基于聚吡咯/石墨烯的甘油酶電極的構建及性能研究

陳東霞，張力，李曉霞，樸金花，梁振興，姜建國

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）（2.華南理工大學化學與化工學院，廣東廣州 510640）

甘油的催化氧化是一個復雜的反應體系，包括多個平行和串聯(lián)反應，可以生成甘油醛和甘油酸等多種產物[4]。通常的甘油催化氧化技術耗時昂貴且復雜繁瑣，并且缺乏足夠的特異性。已有大量文獻報道Pt、Pd和Au納米顆粒作為電催化劑在助劑的作用下可以選擇性催化氧化甘油[3,5～7]，但催化劑/產物分離過程復雜，貴金屬催化劑重復使用困難，在各種替代技術中，酶由于其具有專一性、高選擇性和高效率，表現(xiàn)出了極大的應用前景[8]。

很多研究團隊用酶作為催化進行了甘油的催化氧化研究，Minteer[2,9～11]報道了在聚合物基底上使用多壁碳納米管和其修飾的金納米顆粒作為酶電極的修飾材料，制備 PQQ固定的乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶修飾電極，在其上進行多步氧化過程以將甘油氧化成丙酮二酸，電流密度高達 16.8±2.1 μA/cm2；Fernando[12]通過采用無機硫化鐵單分子線修飾的金電極支撐NAD+-甘油脫氫酶輔酶配合物，制備了甘油氧化生物傳感器，其甘油選擇性氧化集中在生物轉化上，用甘油脫氫酶催化產生 1,3-二羥基丙酮[13,14]；Michelle[15]開發(fā)了基于甘油激酶和甘油三磷酸氧化酶的電化學方法，通過鉑微電極測定生物柴油樣品中的游離甘油。

對于酶催化劑，酶的活性位點到電極表面的電子轉移的機制通常被分類為直接電子轉移（DET）和間接電子轉移（MET）。而在各種氧化還原酶中少于10%被證明可以通過 DET機制進行電子轉移[16]，大多數(shù)氧化研究依賴于外源氧化還原電對（可溶性氧化還原物質，還原性初級代謝物或外膜氧化還原蛋白），促進電子從酶活性位點轉移，提高整體生物電化學效率。由于聚吡咯良好的環(huán)境穩(wěn)定性，離子交換性能和高導電性，其納米復合材料被廣泛應用于超級電容器，氣體檢測機理和吸附劑[17～19]，如聚吡咯及其改性物質如石墨烯-聚吡咯納米復合材料被認為是從廢水中去除ClO4-的有效吸附劑[20]。基于聚吡咯-石墨烯的納米復合材料在酶修飾電極的制備中也可以預期去的很好的效果。

本論文研究了一種用于甘油催化氧化的新型酶電極。所構建的甘油酶電極以甘油激酶和甘油三磷酸氧化酶為催化劑，以三維石墨烯為載體，以聚吡咯為介體，同時采用Nafion溶液作為粘結劑，固定的修飾層在酶、介體及電極表面提供良好的電子轉移。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石墨粉（99.0%，天津市大茂化學試劑廠），甘油（99.0%，天津市富宇精細化工有限公司），甘油激酶（25～75 U/mg，Sigma），甘油三磷酸氧化酶（≥70 U/mg，Sigma），吡咯（99.0%，Adamas-beta），Nafion（5 wt%，Dupont D-520，昆山桑萊特新能源科技有限公司），鐵氰化鉀（99.9%，天津市大茂化學試劑廠）。其他常規(guī)試劑均來自廣州化學試劑廠，均為分析純，實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

場發(fā)射掃描電子顯微鏡（Zeiss Merlin，德國）；冷凍干燥機（ALPHA1-4LD plus，德國CHRIST）；電化學工作站（CHI660E，上海辰華儀器有限公司）；旋轉蒸發(fā)器（RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鞏義市予華儀器有限責任公司）；電熱鼓風干燥箱（DHG-9076A，上海一恒科學儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-300VDB，昆山市超聲儀器有限公司）；真空干燥箱（DZF-6050，上海秣馬恒溫設備廠）；酸度測定儀（pH 400，Alalis）。

