大蔥提取物蔥辣素的體外抗菌和抗病毒作用研究

黃依璇，陳慧敏，姚亮，呂樹娟

（1.安徽省合肥市第一中學，安徽合肥 230601）（2.安徽醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，安徽合肥 230032）

不僅在我國國內(nèi)以及全世界各處的華人聚居地，甚至在東亞各國，大蔥常作為一種很普遍的香料調(diào)味品或蔬菜出現(xiàn)在人們的食譜中，并在整個東方烹調(diào)食物體系中都占有十分重要的位置。在我國北方，就有生吃大蔥以及用大蔥作為涼拌食材烹飪的傳統(tǒng)，而在慣。因其內(nèi)含有大量的維生素和礦物質(zhì)都是人們生活南方則有將大蔥與其他食材放在一起烹調(diào)熟透的習中不可或缺的，以及其特殊的口感與味道贏得了大家的喜愛。同時，大蔥中還含有一種揮發(fā)性油類物質(zhì)，其主要活性成份是蔥辣素，這類有機硫類化合物質(zhì)具有較強的殺菌、抑制癌癥細胞、降血脂和預防動脈硬化等作用[1～3]。

盡管人們對大蔥的作用已有一定的了解，但目前國內(nèi)對大蔥的研究主要停留在食品添加劑、植物種植、揮發(fā)油混合物的提取、畜牧業(yè)以及大蔥油混合物的殺菌等，部分文獻研究大蔥提取物對胃癌細胞的作用，但未涉及對大蔥提取物的主要活性成份蔥辣素的抗菌和抗病毒的效果研究[4～6]，尤其是缺乏抗病毒作用研究，其臨床應用也有待進一步開發(fā)。因此，本項目主要探討大蔥提取物蔥辣素體外對常見感染細菌如金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抗菌作用，以及抗呼吸道合胞病毒作用，旨在為人們對蔥辣素的抗菌和抗病毒有著更為具體和深入的認識，為蔥辣素的進一步研究開發(fā)與臨床應用提供堅實的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

大蔥購自合肥農(nóng)貿(mào)市場；無水乙醇，上海振興化工一廠；L-半胖氨酸，合肥摩爾生物科技有限公司；DTNB，合肥摩爾生物科技有限公司；Hepes試劑，合肥摩爾生物科技有限公司；大蒜素標準品對照（貨號：SA8720，批號：912A021），上海禾豐制藥廠生產(chǎn)。

1.1.2 細胞、病毒和菌株

HEp-2細胞（人喉癌上皮細胞），呼吸道合胞病毒（RSV）國際標準株(Long株)，均由安徽醫(yī)科大學微生物學教研室提供。滴定該病毒毒力 TCID50為2.5×10-6.79/0.1 mL，備用。金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、大腸埃希菌（ATCC8099）均為安徽醫(yī)科大學微生物學教研室-80 ℃凍存菌種，菌種鑒定依據(jù)衛(wèi)生部醫(yī)政司1997年編著《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第二版。

1.1.3 細菌培養(yǎng)基

選用營養(yǎng)瓊脂（NA）（批號20161216）和營養(yǎng)肉湯（NB）（批號20161106），產(chǎn)品編號：HB1019，青鳥裔科園海博生物有限公司，按產(chǎn)品說明配置。

1.1.4 主要儀器

DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；ELX88型酶標儀，美國Bio Tek儀器有限公司；Napco-6100恒溫CO2培養(yǎng)箱，美國杜邦公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，吳江洪鼎凈化設備有限公司；ZF-90暗箱式紫外透射儀，上海顧村電光儀器廠；各種規(guī)格培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板，美國Falcon公司。

1.2 方法

1.2.1 蔥辣素的提取與得率測定

將大蔥洗凈、干燥、粉碎過60目篩，按照文獻[1]的方法并應用單因素和正交試驗設計對蔥辣素提取工藝進行條件優(yōu)化，提取蔥辣素，測定其得率與濃度，濾過除菌備用。

