基于響應(yīng)面優(yōu)化的褶牡蠣中金屬硫蛋白提取工藝研究

姚冬兒，楊慧琳，斯興開，張賓，孫繼鵬

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316022）（2.國(guó)家海洋局第三海洋研究所，福建廈門 361005）

金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）化學(xué)名為金屬硫組氨酸三甲基內(nèi)鹽，其是一類低分子質(zhì)量、高巰基含量、能結(jié)合金屬離子，且具有獨(dú)特功能的蛋白質(zhì)。MT富含半胱氨酸（20～30%）且不含組氨酸和芳香族氨基酸等，其廣泛存在于多種動(dòng)物、植物、微生物體內(nèi)，其在個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境適應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用[1]。機(jī)體內(nèi)MT可被重金屬離子、細(xì)胞毒性藥物、有機(jī)化學(xué)藥物、細(xì)胞因子、荷爾蒙激素及應(yīng)激刺激等多因素誘導(dǎo)而合成。研究表明，MT可表現(xiàn)出顯著的重金屬的解毒和調(diào)節(jié)[2]、參與細(xì)胞調(diào)節(jié)與免疫代謝[3]、防輻射[4]、清除生物體內(nèi)自由基[5]等多種生物活性，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、保健、生物工程和環(huán)境保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域。

近年來，MT的生物功能已被越來越多的學(xué)者們所認(rèn)識(shí)和開發(fā)，對(duì)其結(jié)構(gòu)、特性、基因調(diào)控及生物學(xué)功能的研究也日趨深入，但對(duì)其應(yīng)用與產(chǎn)品開發(fā)仍有諸多限制和不足[6]。純度較高的MT在市場(chǎng)上的價(jià)格仍舊居高不下，其主要原因在于未能找到一種合理高效的提純技術(shù)，且動(dòng)植物提純量少的缺點(diǎn)仍舊嚴(yán)重制約著MT的工業(yè)化發(fā)展[7]。目前，關(guān)于MT的提取及分離純化已有較多介紹，諸如加熱除雜蛋白、緩沖液勻漿離心法、凝膠過濾、離子交換及多種層析結(jié)合法等，然而其分離純化方法仍有待進(jìn)一步提高，仍存在如雜蛋白干擾嚴(yán)重、MT提取率不高等問題[8,9]。本研究以褶牡蠣中金屬硫蛋白（MT）為對(duì)象，通過 Cd2+誘導(dǎo)褶牡蠣體內(nèi)產(chǎn)生MT，優(yōu)化牡蠣體內(nèi)MT提取條件，以期獲得MT制備的最佳工藝，為天然高效的海洋源MT產(chǎn)品開發(fā)與應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

褶牡蠣（Crassostrea plicatul）購(gòu)自浙江省舟山市東河水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)，殼長(zhǎng)8.4～8.8 cm，殼高3.0～3.7 cm，體重 22～28 g。氯化鎘、三羥甲基氨基甲烷、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、硼酸及EDTA等試劑，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XHF-D型內(nèi)切式勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q型超純水儀，美國(guó)Millipore公司；DLSB-20/20型低溫冷卻液循環(huán)泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RC6 Plus型高速冷凍離心機(jī)，Thermo Scientific公司；DSHZ-300型恒溫振蕩器，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牡蠣體內(nèi)MT的誘導(dǎo)

選取生長(zhǎng)活力良好的褶牡蠣個(gè)體，進(jìn)行海水暫養(yǎng)馴化2 d，暫養(yǎng)期間不投喂餌料。將暫養(yǎng)牡蠣放入塑料養(yǎng)殖箱中，60只/箱，每只養(yǎng)殖箱注入含0.5 mg/L Cd2+的凈化海水 40 L（鹽度 27±1，pH 8.0±0.2，水溫18±1 ℃）；保持連續(xù)充氧，但不投喂餌料；每隔24 h更換含相同Cd2+濃度海水1次。采用Cd2+誘導(dǎo)10 d后，取出牡蠣個(gè)體，在0～4 ℃條件下，將牡蠣進(jìn)行解剖，獲得牡蠣肉置于-80 ℃條件下進(jìn)行貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 牡蠣MT提取優(yōu)化

