不同亞型胃食管反流病食管黏膜下層炎癥因子變化特點研究

吾布力卡斯木·吾拉木 巴突爾·艾克木 買買提·依斯熱依力 劉曉勇克力木·阿不都熱依木，3

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）依據(jù)內鏡表現(xiàn)可分為3種類型：非糜爛性反流?。╪onerosive reflux disease，NERD）、糜爛性食管炎（erosive esophagitis，EE）和Barrett食管（Barrett esophagus，BE）［1-3］。最新研究［4］證實人類GERD的發(fā)生并不是反流物直接“酸蝕”的結果，而是率先從細胞因子介導的T淋巴細胞組織浸潤開始，進而發(fā)展引起食管黏膜細胞間隙增寬、毛細血管擴張以及食管基底細胞乳突狀增生等組織學變化。目前T淋巴細胞的遷移及其對GERD進展的具體機制尚不明確。有報道指出，Th2細胞（type 2 T helper cells）通過細胞因子途徑對BE的發(fā)展具有重要作用［5-6］，BE組織中Th2細胞因子表達升高可激活特定的信號轉導通路，進而引起抗凋亡基因的表達導致凋亡的抑制［7］。本研究擬從Th2相關細胞因子IL-4、IL-6入手，探索GERD（NERD、RE、BE）中代表性的細胞因子并評價其黏膜中病理組織學變化特點。

資料與方法

一、對象

選自2016年12月至2017年12月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院住院患者69例，經(jīng)Gerd Q相關癥狀量表評分［8］、食管24 h pH監(jiān)測評估是否符合胃食管反流?。捌鋪喰停┰\斷標準，并結合纖維胃鏡檢查結果將其進行以下分組：BE組、EE組、NERD組及對照組。其中對照組選取Gerd Q相關癥狀評分表評分＜6分，因胃食管黏膜異位癥、食管靜脈瘤等其他消化道疾病行內鏡檢查，而內鏡及免疫學診斷無食管黏膜炎癥損害的患者。納入標準：（1）年齡18～70歲；（2）胃鏡檢查未發(fā)現(xiàn)食管、胃占位性病變（對照組除外）。排除標準：（1）食管鱗狀上皮癌、食管腺癌等上消化道惡性病變；（2）有上消化道手術或開胸手術史者；（3）檢查前1個月內有促胃動力藥物、質子泵抑制劑或H2受體拮抗劑等藥物服用史者；（4）懷孕或哺乳期婦女。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

二、方法

1.儀器：石蠟切片機，德國Leitz公司；TC-120智能程控生物組織自動脫水機，湖北泰維科技實業(yè)有限公司；TB-718E型組織包埋機，湖北泰維科技實業(yè)有限公司；光學顯微鏡（Eclipse E200），日本尼康公司；-20℃/4℃低溫冰箱（青島海爾公司）；酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；無水乙醇，天津市致遠化學試劑有限公司；二甲苯，天津市致遠化學試劑有限公司；包埋石蠟，上海懿洋儀器有限公司；蘇木素，北京中杉金橋生物技術有限公司；伊紅，北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗人IL-4、IL-6抗體，美國Abcam公司；免疫組化試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

2.方法：食管組織標本均取自新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院消化內鏡中心，于纖維胃鏡下夾取食管齒狀線以上3 cm處（BE及EE組選取病變明顯部位）組織，置于4%中性甲醛液中固定，用于后期包埋蠟塊，行HE與免疫組化染色使用。

三、觀測指標和評價標準

選擇BE、EE、NERD 3種不同亞型胃食管反流病患者作為研究對象，無反流相關疾病者為對照組，通過食管24 h pH監(jiān)測比較其食管反流特點；對組織標本進行HE染色后根據(jù)食管組織炎癥評價方法［9］進行評分；免疫組化法檢測研究對象食管黏膜中IL-4與IL-6的表達后進行陽性率統(tǒng)計，陽性評分標準：IL-4、IL-6表達于細胞核或（和）細胞漿，著色棕黃色為陽性。根據(jù)陽性細胞數(shù)占腫瘤細胞的比例進行歸類：陽性細胞數(shù)＜5%為（-），5%～25%為（＋），＞25%～50%為（＋＋），＞50%為 （＋＋＋）［10］，結果中 （＋）、（＋＋）、（＋＋＋）的總和稱陽性。

