江蘇省雞肉產(chǎn)品中彎曲菌耐藥特征及Ⅰ型整合子分析

唐夢(mèng)君，周倩，張小燕，張靜，唐修君，陸俊賢，周生，黃勝海，楊星星，高玉時(shí)

（江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225125）

彎曲菌（Campylobacter）是全球范圍內(nèi)主要的人獸共患、細(xì)菌性腸道病原菌，導(dǎo)致人致病的彎曲菌中85%以上是空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni），其次是結(jié)腸彎曲菌（Campylobacter coli，C.coli）[1,2]，主要引起人的胃腸炎，臨床癥狀從水樣腹瀉到血便，同時(shí)伴有頭疼、腹痛、發(fā)熱，偶有嘔吐[3,4]。據(jù)美國(guó)國(guó)家食品網(wǎng)監(jiān)測(cè)，彎曲菌引起的人類腸道感染僅次于沙門(mén)氏菌，每年都有大量的發(fā)病率和死亡病例[5,6]。

由于彎曲菌能夠在家禽腸道內(nèi)大量定植，家禽感染后不表現(xiàn)出任何臨床癥狀，但可持續(xù)向外界排菌且終生帶菌[7]。在屠宰加工的過(guò)程中如果腸道破裂，很容易污染屠宰場(chǎng)地、設(shè)施和水，從而污染禽肉產(chǎn)品[8,9]。世界流行疾病研究指出彎曲菌主要由食品傳染，禽肉產(chǎn)品是主要的傳染源[10]。

近年來(lái)，抗生素在食品源動(dòng)物生產(chǎn)上的不合理使用，導(dǎo)致彎曲菌的耐藥性逐步增強(qiáng)，耐藥譜逐漸加寬。整合子作為介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性播撒的可轉(zhuǎn)移遺傳元件之一，能夠捕獲外源耐藥基因并將其水平傳播，從而使耐藥現(xiàn)象更加嚴(yán)重[11,12]。整合子結(jié)構(gòu)主要包括5’保守區(qū) (5’-conserved segment ， 5’-CS) 、 3’保 守 區(qū)(3’-conserved segment，3’-CS)以及中間的可變區(qū)(variable region，VR)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明，在革蘭氏陰性菌中整合子的存在與多重耐藥有密切的關(guān)系，彎曲菌也有報(bào)道檢測(cè)出Ⅰ型整合子[13]。由于食品源耐藥菌和耐藥基因可以通過(guò)食物鏈傳播給人類，因此，給人類健康和食品安全構(gòu)成潛在威脅。

本研究以江蘇省雞肉產(chǎn)品中分離的 95株彎曲菌為研究對(duì)象，對(duì)其耐藥表型、Ⅰ型整合酶基因（int1）、3’-CS及攜帶的基因盒進(jìn)行檢測(cè)，以便更好地了解彎曲菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播途徑，為控制耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生和傳播提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

2016年6月～2017年4月，從江蘇省揚(yáng)州、徐州、宿遷和鹽城等各市縣的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市采取雞肉樣共270份，分離鑒定出空腸彎曲菌（C. jejuni）70株，結(jié)腸彎曲菌（C. coli）25株，其彎曲菌分離鑒定方法見(jiàn)文獻(xiàn)[14,15]?？漳c彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（NCTC11168）、結(jié)腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC33559）由本室保存，大腸埃希氏菌ATCC25922由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基：Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基、CCDA培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基均購(gòu)自于英國(guó)OXOID公司；彎曲菌分離用抗生素三甲氧芐氨嘧啶、頭孢哌酮、多粘菌素 B、兩性霉素 B、利福平和放線菌酮等購(gòu)自WAKO公司；脫纖維綿羊血購(gòu)買(mǎi)于青島海博生物技術(shù)有限公司；厭氧罐購(gòu)自日本MGC公司；混合氣（5%O2、10%CO2和85%N2）購(gòu)于南京特種氣體廠有限公司；試劑：Ex Taq premix、DL2000 Marker均購(gòu)自大連寶生物；細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工；其它均為試驗(yàn)常規(guī)試劑。

表1 PCR檢測(cè)Ⅰ類整合子所用引物Table 1 Primers for amplification of class Ⅰ integron detected by PCR