1.3.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

（1）物料比對(duì) MT提取效果影響：取牡蠣組織約 5 g，置于 50 mL錐形瓶中，按牡蠣組織:緩沖液（g/mL）比例分別為1:2、1:3、1:4、1:6、1:8和1:10，加入0.25 mol/L、pH 8.5 Tris-HCl緩沖液，45 ℃恒溫水浴振蕩提取2 h后，將混合體系以10000 r/min離心20 min（4 ℃），收集上清液測(cè)定MT含量。

（2）提取溫度對(duì) MT提取效果影響：取牡蠣組織約5 g，置于50 mL錐形瓶中，按牡蠣組織:緩沖液（g/mL）比例為1:4，加入0.25 mol/L、pH 8.5 Tris-HCl緩沖液，分別于20、30、40、50、60和70 ℃條件下，45 ℃恒溫水浴振蕩提取2 h后，將混合體系以10000 r/min離心20 min（4 ℃），收集上清液測(cè)定MT含量。

（3）提取pH對(duì)MT提取效果影響：取牡蠣組織約 5 g，置于 50 mL錐形瓶中，按牡蠣組織:緩沖液（g/mL）比例為1:4，分別加入pH為3、4、5、6、7、8、9和10、0.25 mol/L Tris-HCl緩沖液，45 ℃恒溫水浴振蕩提取2 h后，將混合體系以10000 r/min離心20 min（4 ℃），收集上清液測(cè)定MT含量。

（4）提取液濃度對(duì) MT提取效果影響：取牡蠣組織約5 g，置于50 mL錐形瓶中，按牡蠣組織:緩沖液（g/mL）比例為1:4，加入pH 8.5、濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.20、0.30和0.50 mol/L Tris-HCl緩沖液，45 ℃恒溫水浴振蕩提取2 h后，將混合體系以10000 r/min離心20 min（4 ℃），收集上清液測(cè)定MT含量。

（5）提取時(shí)間對(duì) MT提取效果影響：取牡蠣組織約5 g，置于50 mL錐形瓶中，按牡蠣組織:緩沖液（g/mL）比例為1:4，加入0.25 mol/L、pH 8.5 Tris-HCl緩沖液，45 ℃恒溫水浴振蕩提取，提取時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 h后，將混合體系以10000 r/min離心20 min（4 ℃），收集上清液測(cè)定MT含量。

1.3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

在以上單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 7.0軟件中Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體選取物料比、提取溫度、緩沖液pH及濃度四個(gè)因素，進(jìn)行提取工藝優(yōu)化研究。

1.3.3 牡蠣MT含量測(cè)定

取 20 μL MT 上清液，加入 3 μL 20 %（m/V）TCEP溶液、10 μL 1 mg/mL SBD-F 溶液和 75 μL、pH 10.5反應(yīng)緩沖液（含1 mol/L硼酸、30 mmol/L EDTA和0.8 mol/L KOH），混勻后50 ℃水浴反應(yīng)30 min，加入10 μL、4 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。將混合體系采用20 mmol/L、pH 7.5定容緩沖液定容至1 mL，混合均勻溶液經(jīng)0.22 μm水系膜后進(jìn)行HPLC分析。色譜流動(dòng)相：乙腈:磷酸緩沖液（25 mmol/L，pH 7.5）:甲醇體系=18:80:2；色譜柱：ODS-BP（Sinochrom，4.6 mm×250 mm，5 μm）C18柱；進(jìn)樣量：40 μL；洗脫時(shí)間：20 min；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)510 nm；標(biāo)準(zhǔn)品：兔肝MT；MT保留時(shí)間：7.3～7.7 min。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用origin 8.0、SPSS及Design Expert 8.0進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素結(jié)果及分析

2.1.1 物料比對(duì)牡蠣MT提取效果的影響

圖1 物料比對(duì)牡蠣MT提取效果的影響Fig.1 Effects of material ratio on the extraction of MT from oyster