采用分光光度計測定吸光值（A），計算蔥辣素的得率。按照文獻[7]，計算公式如下：

式中：V為提取液的體積 mL；d為總稀釋倍數(shù)；162.26為L-半胱氨酸分子量；14150為DTNB與L-半胱氨酸反應產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)；M0為大蔥質(zhì)量，g。

1.2.2 蔥辣素對細胞的毒性實驗與抗病毒實驗

在96孔板上，每孔加0.8×105/mL濃度的HEp-2細胞0.1 mL，培養(yǎng)24 h，加含蔥辣素維持液。蔥辣素濃度按倍比稀釋為2-1～2-10（濃度=稀釋倍數(shù)×蔥辣素得率）。觀察細胞病變效應(cytopathic effects，CPE)：(-)：無細胞病變；(+)：25%以下的細胞有病變；(++)：25%～50%的細胞有病變；(+++)：50%～75%的細胞有病變；(++++)：75%～100%的細胞有病變，每一濃度均重復2孔，同時設正常細胞對照。用Reed-Muench法[8]計算出蔥辣素對HEp-2細胞的半數(shù)中毒濃度(TC50)和最大無毒濃度（TC0）。

根據(jù)蔥辣素對細胞毒性實驗結(jié)果，在96孔板上加入細胞培養(yǎng)24 h，在蔥辣素最大無毒濃度（TC0）范圍內(nèi)，加含蔥辣素維持液預防性給藥，濃度分別為2-4.2、2-5～2-9（濃度=稀釋倍數(shù)×蔥辣素得率），每一濃度均重復2孔并進行三次重復試驗。同時設置正常對照組和病毒對照組。吸棄含蔥辣素維持液，每孔接種50 μL 100個TCID50病毒液，吸附90 min后吸棄病毒上清液，每孔加入100 μL的維持液。然后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察CPE。約在病毒對照組出現(xiàn)75%～100%病變時加入50 μL中性紅染液染色，繼續(xù)孵育1.5 h后，棄培養(yǎng)液、PBS洗滌細胞三次，最后在每個培養(yǎng)孔中均加入200 μL、0.05 mol/L NaH2PO450%乙醇溶液，并置振蕩器上振蕩5 min，使細胞中的中性紅全部溶出，酶標儀在550 nm處測吸光值（A），根據(jù)以下公式計算蔥辣素的抑制百分率=（實驗組平均A值-病毒對照組平均A值）/（細胞對照組平均 A 值-病毒對照組平均 A 值）×100%。以Reed-Muench法和直線回歸法計算蔥辣素對RSV 50%抑制濃度（IC50）及治療指數(shù)TI（TI=TC50/IC50）。

1.2.3 大蒜素對照的細胞毒性實驗與抗病毒實驗

方法同上，將含大蒜素濃度分別為200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL、1000 μg/mL、1500 μg/mL、2000 μg/mL、3000 μg/mL 和 4000 μg/mL 的維持液加入細胞板中，測定大蒜素對HEp-2細胞的半數(shù)中毒濃度(TC50)和最大無毒濃度（TC0）。從最大無毒濃度開始，加含不同濃度大蒜素維持液，分別為 420 μg/mL、400 μg/mL、350 μg/mL、300 μg/mL、250 μg/mL、200 μg/mL、150 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL，每孔加入 100 μL。同上，測吸光值 A，并以Reed-Muench法計算大蒜素對RSV的50%抑制濃度（IC50）及治療指數(shù)TI。

1.2.4 蔥辣素抗菌實驗度(MIC)。完全無細菌生長，并轉(zhuǎn)種在液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）中，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)18 h，證實仍無細菌生長的蔥辣素最低濃度為其最低殺菌濃度（MBC）。以2倍倍比稀釋的大蒜素作為對照。

1.2.4.1 抑菌環(huán)實驗

（1）抑菌片的制備：取無菌干燥濾紙片，分別滴加不同濃度蔥辣素溶液 20 μL，特異性標記為 B，A為大蒜素對照。然后將濾紙片平放于無菌平皿內(nèi)，37 ℃溫箱中烘干。濾紙片制成直徑為5 mm、厚不超過4 mm圓塊，陰性對照樣片的制備以無菌蒸餾水進行。

