竹葉蘭內(nèi)生真菌的分離鑒定及其抗氧化活性研究

宋新月，湯冰雪，邱君志，劉美鳳

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002）（2.華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東廣州 510640）

植物內(nèi)生菌(endophytes)一詞最早是由De Bary在1886年首次提出，是指在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部、但不會(huì)引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯的感染癥狀，并與宿主植物協(xié)同進(jìn)化的一類具有豐富多樣性的微生物類群，包括內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌。自1993年Stierle等[1]首次報(bào)道了從太平洋紫杉樹中分離出一種可產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌后，關(guān)于植物內(nèi)生菌的分離與鑒定立即成為國內(nèi)外微生物研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。藥用植物內(nèi)生真菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，其活性次級(jí)代謝產(chǎn)物具有良好的開發(fā)利用價(jià)值[2]。已有學(xué)者從無花果葉中分離獲得1株具有抗菌活性的炭角菌屬Xylaria sp.內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)其次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的體外抑制活性[3]；從內(nèi)生真菌Preussia sp.的發(fā)酵液中獲得了具有抗腫瘤活性的次級(jí)代謝物產(chǎn)物Spiropreussione A[4]。某些藥用植物內(nèi)生真菌不僅具備合成宿主植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力，還能夠獨(dú)立產(chǎn)生豐富的、結(jié)構(gòu)新穎的次級(jí)代謝產(chǎn)物，例如抗生素等[5]，因此利用藥用植物內(nèi)生真菌替代稀有藥用植物來開發(fā)新藥具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值[6]。

自由基作為機(jī)體的正常代謝產(chǎn)物，在平衡狀態(tài)下，其在抗菌、消炎和抗腫瘤等方面具有重要作用；一旦平衡被打破，如機(jī)體被某些外源藥物侵害，自由基便會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)大的反作用，迫使組織細(xì)胞受損，進(jìn)而引起機(jī)體病變，甚至死亡[7]。目前，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)自由基與腫瘤、衰老、心腦血管疾病等多種人體疾病的發(fā)生密切相關(guān)[8]。已有研究證明，一些植物內(nèi)生菌具有良好的抗氧化活性[9,10]。因此，植物內(nèi)生菌的天然活性物質(zhì)將為尋找高效、廉價(jià)及低毒的新型抗氧化劑提供一種新思路。

竹葉蘭(Arundina graminifolia)為蘭科竹葉蘭屬植物，別名長桿蘭、草姜、文哈海（傣名），分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，用于治療尿路感染及毒蛇咬傷等，收載于《中藥大辭典》中。但由于其地域分布性強(qiáng)，并且產(chǎn)量有限，所以從其內(nèi)生菌中獲得具有良好生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物來代替稀有藥用植物竹葉蘭是一條便捷而有效的途徑。當(dāng)前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)竹葉蘭的研究主要集中在其化學(xué)成分[11,12]、藥理研究[13,14]以及人工栽培等方面[15,16]，有關(guān)竹葉蘭內(nèi)生菌的研究尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)采自云南西雙版納地區(qū)及廣西百色地區(qū)的竹葉蘭植物體的根、莖和葉片中的內(nèi)生菌進(jìn)行了分離和鑒定，同時(shí)探討了部分竹葉蘭內(nèi)生真菌的抗氧化活性，為后續(xù)進(jìn)一步研究竹葉蘭內(nèi)生菌及其生物活性成分提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮的竹葉蘭植株采集于中國云南省西雙版納地區(qū)以及廣西省百色市，均由云南藥物研究所邱斌教授對(duì)其種屬鑒定，憑證標(biāo)本（YN20170313及GX2170323）存入華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院制藥工程系。

1.2 培養(yǎng)基的配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：取新鮮馬鈴薯200 g，洗凈，去皮，切成小塊，放入適量的水中煮沸30 min，用8層紗布過濾后置于1000 mL燒杯中，向其中依次加入葡萄糖和瓊脂各20 g，加熱攪拌至瓊脂完全融化，補(bǔ)加蒸餾水至1000 mL。趁熱將其分裝于5個(gè)250 mL三角瓶中，每瓶裝200 mL培養(yǎng)基，用8層紗布包住瓶口，2層報(bào)紙封口并寫好標(biāo)簽，于121 ℃下高壓滅菌20 min后備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料竹葉蘭內(nèi)生菌分離純化及保存