四、統(tǒng)計學分析

運用SPSS 23.0軟件對樣本數(shù)據(jù)進行處理分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多組件比較采用方差分析檢驗比較組間差異；非正態(tài)分布計量資料以M（P25，P75）描述，使用秩和檢驗比較組間差異；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、患者基本情況

根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、Gerd Q評分及內鏡檢查等結果，將其分為3亞組和1對照組：BE組21例，其中男性13例，女性8例，平均年齡（45.72±13.55）歲；EE組25例，其中男性14例，女性11例，平均年齡（52.73±10.4）歲；NERD組13例，其中男性6例，女性7例，平均年齡（49.20±14.76）歲；對照組10例，其中男性14例，女性11例，平均年齡（53.50±9.86）歲。性別分布方面BE組與EE組男性占比略高于其余2組；4組患者一般指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

二、DeMeester評分及食管反流事件分析

食管24 h pH監(jiān)測中DeMeester評分3組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；NERD組pH≤4（酸反流）次數(shù)較其余2組低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；盡管BE組在4＜pH＜7（弱酸反流）總次數(shù)、反流事件總次數(shù)的比較中略高于EE組和NERD組，但3組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表3）。

三、組織學特點

GERD患者食管黏膜上皮有不同程度增厚，棘層上皮細胞數(shù)量增加，上皮及黏膜固有層可見炎癥細胞不同程度增加，以EE和BE組尤為明顯。對照組食管黏膜上皮完整，細胞排列規(guī)則整齊，未見炎細胞浸潤；EE組上皮細胞可見水腫，上皮細胞間隙增寬，乳突延長，此特點在部分NERD患者中同樣存在但并不顯著；BE組上皮破壞明顯，水腫及基底層增生顯著，組織內浸潤的細胞有T淋巴細胞、中性粒細胞和一些嗜酸性粒細胞。4組黏膜組織病理學評分BE組與EE組與其余2組相比均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），BE組評分與EE組之間亦有顯著差異（P＜0.05），NERD組與對照組間差異不明顯（圖1）。

四、IL-4、IL-6的表達

采用光鏡觀察及免疫組織化學技術分別檢測4組食管標本中的IL-4表達情況發(fā)現(xiàn)，IL-4在4組食管均有不同程度表達，其中對照組表達量最少，隨著炎癥加深IL-4呈現(xiàn)表達增高趨勢，但4組患者間IL-4陽性率的比較并無顯著差異（表2）。

IL-6在4組食管中的表達呈現(xiàn)差異，在NERD組和對照組表達量較低甚至不表達，炎癥加深使IL-6表達水平升高，在4組患者食管IL-6陽性率的比較中，EE組明顯高于對照組，但與NERD組間無顯著差異；BE組陽性率與對照組和NERD組之間皆有明顯差異（P均＜0.05），NERD組和對照組差異亦不明顯（表2）。

表1 不同亞型GERD患者食管酸暴露比較 [M(P25,P75)]

圖1 組織炎癥評分

表2 各組食管黏膜上皮組織中IL-4和IL-6表達的比較［例（%）］

討 論

學界關于非糜爛性反流病、糜爛性食管炎和Barrett食管的關系一直存在爭議，有觀點認為3者病理生理、臨床特征、自然預后等皆不同，因此互為獨立亞型而不會相互轉化［11-12］。然而大量研究也表明，它們可能是同一疾病譜（GERD）中程度遞增的病變［13-15］，Pace等［16］對33例監(jiān)測出酸反流過度的NERD患者隨訪5年后發(fā)現(xiàn)，94.4%（17/18）進展為了EE，而在10年后幾乎全部隨訪者發(fā)展為了EE甚至BE。