1.3 實驗方法

1.3.1 三維石墨烯的制備

采用改進的 Hurnmers方法制備氧化石墨[21]，取100 mg氧化石墨于燒杯中，加入50 mL去離子水后超聲剝離 2 h，之后取分散液移到高壓反應釜中，在180 ℃條件下水熱還原16 h后取出，冷凍干燥24 h。

由表12可以看出隨著浴比的減小，棉條表觀深度K/S值增加，在浴比1：10棉條得色最深，但是染色不勻。這是由于浴比減小，上染率越大，棉條得色越深，但浴比過小，容易染色不勻。所以宜選擇浴比1：15，以獲得良好的染色深度。

1.3.2 吡咯的聚合

將工作電極的表面依次用直徑為0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末拋光成鏡面，再用水沖洗；然后依次在無水乙醇和水中超聲清洗 1 min，取出用水洗凈，晾干。將吡咯單體（經70 ℃旋轉蒸發(fā)預處理2 h）配制成為0.1 mol/L的吡咯溶液（含0.1 mol/L的LiClO4）；采用循環(huán)伏安法（聚合電位：-1.0～1.0 V，掃速：50 mV/s）在10 mL吡咯溶液中電化學聚合不同時間，即可在電極表面得到不同厚度的聚吡咯膜，在室溫下晾干，得到聚吡咯膜修飾的電極。

1.3.3 酶電極的制備

圖1 聚吡咯酶修飾電極反應過程示意圖Fig.1 The schematic diagram of the fabrication of the PPy-modified enzymatic electrode

將三維石墨烯溶液超聲 2 h后得到濃度為 1 mg/mL分散液，采用0.1 mol/L NaOH溶液將5 wt%Nafion溶液調節(jié)pH至7.0，將甘油激酶和甘油3-磷酸氧化酶分別配制成濃度為30 mg/mL的水溶液，將四種溶液以1:1:1:1體積比混合得到混合溶液，取6.7 μL混合溶液滴于有聚吡咯膜的電極表面，在室溫下晾干，得到催化甘油的酶電極。所述酶電極的修飾過程如圖1所示。

1.3.4 電化學測試

電化學測試采用經典三電極體系，工作電極為在玻碳電極基底上制備的酶修飾電極，對電極為鉑片電極，參比電極為銀/氯化銀電極。在含有0.2 mol/L KCl的5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中進行不同聚合圈數(shù)制備的聚吡咯膜性能測試，采用循環(huán)伏安法在0～0.5 V范圍內測試。將所得基于催化甘油的酶電極在室溫下進行電化學性能測試，均在 10 mL磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L、pH 7.0）中進行，測試之前通N2，測試過程中采用循環(huán)伏安法，其中空白對照未滴加甘油，測試穩(wěn)定后滴加100 μL甘油。

2 結果與討論

2.1 聚吡咯的制備及表征

圖2 不同聚合圈數(shù)的聚吡咯的SEMFig.2 SEM images of PPy films of different cycles

通過在電極上生長不同數(shù)量的吡咯聚合物，制備具有不同膜厚度的電極。采用掃描電子顯微鏡對所制備的PPy修飾電極的微觀結構和形貌進行了研究，其掃描電子顯微鏡圖如圖2所示，結果表明，吡咯明顯在電極表面聚合，顯示出西蘭花狀結構，并隨著聚合圈數(shù)從2圈增加到16圈，其膜厚度增加，當聚合圈數(shù)為16時其尺寸大于1 μm。

