Biological Chemistry，2000，275(4)：2247-2250.

[16] Xu SQ，Zhu HY，Lin JG，et al. Copper ions stimulate the proliferation of hepatic stellate cells via oxygen stress in vitro[J]. Journal of Huazhong University of Science and Technology，2013，33(1)：75-80.

[17] Hernandez-Gea V，F(xiàn)riedman SL. Pathogenesis of liver fibrosis[J]. Annual Review of Pathology，2011，6：425-656.

[18] Moustakas A，Heldin CH. The regulation of TGF-beta signal transduction[J]. Development，2009，136(22)：3699-3714.

[19] Shi Y，Massague J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus[J]. Cell，2003，113(6)：685-700.

[20] Pinzani M. Novel insights into the biology and physiology of the Ito cell[J]. Pharmacology & Therapeutics，1995，66(2)：387-412.

[21] Gressner AM，Weiskirchen R，Breitkopf K，et al. Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis[J]. Frontiers in Bioscience A Journal and Virtual Library，2002，7：d793-d807.

[22] Zhu HJ，Iaria J，Sizeland AM. Smad7 differentially regulates transforming growth factor beta-mediated signaling pathways[J]. The Journal of Biological Chemistry，1999，274(45)：32258-32264.

[23] Liu X，Hu H，Yin JQ. Therapeutic strategies against TGF-beta signaling pathway in hepatic fibrosis[J]. Liver Inter，2006，26(1)：8-22.