本研究針對3組不同GERD亞型患者的食管24 h pH監(jiān)測結果顯示，NERD組患者的pH＜4的酸反流次數(shù)與DeMeester評分較BE及EE組更低，且差異有統(tǒng)計學意義。盡管酸反流在GERD發(fā)病中的作用已受公認，但弱酸和非酸對GERD進展的影響尚無定論。研究表明，NERD患者pH監(jiān)測特點與GERD其他亞型相比，非酸反流現(xiàn)象明顯增加［17］，其反流物主要成分可能包括膽汁、胰腺分泌物等，與本實驗結果相符。

組織學評價方面，本實驗中各組GERD患者食管黏膜上皮均有不同程度增厚，炎細胞數(shù)目在BE組和EE組增加明顯，提示炎癥水平與內鏡下糜爛表現(xiàn)相關；盡管NERD患者內鏡檢查陰性，但在少量患者中仍發(fā)現(xiàn)上皮細胞間隙增寬，乳突延長、食管上皮水腫、棘層上皮細胞數(shù)量增加等特點，與先前研究報道［4］一致；Barrett食管黏膜上皮組織內浸潤的炎癥細胞包括T淋巴細胞、嗜中性粒細胞和一些嗜酸性粒細胞，類似于以往的食管炎報告［18］。

食管黏膜炎癥如同所有黏膜糜爛的特點一樣，主要以炎細胞（中性粒為主）浸潤為主［19］，然而炎細胞的組織浸潤究竟是食管炎發(fā)生的原因還是其結果目前尚無定論。2016年，Dunbar等［4］在對已治愈的GERD患者食管遠端正常組織進行活檢時發(fā)現(xiàn)，食管黏膜下層存在廣泛的T淋巴細胞浸潤，并伴有基底細胞的乳突狀增生。

近來研究發(fā)現(xiàn)Th2通過細胞因子途徑對GERD的發(fā)展具有重要作用［6］。本實驗采用免疫組化法探測3組GERD亞型及正常對照組食管標本中的IL-6水平后發(fā)現(xiàn)，其在對照組表達量極低甚至不表達，而炎癥程度加深會使IL-6表達水平升高；BE組陽性率與對照組和NERD組之間皆有明顯差異；NERD組IL-6表達較對照組略上升。

本研究中IL-4在4組食管均有不同程度表達，其中對照組表達量最少，隨著炎癥加深IL-4呈現(xiàn)表達增高趨勢；統(tǒng)計4組患者IL-4表達陽性率后發(fā)現(xiàn)，各組間并無顯著差異；血清IL-4水平BE組和EE組均明顯高于其余兩組，與之前研究［20］相符。Barrett食管中的上皮化生被認為是上皮細胞為應對慢性胃食管反流作出的適應性改變［21］，IL-4表達的升高（我們的結果）支持了這一理論即，作為抗炎性細胞因子，IL-4發(fā)揮了其細胞保護作用。

根據(jù)本次研究結果我們認為，從缺乏內鏡證據(jù)的NERD到炎癥表現(xiàn)明顯的糜爛性食管炎再到出現(xiàn)化生的Barrett食管，酸反流在這一進程中并未明顯加重；NERD患者的食管黏膜上皮已出現(xiàn)病理組織學變化，但與正常組織鑒別尚缺乏敏感性；但相比于IL-4，IL-6在不同亞型GERD食管黏膜組織中的差異更為明顯。本研究受臨床資源、研究周期等因素約束，未能收集足夠多的樣本納入研究，結論尚不具有代表性，今后尚需要通過增加動物實驗、細胞實驗等方法，尋找更多有力的佐證以盡早探明人類胃食管反流病的發(fā)病之謎。