提取液采用緩沖液的主要作用是為促進(jìn)可溶蛋白溶出及為其提供相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境，防止其變性發(fā)生。研究表明，水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)MT分子量較小，采用與生理體液相容性較好、性質(zhì)溫度的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行浸提，可有效將MT從牡蠣組織提取出來[10]。由圖1結(jié)果可知，牡蠣組織與提取緩沖液的物料比在1:2～1:6范圍內(nèi)，提取MT含量隨緩沖液加入體積的增加而逐漸上升；當(dāng)物料比為1:6時(shí)，MT提取含量達(dá)到最大值為0.184 mg/g；繼續(xù)增加提取液的加入量，MT提取量趨于平緩，未出現(xiàn)顯著提高（p>0.05）。隨著緩沖液用量增大，其與已破碎的組織接觸更加充分，從而使得更多的MT釋放到液相中。但是，過多緩沖液的稀釋作用必然會(huì)降低提取液中的濃度，不便于測(cè)定和使用，同時(shí)還會(huì)造成提取成本的增加。因此，初步確定牡蠣組織與提取緩沖液的物料比為1:4～1:6。

2.1.2 提取溫度對(duì)牡蠣MT提取效果的影響

圖2 提取溫度對(duì)牡蠣MT提取效果的影響Fig.2 Effects of temperature on the extraction of MT from oyster

提取溫度是影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定的最重要因素，一般溫度越高，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性越低。MT由于其特殊的堅(jiān)固構(gòu)象，而具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，因此短時(shí)間的熱提取處理不會(huì)影響牡蠣MT的生物活性[11]。由圖2可知，提取溫度在20～70 ℃范圍內(nèi)，MT提取量呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取溫度較低時(shí)（20～30 ℃），MT提取效果較佳，30 ℃時(shí)MT提取量達(dá)最大值0.185 mg/g；當(dāng)超過30 ℃后，MT提取量有所降低，可能是因?yàn)檩^高溫使部分組織蛋白變性而影響MT提取量所致。勵(lì)建榮等[12]也認(rèn)為，采用較高溫度（75 ℃）除雜蛋白的方法制得MT粗制品，也存在一定弊端，其加熱時(shí)間不太明確，對(duì)提取MT純度及后續(xù)純化帶來不便。因此，初步確定提取溫度為30 ℃。

2.1.3 提取液pH對(duì)牡蠣MT提取效果的影響

圖3 提取液pH對(duì)牡蠣MT提取效果的影響Fig.3 Effects of pH on the extraction of MT from oyster

由圖3結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著提取液pH值的變化，MT提取量呈先增加后平緩再降低的趨勢(shì)；當(dāng)pH在3～9之間，MT提取量隨pH提高而逐漸增加；當(dāng)pH=9時(shí)，MT含量達(dá)到最高為0.174 mg/g；而當(dāng)pH>9時(shí)，MT提取量逐漸下降，故初步確定最佳提取液pH值為9。MT等電點(diǎn)在3.5～6.0范圍內(nèi)[13]，因此當(dāng)提取緩沖液pH在3～6時(shí)，MT溶解減少而發(fā)生聚集，因此所獲得的MT提取量較低；提取緩沖液pH在8～9時(shí)，偏離MT的等電點(diǎn)，致使獲得MT提取量顯著提高。

2.1.4 提取緩沖液濃度對(duì)牡蠣MT提取效果的影響

圖4 提取緩沖液濃度對(duì)牡蠣MT提取效果的影響Fig.4 Effects of buffer concentrations on the extraction of MT from oyster

提取緩沖液的離子強(qiáng)度，對(duì)MT提取量也具有重要影響。隨著提取液濃度的增高，溶液的離子強(qiáng)度隨之增大，而較高的離子強(qiáng)度可能會(huì)造成提取蛋白質(zhì)的沉淀發(fā)生[14]。由圖4結(jié)果可知，在提取緩沖液濃度為0.01～0.30 mol/L范圍內(nèi)，MT提取量逐漸上升，在0.30 mol/L時(shí)達(dá)最大值0.146 mg/g；在0.30～0.50 mol/L范圍內(nèi)，MT提取率呈平緩稍下降趨勢(shì)，因此初步確定最佳緩沖液濃度為0.30 mol/L。

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)MT提取效果的影響

圖5 提取時(shí)間對(duì)牡蠣MT提取效果的影響Fig.5 Effects of time on the extraction of MT from oyster

如圖5所示，提取時(shí)間對(duì)MT提取含量的影響相對(duì)較小，在0.5～6.0 h提取時(shí)間范圍內(nèi)，MT提取量變化呈平緩趨勢(shì)；在提取2.0 h時(shí)MT含量達(dá)到穩(wěn)定值0.214 mg/g，確定最佳提取時(shí)間為2 h。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)MT提取量具有顯著影響的4因素，即提取緩沖液pH、提取時(shí)間、物料比和提取緩沖液濃度，進(jìn)行4因素3水平Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以MT提取量為相應(yīng)值，進(jìn)行29組實(shí)驗(yàn)，包括24組析因?qū)嶒?yàn)及5組中心實(shí)驗(yàn)用以估計(jì)誤差，結(jié)果如表1所示。