將采集的竹葉蘭植株儲(chǔ)存于4 ℃環(huán)境中，且儲(chǔ)存時(shí)間最好不超過2周。選取新鮮且植株樣品完好的竹葉蘭，用無菌水洗滌除去其表面泥土。采用組織切塊培養(yǎng)法[17]，在無菌條件下，用無菌解剖刀將竹葉蘭的根和莖分別切成厚度為0.5 cm的切塊，將葉片切成面積為0.5 cm×0.5 cm大小的切片。把切好的材料先置于75%乙醇溶液中浸泡3 min，用無菌水沖洗3次后，置于0.1%升汞溶液中，將根和莖漂洗2 min，葉片漂洗1 min，然后用無菌水沖洗5次。用滅菌的濾紙片吸干竹葉蘭組織切塊表面的水分，將其消毒后的新鮮剖面與含氨芐青霉素（100 μg/mL）的PDA培養(yǎng)基平板相貼合，每個(gè)PDA培養(yǎng)基平板上放置3～4個(gè)竹葉蘭組織切塊，最后將其置于 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4～7 d。取最后一次清洗竹葉蘭組織切塊后的無菌水，用涂布棒涂布于含抗生素的 PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)4～7 d，觀察是否有其他雜菌長出，以此作為無菌操作參照組。

待竹葉蘭組織切塊或切片的切口處有菌落長出，根據(jù)菌落顏色、形態(tài)差異和長出菌落時(shí)間長短的不同，分別挑取各菌落邊緣形態(tài)各異的菌絲，接種于 PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化再培養(yǎng)。培養(yǎng)數(shù)日后，觀察并記錄菌落的生長形態(tài)。對(duì)得到的菌株進(jìn)行多次純化后編號(hào)，并轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d后，放入4 ℃冰箱中長期保存。

1.4 竹葉蘭內(nèi)生菌的形態(tài)學(xué)觀察

將已分離純化的內(nèi)生菌接種于 PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)7～10 d。采用插片法，在各菌株的培養(yǎng)平板上以斜 45 °角插入無菌蓋玻片 2～3枚，在28 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，取出蓋玻片，制成載片標(biāo)本，在倒置熒光顯微鏡下依次從低倍鏡向高倍鏡觀察，獲取各菌株在油鏡下（100×10倍）的顯微圖片。

1.5 竹葉蘭內(nèi)生菌DNA分子鑒定

從 PDA培養(yǎng)基平板上刮取已得到分離純化的內(nèi)生菌菌株的菌絲體，加入DNA提取裂解液300 μL，渦旋振蕩后，在65 ℃下水浴30 min，再加入等體積的氯仿:異戊醇（24:1），渦旋混勻，13000 r/min離心5 min。取上清液，加入等體積的異丙醇，混勻后，13000 r/min離心5 min。棄上清液，加入70%乙醇混勻，13000 r/min離心1 min。棄乙醇，倒置離心管，晾干。之后加入30 μL ddH2O，溶解DNA，即可進(jìn)行下游PCR擴(kuò)增或者在-20 ℃下保存。

提取內(nèi)生菌基因組 DNA后，用通用引物ITS4/ITS5來擴(kuò)增18S rRNA基因片段，PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10 倍緩沖液 5 μL，dNTPs 5 μL，正反引物各1 μL，Taq酶1 μL，模板DNA 稀釋50倍后取1 μL（對(duì)照組加ddH2O），ddH2O 36 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃變性 3 min；94 ℃變性 40 s，58 ℃退火 40 s，72 ℃延伸90 s，如此處理35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化回收，加入去離子水溶解后送到廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.6 部分竹葉蘭內(nèi)生菌抗氧化活性測試

1.6.1 竹葉蘭內(nèi)生菌發(fā)酵液提取物對(duì)DPPH自由基的清除活性

對(duì)竹葉蘭內(nèi)生菌 YNLF-1、BSSF-2、BSRF-1、BSRF-2及BSRF-3的發(fā)酵液提取物進(jìn)行抗氧化活性的測定。以上內(nèi)生菌的發(fā)酵液均用乙酸乙酯萃取3次后蒸發(fā)旋干得發(fā)酵浸膏[18]，再將各樣品用無水乙醇溶解，分別配制成0.0125 mg/mL、0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL和0.2 mg/mL的待測樣品液。

DPPH自由基清除能力測定參照Atoui[19]方法，并略作改動(dòng)。（1）精確移取2 mL 0.2 mmol/mL DPPH（DPPH溶液要現(xiàn)用現(xiàn)配，注意避光保存）與 2 mL供試液混合，室溫下放置30 min，于517 nm處測吸光度，記為As；（2）精確移取2 mL 0.2 mmol/mL DPPH與2 mL無水乙醇混合，室溫下放置30 min，于517 nm處測吸光度，記為Ao；（3）精確移取2 mL無水乙醇與2 mL供試液混合，室溫下放置30 min，于517 nm處測吸光度，記為Ac；以Vc溶液作為陽性對(duì)照。每個(gè)樣品做2個(gè)平行樣，清除率計(jì)算公式如下：