將不同修飾電極（GCE/PPy/PPy-GN-GK-GPO電極）在含有0.2 mol/L KCl的5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中進行循環(huán)伏安測試（掃描電位 0～0.5 V，掃描速度50 mV/s），其循環(huán)伏安圖如圖3所示，結果表明，在裸電極和修飾電極上都可以明顯觀察到Fe2+/Fe3+的一對可逆的氧化還原峰。裸電極的峰值電流（42.97 μA）與酶修飾電極的峰值電流（196.7 μA）相比最低，而PPy修飾電極的峰值電流較高，達到204.5 μA，這可能是由于酶的絕緣蛋白層阻礙了電子轉移。同時從圖3可知，隨著聚吡咯薄膜的增加，電流穩(wěn)定增加，并且與同時添加酶和石墨烯表現(xiàn)出相似的行為，則聚吡咯膜可能形成用于酶固定的致密結構，并同時作為電子轉移的橋梁有助于電子轉移。上述結果證實催化甘油的酶電極已成功制備。

圖3 不同電極在鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.3 The CVs of different electrodes in ferricyanide solution

2.2 酶濃度對催化電流的影響

實驗研究了不同酶濃度對催化電流的影響，當GK和GPO的濃度為30 mg/mL時，催化電流為49.54 μA，當濃度達到60 mg/mL時，催化電流下降到42.73 μA，說明酶濃度的增加使得酶層變厚，可能降低電極的靈敏度，限制了電極表面介體與電子的傳輸與轉移。

酶電極通過GN和GK/GPO形成穩(wěn)定的鍵，因此可以利用復合材料來提高甘油檢測的靈敏度和選擇性。在進一步研究中，GK和GPO的濃度為30 mg/mL，且GK和GPO的比例固定為1:1。

2.3 主要實驗條件的優(yōu)化

圖4 PPy-GN-GK-GPO修飾電極在不同pH 的0.2 mol/L磷酸緩沖溶液中的電流響應（甘油添加量為0.99 mmol/L）Fig.4 Amperometric response of the PPy-GN-GK-GPO modified electrode containing 0.99 mmol/L glycerol in0.2 mol/L PBS of different pHs

pH的變化不僅影響酶的活性，而且可能改變酶修飾電極表面的電荷性質。不同pH對PPy-GN-GK-GPO電極性能的影響（甘油添加量為0.99 mmol/L）如圖4所示，催化電流峰值在pH為7.0是最大的，與應用于甘油三酸酯測定的多酶類型生物傳感器中的結果一致[22]，表明酶在該pH下更具活性，固定化的GK/GPO保持其天然結構并且不變性。同時由圖4可知，催化電流在弱酸性溶液（pH 5.0和pH 6.0）中略有下降，而在弱堿性pH（pH 8.0和pH 9.0）下急劇下降，這可能是由于酶從電極表面的失活或浸出引起。在甘油氧化的相關研究中，Mahadevan[12]報道在Tris緩沖液中的最佳pH為10，Pundir[23]報道在0.1 mol/L PBS中的最佳pH為6.5。pH的差異會影響各種聚合物和固定物質的相互作用，同時在酶活性位置的環(huán)境中的變化可能導致酶和固定物質之間的不同相互作用。

2.4 修飾電極的電化學性能

通過循環(huán)伏安法以不同掃速對 PPy-GN-GK-GPO電極進行了電化學測試，結果如圖5所示，其中甘油添加量為1.95 mmol/L。由圖5可知，在約-0.6 V至-0.4 V的范圍內出現(xiàn)了可逆的氧化還原對，這歸結于固定在電極上的聚吡咯的穩(wěn)定的氧化還原反應。同時，隨著掃描速率從50 mV/s增加到300 mV/s，氧化還原電流和電位差都增加，氧化峰/還原峰電位逐漸轉移到正/負電位，并且峰電流的數(shù)值與掃描速率的平方根成線性相關。這表明該復合修飾電極的氧化還原過程是準可逆的，且該反應過程主要為擴散控制而不是表面電化學過程控制。

圖5 （a）PPy-GN-GK-GPO修飾電極在不同掃速下的循環(huán)伏安圖（甘油添加量為1.95 mmol/L）；（b）電流與掃速的平方根之間的線性關系圖Fig.5 (a) The CVs of PPy-GN-GK-GPO modified electrode at different scan rates in 0.2 mol/L PBS containing 1.95 mmol/L glycerol; (b) The linear equations between peak current and the square root of scan rate