（2）試驗菌的接種：用無菌棉拭子蘸取濃度為5×106CFU/mL試驗菌懸液，分別在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿表面均勻涂抹3次，每涂抹1次，平板應轉(zhuǎn)動60 °，最后將棉拭子繞平皿邊緣涂抹 1周。置室溫干燥 5 min。然后將已制備的含不同濃度蔥辣素紙片按常規(guī)操作均勻貼放在培養(yǎng)皿表面，37 ℃培養(yǎng)16～18 h觀察結(jié)果。用游標卡尺測量抑菌環(huán)的直徑（包括貼片）并記錄。實驗重復3次。測量抑菌環(huán)時，應選均勻而完全無菌生長的抑菌環(huán)進行，測量其直徑應以抑菌環(huán)外沿為界。

1.2.4.2 MIC和MBC測定

取無菌小試管10支，以無菌操作每管中分別加液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基1 mL，吸取蔥辣素母液（原液）1 mL放入第一管中，混勻后吸取1 mL放入第二管中，如此做二倍量稀釋到第9支試管，混勻后吸取1 mL棄去，第 10管不加蔥辣素作對照。分別將調(diào)整濃度為1×108CFU/mL的細菌稀釋1000倍后，菌液終濃度為105CFU/mL，每管加入0.1 mL菌液后置于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，在前后2個不同濃度梯度小試管，使細菌量突然減少 80%～90%的濃度即為最小抑菌濃

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

Kruskal-Wallis法分析比較不同濃度實驗組與病毒對照組之間的CPE變化情況，同時對濃度與A值和CPE抑制率進行相關(guān)分析，判定是否存在劑量效應關(guān)系。采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，概率p<0.05～0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔥辣素的得率

根據(jù)文獻[1]的方法，我們的實驗室提取結(jié)果并不理想。適合我們的工藝條件是乙醇體積分數(shù)為100%、料液比為1:33.5、超聲功率為200 W、超聲時間為15 min。在此條件下，蔥辣素平均得率為0.066 mg/g，與文獻報道相似。

2.2 蔥辣素對細胞的毒性測定與抗病毒實驗

2.2.1 蔥辣素提取液的TC50和TC0計算

蔥辣素在濃度較高時可能對細胞有一定的毒性作用，可造成細胞病變、脫落、溶解、死亡，經(jīng)結(jié)晶紫染色流水沖洗后，從而留下沒有細胞生長的空斑（如圖1的2-1和2-2所示）。

有細胞生長者則培養(yǎng)板著色較深（因結(jié)晶紫是活細胞染色，如圖1的2-3～2-10所示）。因此需測定其最大無毒濃度，以排除蔥辣素本身對正式抗病毒實驗中所用細胞的影響。

圖1 蔥辣素對HEp-2細胞的毒性實驗（結(jié)晶紫染色）Fig.1 Toxic experimental results of onion capsaicin on HEp-2 cells (crystal violet staining)

根據(jù)細胞病變（CPE）的程度，每個孔最高病變記為“4+”，兩個重復孔最高病變則為“8+”，按Reed-Muench法計算得 TC0=2-4.2=3.6 μg/mL，TC50=2-3.4=6.3 μg/mL。即蔥辣素的最大無毒濃度是3.6μg/mL，我們在進行抗病毒實驗中選用3.6 μg/mL以下濃度進行。

2.2.2 抗病毒實驗-細胞病變抑制法

根據(jù)細胞毒性實驗結(jié)果，在最大無毒濃度范圍內(nèi)進行蔥辣素的抗病毒實驗。在接種 RSV 48 h后的HEp-2細胞病變明顯，CPE達到100%，說明病毒對HEp-2細胞具有明顯的損傷作用。在給予蔥辣素后，如蔥辣素稀釋24.2～26倍（記作2-4.2～2-6）時有較多的活細胞存在，說明蔥辣素在一定程度可保護細胞免受病毒的損傷，即蔥辣素能抑制病毒的增殖。結(jié)果見圖2。

圖2 蔥辣素的抗病毒實驗結(jié)果（結(jié)晶紫染色）Fig.2 The antiviral results of onion capsaicin (crystal violet staining)