國家層面的媒體融合戰(zhàn)略的下一步是縣級(jí)融媒體中心建設(shè)，推動(dòng)黨媒公共平臺(tái)與基層融媒體中心共享資源。基層媒體融合關(guān)乎縣域治理與穩(wěn)定，其重要性不容小覷。這也是本文所提到的主流媒體平臺(tái)化建立新的內(nèi)容生態(tài)的重要步驟。區(qū)域型主流媒體的融合轉(zhuǎn)型是地方社會(huì)政治經(jīng)濟(jì)文化變革的一個(gè)縮影，同時(shí)伴隨著輿論引導(dǎo)生態(tài)和社會(huì)治理平臺(tái)的重塑。傳播方式的變革給人們的信息使用行為帶來極大影響，在消費(fèi)升級(jí)和供給側(cè)改革中尋找新的發(fā)展空間和變革動(dòng)力，加快構(gòu)建媒介融合生態(tài)圈，進(jìn)一步提升區(qū)域型主流媒體對(duì)地方社會(huì)的實(shí)際影響力，是深化傳統(tǒng)媒體融合之路的重要課題。

DPPH清除率S%=1-(As-Ac)/Ao×100%

1.6.2 竹葉蘭內(nèi)生菌發(fā)酵液提取物對(duì)Fe3+還原能力的測定

Fe3+還原能力的測定是根據(jù)Wang[20]的方法，并略有改動(dòng)。取2.5 mL各菌株不同濃度的樣品液，與2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的PBS緩沖液和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液混合，50 ℃水浴20 min后迅速冷卻至室溫，再向其中加入2.5 mL 10%的三氯化鉀溶液，用微孔濾膜器過濾后，取上清液5 mL，向其中加入4 mL蒸餾水和1 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混勻后，靜置10 min并于700 nm處測定吸光度，記為A。以Vc溶液作為陽性對(duì)照。每個(gè)樣品做2個(gè)平行樣。

1.6.3 竹葉蘭內(nèi)生菌發(fā)酵液提取物清除 H2O2的能力

清除過氧化氫能力(PSC)分析參照Du[21]等人報(bào)道的方法，并稍有調(diào)整。取4.0 mL各菌株不同濃度的樣品，向其中加入1.0 mL由pH 7.4的PBS緩沖液調(diào)配的1%的過氧化氫溶液，靜置反應(yīng)10 min后，于230 nm處測吸光度值，記為 Ax；以蒸餾水調(diào)零，記為 Ao；以Vc溶液作為陽性對(duì)照。每個(gè)樣品做2個(gè)平行樣，清除率計(jì)算公式如下：

H2O2清除率 Q%=(Ao-Ax)/Ao×100%

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析以單向方差分析法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析，以p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 竹葉蘭內(nèi)生菌的分離和純化結(jié)果

從提取的竹葉蘭內(nèi)生真菌基因組DNA中，利用ITS rRNA通用引物ITS4/ITS5成功地?cái)U(kuò)增出了單一清晰的條帶，且所有序列長度均在500～750 bp之間，沒有拖帶現(xiàn)象。

研究認(rèn)為，菌種基因序列的BLAST比對(duì)結(jié)果的同源性若大于 97%，則可判定為同一物種；若小于97%，則不能判定其一致性。在GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLAST分析比對(duì)結(jié)果顯示（見表1），本實(shí)驗(yàn)所分離得到的 16株葉蘭內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定 YNLF-1為Phanerochaete sp.，YNLF-3 為 Phyllosticta capitalensis，BSSF-3 為 Diaporthe sp.，BSRF-1 為 Hypoxylon sp.，BSRF-2為Nodullsporium sp.，BSRF-3為Chaetomium nigricolor，其余10種菌株均為Colletotrichum sp.。結(jié)果顯示竹葉蘭內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)種為刺盤孢屬。由于YNLF-1的比對(duì)結(jié)果較低，為93%，表明該菌株很大可能是Phanerochaete sp.的新種，后續(xù)我們還將會(huì)對(duì)其作進(jìn)一步的分析鑒定。

2.2 竹葉蘭內(nèi)生菌的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中得到的 16種內(nèi)生菌菌株菌落表面均呈絲狀或絨毛狀，因此可初步判斷其全部為真菌。我們采用FIM倒置熒光顯微鏡（100×10倍）對(duì)該16種內(nèi)生菌株分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察（圖1），特征描述詳見表2。

表1 兩種產(chǎn)地竹葉蘭植株的不同部位內(nèi)生菌分離及鑒定結(jié)果Table 1 Isolation and identification of endophytes in different parts of Arundina graminifolia in two producing regions

表2 竹葉蘭內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)特征Table 2 Morphological characteristics of endophytes in Arundina graminifolia

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圖1 竹葉蘭內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)特征（菌落平板正面觀察圖及對(duì)應(yīng)菌株在100×10倍下倒置熒光顯微鏡圖）Fig.1 Morphological characteristics of endophytes in Arundina graminifolia (the positive view of the colony plate and the corresponding strain were observed using an inverted fluorescence microscopy at 100 x 10 times)