2.5 修飾電極的電催化性能

圖6 PPy-GN-GK-GPO修飾電極在0.2 mol/L磷酸緩沖溶液中對甘油的電流響應圖Fig.6 The CVs of PPy-GN-GK-GPO modified electrode in 0.2 mol/L PBS with/without glycerol

修飾電極在磷酸緩沖溶液中的電催化性能如圖 6所示，其中曲線分別為未添加甘油、甘油添加量為0.99 mmol/L、甘油添加量為 1.95 mmol/L。PPy-GNGK-GPO修飾電極顯示出準可逆行為，且隨著甘油濃度的增加，氧化電流增加，還原電流減低，揭示了PPy-GN-GK-GPO電極對甘油的強響應，說明實現(xiàn)了甘油的催化氧化。且氧化峰催化電流達到46.2 μA，電流密度達到677.6 μA/cm2。根據上述結果，本實驗建立了對甘油的高響應系統(tǒng)。

2.6 修飾電極的穩(wěn)定性

圖7 PPy-GN-GK-GPO修飾電極的連續(xù)響應測試圖Fig.7 Amperometric response of the PPy-GN-GK-GPO modified electrode with continuous tests

將甘油添加量固定為1.95 mmol/L，對制備的酶修飾電極進行連續(xù)的響應測試來評估PPy-GN-GK-GPO電極的長期穩(wěn)定性，實驗結果如圖7所示。結果表明，在50次循環(huán)后，其電流響應為原始反應的82.3%，表明該修飾電極電極表面的催化劑層結構穩(wěn)定，無明顯形態(tài)變化，具良好的長期連續(xù)穩(wěn)定性。

3 結論

本論文研究了一種新型的用于甘油催化氧化的酶電極，以甘油激酶和甘油三磷酸氧化酶為催化劑，采用循環(huán)伏安法將聚吡咯薄膜固定在電極表面，將Nafion、酶與石墨烯混合并固定于電極表面。所述的基于聚吡咯/石墨烯的甘油酶電極在pH為7.0，濃度為0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液對甘油有著較高的電流響應，其催化電流達 46.2 μA，電流密度達 677.6 μA/cm2。

本文結合聚吡咯和石墨烯的獨特性質，提高了修飾電極的導電性，并增強了電極表面與分析物之間的電子轉移，從而實現(xiàn)了甘油的催化氧化，該修飾電極在電化學催化和生物傳感中有極大的應用前景。

[1]Rahmat N, Abdullah A Z, Mohamed A R. Recent progress on innovative and potential technologies for glycerol transformation into fuel additives: A critical review [J].Renewable & Sustainable Energy Reviews, 2010, 14(3):987-1000

[2]Arechederra R L, Treu B L, Minteer S D. Development of glycerol/O2, biofuel cell [J]. Journal of Power Sources, 2007,173(1): 156-161

[3]Maya-Cornejo J, Guerra-Balcázar M, Arjona N, et al.Electrooxidation of crude glycerol as waste from biodiesel in a nanofluidic fuel cell using Cu@Pd/C and Cu@Pt/C [J].Fuel, 2016, 183: 195-205

[4]張夢媛.甘油氧化的催化劑及反應機理研究[D].杭州:浙江大學,2017 ZHANG Meng-yuan. The research of catalysts and the catalytic mechanism for selective oxidation of glycerol [D].Hangzhou: Zhejiang University, 2017

[5]Zhang J H, Zhu T, Liang Y J, et al. CeO2promoted Au/C catalyst for glycerol electro-oxidation in alkaline medium [J].Journal of the Energy Institute, 2016, 89(3): 325-329

[6]Mello G A B, Fernández P S, Martins M E, et al. Glycerol electrooxidation on Platinum-Tin electrodeposited films:inducing changes in surface composition by cyclic voltammetry [J]. Electrocatalysis, 2017, 8(1): 1-10

[7]Yang X, Varma A. Conversion of glycerol to hydrocarbon fuels via bifunctional Catalysts [J]. ACS Energy Letters, 2016,1(5): 963-968