1.1.3 藥敏紙片

共選擇9大類抗生素中的21種常規(guī)藥敏紙片，包括 β-內(nèi)酰胺類的氨芐西林（Ampicillin，AMP，10 μg）、阿莫西林(Amoxicillin，AML，10 μg)、第三代頭孢中的頭孢噻肟（Cefotaxime，CTX，30 μg）；碳青霉烯類亞胺培南（Imipenem，IPM，10 μg）和美羅培南（Meropenem，MEM，10 μg）；氨基糖苷類有鏈霉素（Streptomycin，S，10 μg）、慶大霉素(Gentamicin，CN，10 μg)、阿米卡星(Amikacin，AK，30 μg)、妥布霉素(Tobramycin，TOB，10 μg)和卡那霉素（Kanamycin，K，30 μg）；喹諾酮類有萘啶酸（Nalidixic acid，N，30 μg）、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP，5 μg)、氧氟沙星(Ofloxacin，LEV，5 μg)和恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR，5 μg）；大環(huán)內(nèi)酯類有紅霉素（Erythromycin，E，15 μg）和阿奇霉素(Azithromycin，AZM，15 μg)；四環(huán)素類有四環(huán)素(Tetracycline，TE，30 μg)；潔霉素類有克林霉素(Clindamycin，DA，2 μg)；酰胺醇類有氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)F，30 μg）和氯霉素（Chloramphenicol，C，30 μg）；多磷類有磷霉素（Fosfomycin，F(xiàn)OS，10 μg），以上藥敏紙片均購(gòu)買(mǎi)于英國(guó)OXOID公司。

1.1.4 PCR擴(kuò)增引物

Ⅰ型整合酶基因（int1）、3’-CS以及可變區(qū)擴(kuò)增引物，根據(jù)GenBank上登錄的基因序列（KC493654），利用Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 彎曲菌耐藥性表型檢測(cè)

采用WHO推薦使用的Kirby-Bauer法（紙片瓊脂擴(kuò)散法）檢測(cè)95株分離株對(duì)21種抗生素的敏感性。其操作步驟如下：用無(wú)菌棉簽從MH平板上刮取純化培養(yǎng)的細(xì)菌至500 μL PBS緩沖液中，將菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?100 μL稀釋后的菌液均勻涂布于MH平板，用無(wú)菌鑷子貼上藥敏紙片，于42 ℃微需氧培養(yǎng)36～48 h后取出，用直尺測(cè)定抑菌圈直徑（mm），結(jié)果判定參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI，2015）的標(biāo)準(zhǔn)，以抑菌圈直徑大小判斷耐藥（resistant）、中敏（intermediate）和敏感（susceptible）。數(shù)據(jù)采用Excel 2015整理分析。

1.2.2 細(xì)菌DNA模板的制備

將MH血平板純化培養(yǎng)的細(xì)菌用無(wú)菌棉簽刮下洗入PBS緩沖溶液，離心后去除上層液體，采用試劑盒提取基因組DNA。

1.2.3 Ⅰ型整合酶基因（int1）及3'-CS的檢測(cè)

采用25 μL PCR反應(yīng)體系：Ex Taq premix 12.5 μL，上下游引物（10 μM/L）各1 μL，無(wú)菌去離子水9.5 μL，模板 DNA 1 μL。

PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性30 s，根據(jù)不同引物選擇相應(yīng)的退火溫度，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳成像。選取PCR陽(yáng)性樣品送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST分析。

1.2.4 Ⅰ型整合子可變區(qū)的檢測(cè)

采用50 μL PCR反應(yīng)體系：SpeedSTAR HS DNA Polymerase (5 units/μL) 0.25 μL，上下游引物（10 μM/L）各 2 μL，10×Fast Buffer Ⅰ或Ⅱ 5 μL，模板 DNA 2 μL，無(wú)菌去離子水38.75 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳成像。對(duì)PCR擴(kuò)增陽(yáng)性片段參照TakaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0進(jìn)行純化，將純化產(chǎn)物3 μL、pMD20-T載體 1 μL、連接 Buffer 5 μL、T4 DNA Ligase 1 μL，混勻后于16 ℃反應(yīng)過(guò)夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中采用BLAST軟件進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 95株彎曲桿菌分離株耐藥表型測(cè)定結(jié)果