2.3 部分竹葉蘭內(nèi)生菌的抗氧化活性的評(píng)價(jià)

本次實(shí)驗(yàn)中我們選擇了5種具有代表性的竹葉蘭內(nèi)生真菌，分別為YNLF-1、BSSF-2、BSRF-1、BSRF-2及 BSRF-3。對(duì)以上菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，得其發(fā)酵液萃取物，各個(gè)樣品依次進(jìn)行對(duì)DPPH自由基的清除能力的測定、對(duì)Fe3+還原能力的測定及清除H2O2能力的測定。結(jié)果表明（圖2），該5種竹葉蘭內(nèi)生真菌均有不同程度的抗氧化活性，其中菌株BSSF-2的抗氧化活性最強(qiáng)，其在0.2 mg/mL的濃度下對(duì)DPPH自由基的清除率高達(dá)90.25%左右，對(duì)Fe3+的還原能力最強(qiáng)，對(duì) H2O2自由基的清除率可達(dá) 81.08%；菌株YNLF-1也具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其在 0.2 mg/mL的濃度下對(duì) DPPH自由基的清除率可超過 80%，對(duì)Fe3+的還原能力稍弱于BSSF-2，對(duì) H2O2自由基的清除率也接近70%。

圖2 5種竹葉蘭內(nèi)生真菌發(fā)酵液的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of five kinds of endophytic fungi in the fermentation broth of Arundina graminifolia

2.4 抗氧化優(yōu)勢(shì)菌種BSSF-2的系統(tǒng)發(fā)育分析

將竹葉蘭內(nèi)生菌 BSSF-2的 ITS序列結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，采用MEGA 6.0軟件對(duì)抗氧化優(yōu)勢(shì)菌種BSSF-2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)合該菌株形態(tài)學(xué)特征，鑒定菌株BSSF-2為刺盤孢屬的喀斯特炭疽菌(Colletotrichum karstii)。

圖3 抗氧化優(yōu)勢(shì)菌BSSF-2與GenBank中參考菌株ITS rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the ITS rDNA sequences of antioxidative dominant bacteria BSSF-2 and its GenBank allies

3 結(jié)論

3.1 本研究通過對(duì)兩種產(chǎn)地的竹葉蘭植株的內(nèi)生菌進(jìn)行初步的分離及純化，發(fā)現(xiàn)在不同地區(qū)的竹葉蘭中分離得到的內(nèi)生菌其數(shù)量、種類均有顯著差異，其中產(chǎn)于廣西的竹葉蘭中分離出的內(nèi)生菌數(shù)量及種類明顯多于產(chǎn)于云南的竹葉蘭內(nèi)生菌，反映出植物內(nèi)生菌的種類和數(shù)量可能與宿主植物的生長環(huán)境有關(guān)，例如當(dāng)?shù)氐臏囟?、空氣濕度和土壤成分等。本?shí)驗(yàn)首次從藥用植物竹葉蘭中分離得到16株內(nèi)生菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和ITS基因序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)這些菌株全部歸屬于真菌，表明內(nèi)生真菌是竹葉蘭內(nèi)生菌的重要組成部分，其中刺盤孢屬真菌為竹葉蘭內(nèi)生真菌的一大優(yōu)勢(shì)種。

3.2 近年來國內(nèi)外已經(jīng)有學(xué)者從數(shù)十種藥用植物中分離出了內(nèi)生菌，并從這些藥用植物內(nèi)生菌中獲得了和宿主植物相同或相似的天然活性成分。植物內(nèi)生真菌中存在大量具有良好抗氧化活性的天然產(chǎn)物，包括酚酸類、異苯并呋喃、生物堿、聚酮、黃酮、芳香醚和萜類等，這些結(jié)構(gòu)多樣生物活性物質(zhì)將成為開發(fā)新型天然抗氧化劑的重要來源。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)5種竹葉蘭內(nèi)生真菌 YNLF-1、BSSF-2、BSRF-1、BSRF-2及BSRF-3抗氧化活性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)菌株 BSSF-2及YNLF-1具有較強(qiáng)的抗氧化作用（其中對(duì)DPPH自由基的清除率≥80%），經(jīng)鑒定菌株 BSSF-2為Colletotrichum karstii，YNLF-1 為 Phanerochaete sp.。本研究結(jié)果表明，分離藥用植物內(nèi)生菌不僅是尋找未知新菌種的一個(gè)重要途徑，同時(shí)也將為新型抗氧化藥物的開發(fā)提供新思路。至于內(nèi)生菌與其宿主植物之間具體存在怎樣的互作關(guān)系，內(nèi)生菌與宿主植物生長及其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生存在何種聯(lián)系，尚需我們深入研究。

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