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Experimental design and results of center combination

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2.2.2 MT提取量響應(yīng)面分析

利用Design Expert 7.0軟件，將表1中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元方程回歸擬合，建立MT提取量與各因素變量的二次多元回歸模型：

Y=0.23-0.012A-4.667E-003B-4.667-003C-0.014D-0.01AB+4.75E-003AC+4.25-003AD+2.5E-004BC-7.5E-003BD+8E-003CD-0.035A2-0.021B2-0.022C2-0.011D2

由表2方差分析可知，模型F=10.54，p<0.0001，說明響應(yīng)面回歸模型極其顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)殘差項(xiàng)各數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，失擬項(xiàng) F=5.39，Pr=0.0594>0.05，說明方程實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例小，擬合度較高。決定系數(shù)R2=0.9133，說明該模型能解釋91.33%響應(yīng)值變化，因而模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，適合于牡蠣MT提取量的分析和預(yù)測(cè)。

表2 提取含量二次多項(xiàng)模型方差分析表Table 2 The variance analysis table of quadratic polynomial model of extraction content

由回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，因素A和因素D的P值均小于0.05，說明緩沖液pH值和物料比對(duì)牡蠣MT提取量影響極其顯著。平方項(xiàng)A2、B2、C2、D2也均小于0.05，說明A2、B2、C2和D2對(duì)MT提取量均有顯著影響。由表3結(jié)果可知，信噪比Adeq Precision值較高（11.0160），說明該模型可預(yù)測(cè)。通過比較回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)可知，影響MT提取量的影響因素主次為D>A>B=C，即物料比>提取pH值>提取溫度=緩沖液濃度。

表3 變異系數(shù)Table 3 Coefficient of variation

2.2.3 交互因子效應(yīng)分析

圖6 提取液pH和溫度對(duì)MT提取量的影響Fig.6 Effects of pH and temperature on the extraction of MT from oyster

按照所得二元二次回歸方程對(duì)兩兩因素進(jìn)行運(yùn)算，獲得交互因子響應(yīng)面及等高線圖，結(jié)果如圖6～11所示。處理?xiàng)l件的改變對(duì)響應(yīng)值的影響，可通過響應(yīng)曲面的坡度陡峭或者平緩體現(xiàn)出來。等高線形狀可反映出交互作用強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用較強(qiáng)，圓形則表示兩因素交互作用較弱；等高線排列越密集，說明因素變化對(duì)MT提取量影響越大。在同一橢圓形區(qū)域內(nèi)，牡蠣MT提取量相同，在橢圓形中心點(diǎn)即為MT提取量的最高點(diǎn)，由中心向邊緣逐漸減少。由結(jié)果可知，所有曲面圖都呈良好的拋物線形狀，說明各因素的交互作用明顯，而各曲面圖均開口朝下，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果Y（MT提取量）在實(shí)驗(yàn)區(qū)域內(nèi)有最大值。

（1）提取液pH和溫度對(duì)MT提取量的影響

由圖6結(jié)果可知，隨著提取液pH值增加和提取溫度升高，MT提取量呈先上升后下降趨勢(shì)，表明適當(dāng)增大提取pH值及溫度，可一定程度的提高M(jìn)T提取量。在提取液pH值（A）與提取溫度（B）交互作用的等高線中，由于pH值等高線疏密程度比提取溫度等高線密度大，故提取液pH值對(duì)響應(yīng)值峰值的影響比提取溫度大。因此，當(dāng)提取液pH為8.5～9.0、提取溫度為28～32 ℃時(shí)，可獲最佳MT提取效果。

（2）提取液pH和緩沖液濃度對(duì)MT提取量的影響

圖7 提取液pH和緩沖液濃度對(duì)MT提取量的影響Fig.7 Effects of pH and buffer concentration on the extraction of MT