[8]Rubenwolf S, Kerzenmacher S, Zengerle R, et al. Strategies to extend the lifetime of bioelectrochemical enzyme electrodes for biosensing and biofuel cell applications [J].Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 89(5): 1315-1322

[9]Arechederra R L, Minteer S D. Complete oxidation of glycerol in an enzymatic biofuel Cell [J]. Fuel Cells, 2010,9(1): 63-69

[10]Arechederra R L, Minteer S D. Kinetic and transport analysis of immobilized oxidoreductases that oxidize glycerol and its oxidation products [J]. Electrochimica Acta, 2010, 55(26):7679-7682

[11]Aquino Neto S, Hickey D P, Milton R D, et al. High current density PQQ-dependent alcohol and aldehyde dehydrogenase bioanodes [J]. Biosensors & Bioelectronics, 2015, 72: 247-254

[12]Mahadevan A, Fernando S. An improved glycerol biosensor with an Au-FeS-NAD-glycerol-dehydrogenase anode [J].Biosensors & Bioelectronics, 2017, 92: 417-424

[13]Rocha-Martin J, Acosta A, Berenguer J, et al. Selective oxidation of glycerol to 1,3-dihydroxyacetone by covalently immobilized glycerol dehydrogenases with higher stability and lower product inhibition [J]. Bioresource Technology,2014, 170(5): 445-453

[14]Zhang J, Cui Z, Chang H, et al. Conversion of glycerol to 1,3-dihydroxyacetone by glycerol dehydrogenase co-expressed with an NADH oxidase for cofactor regeneration [J]. Biotechnology Letters, 2016, 38(9): 1-6

[15]Pêgas M M, Amado R S, Castro E V D, et al. Analysis of free glycerol in biodiesel using an electrochemical assay based on a two-enzyme platinum microelectrode system [J]. Journal of Applied Electrochemistry, 2010, 40(11): 2061-2063

[16]Neto S A, Milton R D, Hickey D P, et al. Membraneless enzymatic ethanol/O2, fuel cell: Transitioning from an air-breathing Pt-based cathode to a bilirubin oxidase-based biocathode [J]. Journal of Power Sources, 2016, 324: 208-214

[17]Huang Y, Li H, Wang Z, et al. Nanostructured Polypyrrole as a flexible electrode material of supercapacitor [J]. Nano Energy, 2016, 22: 422-438

[18]Li Y, Jiao M, Yang M. In-situ grown nanostructured ZnO via a green approach and gas sensing properties of polypyrrole/ZnO nanohybrids [J]. Sensors & Actuators B Chemical, 2017, 238: 596-604

[19]Srivastava V, Maydannik P, Sillanp?? M. Synthesis and characterization of PPy@NiO nano-particles and their use as adsorbent for the removal of Sr(II) from aqueous solutions [J].Journal of Molecular Liquids, 2016, 223: 395-406

[20]Zhang S, Shao Y, Liu J, et al. Graphene-polypyrrole nanocomposite as a highly efficient and low cost electrically switched ion exchanger for removing ClO from wastewater[J]. Acs Applied Materials & Interfaces, 2011, 3(9): 3633

[21]董長城,張力,陳東霞,等.基于三維石墨烯的甘油酶生物燃料電池的構建及其性能研究[J].現(xiàn)代食品科技,2017,33(6):173-177 DONG Chang-cheng, ZHANG Li, CHEN Dong-xia, et al.Preparation and properties of glycerol enzymatic biofuel cells based on three-dimensional graphene [J]. Modern Food Science and Technology, 2017, 33(6): 173-177

[22]Yücel A, Ozcan H M, Sa??ro?lu A. A new multi enzyme type biosensor for triglyceride determination [J]. Prep Biochem Biotechnol, 2016, 46(1): 78-84

[23]Pundir C S, Aggarwal V. Amperometric triglyceride bionanosensor based on nanoparticles of lipase, glycerol kinase, glycerol-3-phosphate oxidase [J]. Analytical Biochemistry, 2017, 517: 56-63