圖1 彎曲菌分離株對(duì)21種抗生素的多重耐藥譜Fig.1 Multi-drug resistance profiles of Campylobacter isolates to 21 antimicrobial agents

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，從雞肉產(chǎn)品中分離的彎曲菌普遍對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、氧氟沙星、卡那霉素、氨芐西林、四環(huán)素、萘啶酸、阿莫西林、恩諾沙星、鏈霉素、妥普霉素和克林霉素等有一定的耐藥性(表2)，特別是對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、卡那霉素、氨芐西林和氧氟沙星的耐藥率達(dá)到60%以上，但對(duì)磷霉素、氯霉素、美羅培南敏感。

其中，空腸彎曲菌對(duì)環(huán)丙沙星、氧氟沙星、頭孢噻肟、氨芐西林高度耐藥，其耐藥率達(dá)到70%以上。而結(jié)腸彎曲菌對(duì)頭孢噻肟、卡那霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星、妥布霉素高度耐藥，其耐藥率達(dá)70%以上。91株彎曲菌分離株至少耐4種以上抗生素，95.78%的分離株為多重耐藥菌株（耐3種以上抗生素），最嚴(yán)重可耐16種抗生素，大部分菌株耐7～11種抗生素（見(jiàn)圖1），分離菌株表現(xiàn)出耐藥譜型的多樣性，相同耐藥譜型較少。

表2 彎曲菌分離株對(duì)抗生素的耐藥性Table 2 Results of antimicrobial resistance testing of Campylobacter isolated from chicken meat

2.2 Ⅰ型整合子檢測(cè)

2.2.1 Ⅰ型整合酶基因（int1）及 3’端的檢測(cè)結(jié)果

圖2 部分菌株Ⅰ型整合酶基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 PCR amplification electrophoresis of class Ⅰ integrase gene in Campylobacter isolates

對(duì) 95株彎曲菌進(jìn)行 PCR擴(kuò)增Ⅰ型整合酶基因（int1），檢測(cè)到預(yù)期條帶大小為892 bp（見(jiàn)圖2）。將PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，與GenBank中收錄的參考序列相同（核酸序列一致性為100%），測(cè)序結(jié)果鑒定為Ⅰ型整合酶基因，共有45株彎曲菌含有Ⅰ型整合酶基因，其檢出率為47.0%，其中含有Ⅰ型整合酶基因的空腸彎曲桿菌有37株，結(jié)腸彎曲桿菌有8株。對(duì)95株彎曲菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增3’-CS端，其中有10株彎曲菌檢測(cè)出了預(yù)期條帶，大小為642 bp，測(cè)序結(jié)果鑒定為目的片段（見(jiàn)圖3）。

圖3 彎曲菌分離株Ⅰ型整合子3’-CS端PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of class Ⅰ integron 3’-CS region in Campylobacter isolates

2.2.2 Ⅰ型整合子可變區(qū)的檢測(cè)結(jié)果

圖4 彎曲菌分離株Ⅰ型整合子可變區(qū)擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification of class I integron gene cassette in Campylobacter isolates

進(jìn)一步對(duì)同時(shí)具有Ⅰ型整合酶基因和3’-CS端的10株彎曲菌進(jìn)行可變區(qū)基因盒擴(kuò)增，共有5株為基因盒陽(yáng)性菌株，電泳結(jié)果見(jiàn)圖4，基因盒大小約為1800 bp，與GenBank中GQ214171.1序列的核酸序列一致性為99%，為鏈霉素耐藥的基因盒aadA1，該5株菌藥敏結(jié)果顯示對(duì)鏈霉素均具有耐藥性。

彎曲菌是一種人畜共患病原菌，可引起動(dòng)物和人類發(fā)生多種疾病。常見(jiàn)癥狀為腹瀉性腸炎，通常為自限性無(wú)需抗生素治療。但對(duì)于病情嚴(yán)重、自身免疫力低下等情況，喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類常被作為臨床治療用藥[16,17]，氨基糖苷類及四環(huán)素類也可用做彎曲菌病的替代藥物。而在畜禽的生產(chǎn)過(guò)程中，抗生素的廣泛應(yīng)用促使了耐藥菌的產(chǎn)生，這些耐藥菌通過(guò)食物鏈傳遞給人類可導(dǎo)致治療失敗。