由圖7可知，隨著提取液pH值和緩沖液濃度增加，MT提取量也均呈先上升后下降趨勢(shì)。從構(gòu)成等高線可看出，沿A軸移動(dòng)過程中，其等高線比沿C軸的等高線密度更大，說明在pH值（A）和緩沖液濃度（C）的交互作用中，提取液pH值對(duì)MT提取效果影響較緩沖液濃度影響更大。因此，當(dāng)pH為8.5～9.0、緩沖液濃度為0.25～0.30 mol/L時(shí)，可獲最佳MT提取效果。

（3）提取液pH和物料比對(duì)MT提取量的影響

圖8 提取液pH和物料比對(duì)MT提取量的影響Fig.8 Effects of pH and material ratio on the extraction of MT

圖9 提取液溫度和緩沖液濃度對(duì)MT提取量的影響Fig.9 Effects of temperature and buffer concentration on the extraction of MT

由圖8可知，隨著提取液pH值和物料比的增加，MT提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；而隨物料比的增加或減小，MT提取量變化程度相對(duì)平緩。在 pH值（A）與物料比（D）交互作用的等高線中，由于pH值對(duì)等高線疏密程度影響比物料比的影響更大些，因此提取液pH值的影響作用較物料比大。當(dāng)pH為8.5～9.0、料物比為3.5～4.0時(shí)，能使MT提取效果最佳。

（4）提取溫度和緩沖液濃度對(duì) MT提取量的影響

由圖9可知，隨著提取溫度和緩沖液濃度增加，MT提取量呈先增加后減小趨勢(shì)。在提取溫度（B）與緩沖液濃度（C）交互作用等高線中，沿B軸等高線與沿C軸等高線密度差別不大，可知提取溫度與緩沖液濃度對(duì)響應(yīng)值峰值的影響相當(dāng)。當(dāng)提取溫度為28～32 ℃、緩沖液濃度為0.25～0.30 mol/L時(shí)，可獲最佳MT提取效果。

（5）提取溫度和物料比對(duì)MT提取量的影響

圖10 提取溫度和物料比對(duì)MT提取量的影響Fig.10 Effects of temperature and material ratio on the extraction of MT

由圖10可知，隨提取溫度和物料比的升高，MT提取量呈現(xiàn)先增加后減小趨勢(shì)；與圖8結(jié)果類似，隨物料比增加或減小，MT提取量變化程度相對(duì)平緩。在提取溫度（B）和物料比（D）交互作用中，溫度對(duì)等高線疏密程度影響明顯大于物料比，說明提取溫度影響作用較物料比大。當(dāng)提取溫度為28～32 ℃、料物比為3.5～4.0時(shí)，可獲最佳MT提取效果。

（6）緩沖液濃度和物料比對(duì)MT提取量的影響

圖11 緩沖液濃度和物料比對(duì)MT提取量的影響Fig.11 Effects of buffer concentration and material ratio on the extraction of MT

圖11曲面圖與等高線分布圖，和圖8結(jié)果大體相同，即提取緩沖液濃度的變化對(duì)響應(yīng)值的影響幅度明顯，即在提取緩沖液濃度（C）和物料比（D）交互作用中，緩沖液濃度的影響作用較物料比更大。當(dāng)緩沖液濃度為0.25～0.30 mol/L、料物比為3.5～4時(shí)，可獲最佳MT提取效果。

2.2.4 最佳提取工藝驗(yàn)證

利用Design-Expert 7.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定最優(yōu)提取條件為：提取液pH 9.0，提取溫度30 ℃，提取緩沖液濃度0.25 mol/L，物料比為1:4；考慮到實(shí)際操作便利，確定提取時(shí)間為2 h。在此條件下，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，MT提取量平均值為0.221 mg/g，模型對(duì)MT提取量的理論最優(yōu)值為0.239 mg/g，兩者之間差值為0.018 mg/g，誤差較小，兩者吻合性較好，說明模型可行。

3 結(jié)論

以牡蠣組織為原料，利用單因素實(shí)驗(yàn)、中心組合Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法，對(duì)牡蠣中MT的提取制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了最佳制備參數(shù)為：牡蠣組織與提取液間的比例為1:4，提取液pH 9.0，提取溫度30 ℃，緩沖液濃度0.25 mol/L，提取時(shí)間2 h。在此參數(shù)條件下，MT提取量為0.221 mg/g，該結(jié)果與建立模型的預(yù)測(cè)值基本相符。后續(xù)將對(duì)牡蠣MT進(jìn)一步的純化及應(yīng)用開展深入研究。

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