圖3 抗病毒實驗中蔥辣素不同濃度與A值和CPE抑制百分率的相關(guān)性Fig.3 The correlation between different concentrations of onion capsaicin and A value and percentage of CPE inhibition in antiviral experiments

經(jīng) Reed-Muench法計算，得蔥辣素的IC50=2-5.3=1.7 μg/mL，TI=TC50/IC50=2-3.4/2-5.3=3.71。

2.2.3 抗病毒實驗-中性紅染色法

通過比色測定A值，根據(jù)公式計算出蔥辣素抑制細胞病變百分率，計算結(jié)果見表1和圖3。

由圖3可見，隨著蔥辣素稀釋度的增加，對濃度和吸光值A(chǔ)，以及濃度和抑制CPE百分率進行相關(guān)分析，均呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)關(guān)系。標準曲線回歸方程分別為：Y=15.455x+0.0949，R2=0.9916，p<0.05；Y=19.961x+0.0174，R2=0.9663，p<0.05。按Reed-Muench法計算，得出 IC50=2-5.3μg/mL=1.7μg/mL?？梢?，中性紅染色法的計算結(jié)果與細胞病變抑制法結(jié)果一致。

表1 不同濃度蔥辣素的抗病毒實驗比色結(jié)果（±s，n=3，中性紅染色）Table 1 The colorimetric results of different concentrations of onion capsaicin in antiviral experiment (neutral red staining)

表1 不同濃度蔥辣素的抗病毒實驗比色結(jié)果（±s，n=3，中性紅染色）Table 1 The colorimetric results of different concentrations of onion capsaicin in antiviral experiment (neutral red staining)

蔥辣素分組 A值 抑制細胞病變百分率/%2-4.2 0.911±0.026 100 2-5 0.611±0.031 75 2-6 0.356±0.019 30 2-7 0.222±0.022 12 2-8 0.165±0.011 3 2-9 0.081±0.009 0

2.3 大蒜素對照細胞毒性實驗與抗病毒實驗

我們以大蒜素為對照，首先觀察其細胞毒性作用，以排除對正式抗病毒實驗的干擾。經(jīng)Reed-Muench法計算，得其 TC0=420 μg/mL，TC50=2086.3 μg/mL。從最大無毒濃度開始，按Reed-Muench法計算其抗病毒實驗的 IC50=287.4 μg/mL，TI=TC50/IC50=7.26。

由以上結(jié)果可以看出，蔥辣素和對照大蒜素均具有一定的抗RSV作用，相比較而言，蔥辣素對RSV更敏感，但大蒜素的安全性較高。

2.4 抗菌實驗結(jié)果

根據(jù)測量和觀察，蔥辣素的抑菌環(huán)實驗、MIC與MBC測定結(jié)果分別見表2和表3。

表2 蔥辣素與大蒜素對照的抑菌環(huán)平均直徑（±s，n=3，mm）Table 2 The average diameter of antibacterial ring of allicin control and onions capsaicin (mm)

表2 蔥辣素與大蒜素對照的抑菌環(huán)平均直徑（±s，n=3，mm）Table 2 The average diameter of antibacterial ring of allicin control and onions capsaicin (mm)

菌種 大蒜素(A) 蔥辣素(B) 蒸餾水(N)金黃色葡萄球菌 11±0.5 10±0.5 0大腸埃希菌 12±0.4 11±0.3 0

表3 蔥辣素及大蒜素對照的MIC和MBC最低稀釋度Table 3 The lowest dilution to MIC and MBC of garlic control and onions capsaicin

由以上結(jié)果可見，蔥辣素與大蒜素體外對上述兩種細菌均有一定的抑制和殺滅作用。由表3可計算出蔥辣素的MIC和MBC分別為4.125 μg/mL和8.25μg/mL。