本研究中彎曲菌的多重耐藥率為95.78%，表明在江蘇地區(qū)雞源彎曲菌的多重耐藥已經(jīng)相當(dāng)普遍。在受測(cè)試的抗菌藥物中，分離株對(duì)環(huán)丙沙星具有較高的耐藥率（83.16%），其原因在于環(huán)丙沙星常用于預(yù)防和治療家禽腹瀉有關(guān)的疾病，導(dǎo)致了耐環(huán)丙沙星彎曲菌的產(chǎn)生。研究顯示不同國(guó)家彎曲菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥水平并不相同（8%～97.9%）[18,19]，發(fā)展中國(guó)家較為嚴(yán)重，而發(fā)達(dá)國(guó)家的耐藥率則較低。

在加拿大，Claudia Narvaez-Bravo等[20]對(duì)從雞肉產(chǎn)品中分離的彎曲菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，其彎曲菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為5.5%。韓國(guó)Lim SK等[21]對(duì)從雞胴體中分離的彎曲菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，彎曲菌對(duì)環(huán)丙沙星、萘啶酸都具有較高的耐藥水平。在本研究中，彎曲菌對(duì)氟苯尼考和磷霉素的耐藥率分別為 0.08%和0.011%，具有很高的敏感性，與國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道彎曲菌對(duì)氟苯尼考耐藥率普遍較低的結(jié)果一致[22,18]。Aguilar-Company J研究報(bào)道磷霉素可以有效治療耐大環(huán)內(nèi)脂類和氟喹諾酮類彎曲菌引起的腸道疾病[23]。

細(xì)菌耐藥基因的水平傳播（Horizontal gene transfer，HGT）使得耐藥基因在同種甚至不同種菌株間水平轉(zhuǎn)移，加速了多重耐藥菌株的產(chǎn)生。整合子能捕獲和整合細(xì)菌的耐藥基因，是細(xì)菌多重耐藥性形成和廣泛傳播的重要機(jī)制。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在多種耐藥細(xì)菌中均發(fā)現(xiàn)了整合子的存在[22,24,25]，包括彎曲菌。彎曲菌中Ⅰ型整合子的檢出率因地區(qū)差異而不同，O’Halloran F等在愛(ài)爾蘭分離到的彎曲菌中，具有完整整合子結(jié)構(gòu)的菌株檢出率為 16.4%（62/378）[13]，而Alessandra Piccirillo等從意大利家禽分離的彎曲菌中未檢出Ⅰ型和Ⅱ型整合子[26]。Ⅰ型整合子中把int1陽(yáng)性、可變區(qū)陽(yáng)性及3’-CS陽(yáng)性的稱之為典型Ⅰ型整合子，只有int1陽(yáng)性的稱之為非典型1類整合子。本研究對(duì)95株彎曲菌進(jìn)行Ⅰ型整合子的PCR檢測(cè)，典型Ⅰ型整合子檢測(cè)出10株，非典型Ⅰ型整合子35株。對(duì)典型Ⅰ型整合子的可變區(qū)進(jìn)行基因擴(kuò)增，有5株分離株擴(kuò)增出大小相同的條帶，測(cè)序鑒定為對(duì)氨基糖苷類耐藥的基因盒aadA1，該基因盒也存在于大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等細(xì)菌的整合子中[27,28]，說(shuō)明該基因盒可以在不同細(xì)菌間傳播，有可能通過(guò)食品源動(dòng)物傳遞給人類，造成耐藥性增加。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)顯示分離株呈現(xiàn)多重耐藥性，耐藥譜寬，而檢出的耐藥基因盒比較單一只有氨基糖苷類耐藥基因盒，說(shuō)明在江蘇地區(qū)Ⅰ型整合子存在于雞肉產(chǎn)品彎曲菌中，但并不是彎曲菌產(chǎn)生多重耐藥的主要因素，很有可能存在其他途徑造成耐藥，如攜帶耐藥基因的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子以及基因島等。

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