3 討論

目前國內(nèi)對蔥辣素均未涉及其抗菌和抗病毒效果的系列研究。由于呼吸道合胞病毒屬于副粘病毒科肺炎病毒屬，是一種有包膜的單股負鏈RNA病毒，被認為是引起世界范圍內(nèi)嬰幼兒嚴重下呼吸道感染最常見病原體，至今尚無有效疫苗和特異性的臨床治療措施[9～11]；金黃色葡萄球菌是人類一種重要病原菌，可引起多種化膿性感染，是革蘭陽性菌的代表；大腸埃希菌通常被稱為大腸桿菌，屬于革蘭陰性細菌，當其寄居部位改變時亦可引起多種感染，這就讓我們想到選擇這些病原微生物作為實驗對象來進行研究。經(jīng)檢索查新顯示，從項目整體來說，國內(nèi)未見與本項目研究內(nèi)容一致的公開文獻報道。因此，本項目即是創(chuàng)新性地開展蔥辣素的抗菌和抗病毒作用研究。

本實驗中，在做正式抗病毒實驗前，為了確保細胞的安全性和實驗的準確性，避免在實驗過程中發(fā)生蔥辣素本身引起細胞病變現(xiàn)象，我們先進行了蔥辣素的細胞毒性實驗，確定其最大無毒濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蔥辣素提取液也有一定的細胞毒性，因此我們選擇從蔥辣素的最大無毒濃度開始進行正式的抗病毒實驗。在實驗中我們采取了預防法給藥的方式（即先給予蔥辣素，后吸附病毒），應用多種方法測定蔥辣素的抗病毒作用，發(fā)現(xiàn)其對RSV感染具有一定的預防作用，這為臨床預防RSV及其他呼吸道感染提供了實驗依據(jù)。韓春然[5]研究表明：大蔥的總提取物對白色葡萄球菌、黑曲霉和粘紅酵母具有抑制作用，對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制作用較差；大蔥的脂溶性提取物與總提取物具有類似的抑菌作用；大蔥的多糖和蛋白成分對真菌和細菌都沒有抑制作用，推測大蔥對微生物的抑制主要是以大蔥中的脂溶性物質(zhì)成分所作用而成。楊粟艷等[3]研究表明：大蔥總提取物和揮發(fā)性成分對黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)及菌絲生長都有很好的抑制效果，其中大蔥揮發(fā)性成分對供試菌的抑制效果優(yōu)于提取物，而大蔥蛋白及多糖成分對供試菌均無抑制效果。我們在抗菌實驗中也證明了其對 G+菌和 G-菌均具有一定的殺菌作用，而我們所提取的蔥辣素正是大蔥揮發(fā)油的主要活性成份，因此與上述提取物的實驗結(jié)果相吻合，并且更進一步明確了大蔥屬類植物發(fā)揮抗菌作用的可能的活性物質(zhì)。蔥屬植物的化學成分主要有硫化物、甾體皂苷、黃酮類化合物和含氮成分等，大蔥制劑通過對巰基的氧化，使與微生物生長繁殖有關(guān)的含巰基的酶失活，或?qū)蜓趸幕衔锶缂“彼?、谷氨酸產(chǎn)生競爭性抑制，或非競爭性的抑制某些酶的技能，從而對多種致病真菌起到抑制或殺滅作用[5]。

本實驗也加入了常見天然提取物大蒜素的對照實驗，以證明我們實驗設計的可靠性。但本實驗也有一些不足之處，比如涉及的抗菌實驗菌株種類和抗病毒實驗中的病毒種類還相對較少，這些將在以后的實驗中加以補充與完善。

4 結(jié)論

蔥辣素具有一定的體外抗金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的作用，而且對兩類細菌的作用效果相當；在其抗呼吸道合胞病毒作用中，通過預防性給藥能抑制病毒增殖，顯示對病毒很敏感而且安全。由于其取材方便，價廉物美，為蔥辣素的開發(fā)與臨床應用提供了堅實的科學依據(jù)。

致謝

此項目部分內(nèi)容主要在安徽醫(yī)科大學微生物學教研室完成。感謝教研室的瞿明勝博士在病毒培養(yǎng)、無菌操作方面給予的幫助，感謝研究生孫濤在細胞培養(yǎng)、病毒準備方面給予的大力支持，感謝胡濤老師在抗菌實驗材料準備方面給予的幫助！

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