不同品種荔枝果肉細(xì)胞抗氧化及抗增殖活性評價

劉冬，劉仁斌，孫海燕，吳丹玲

（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院深圳市發(fā)酵精制檢測系統(tǒng)重點實驗室，廣東深圳 518055）（2.十堰市人民醫(yī)院中醫(yī)科，湖北十堰 442000）

人體新陳代謝的過程中產(chǎn)生自由基，在病理條件下，人體自由基產(chǎn)生系統(tǒng)和清除系統(tǒng)失去平衡，引起自由基過剩，過剩的自由基會引起體內(nèi)的生物大分子（如脂類、蛋白質(zhì)和DNA）的氧化損傷，導(dǎo)致心血管病、白內(nèi)障和早老性癡呆等慢性退行性疾病的發(fā)生，甚至誘發(fā)腫瘤等惡性疾病[1]。實驗研究和流行病學(xué)均表明，水果蔬菜中含有的多酚類、黃酮類等抗氧化物果蔬食品可有效預(yù)防慢性退行性疾病和腫瘤的發(fā)生質(zhì)能有效清除人體內(nèi)過剩的自由基，膳食攝入足量的[2]，因此，水果蔬菜的抗氧化和抗增殖活性評價一直是國內(nèi)外食品科技工作者關(guān)注的熱點領(lǐng)域。

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是我國南方地區(qū)主要的特色水果，除含有多種維生素、有機酸和大量游離氨基酸外，也富含多酚和活性多糖等生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、抗菌、抗炎癥及增強免疫力等多種生理功能[3]。迄今，國內(nèi)外對荔枝抗氧化作用及抗氧化活性成分的研究主要集中在荔枝核、荔枝殼好荔枝果肉多糖上，對荔枝果肉多酚的研究主要集中在多酚的分離鑒定和體外化學(xué)抗氧化活性方面[3]。Zhang等[4]測定了我國南方地區(qū)13種荔枝品種果肉總多酚、總黃酮和其中6種果肉多酚的含量，并采用FRAP法和DPPH自由基清除法評價了不同荔枝品種果肉的體外化學(xué)抗氧化活性；Lv等[5]分析了妃子笑等三種荔枝果肉中總多酚、總黃酮和其中的13種多酚單體的含量，并采用ABTS和DPPH自由基清除法評價了其體外化學(xué)抗氧化活性。

食物抗氧化活性評價方法主要有體外化學(xué)法、動物體內(nèi)實驗法和細(xì)胞學(xué)方法三種。體外化學(xué)評價方法中的ORAC（Oxygen radical absorbance capacity）法由于實驗條件接近人體生理環(huán)境，因此被視為目前抗氧化活性體外化學(xué)評價方法中最為準(zhǔn)確的方法。但由于ORAC評價法是在體外試管中進行的，不能體現(xiàn)食物中抗氧化劑的腸道消化吸收特性、生物利用度、新陳代謝和細(xì)胞生理條件等體內(nèi)生理因素[6]，評價結(jié)果能否用于預(yù)測抗氧化劑在人體內(nèi)抗氧化能力，仍然廣受質(zhì)疑。許多研究也表明，許多在體外具有很高ORAC值的物質(zhì)，在體內(nèi)甚至檢測不到抗氧化效果[7]。采用動物模型體內(nèi)評價食物的抗氧化能力是最準(zhǔn)確的方法，但由于耗時、耗藥量大，不適合用于食物抗氧化能力的初始階段篩選研究。Wolfe等[8]建立了一種基于人肝癌細(xì)胞（HepG2）模型的抗氧化活性細(xì)胞學(xué)定量分析方法（cellular antioxidant activity assay，CAA），該方法由于測定條件與體內(nèi)生理條件相似且部分體現(xiàn)了抗氧化物質(zhì)的吸收代謝特征，測定結(jié)果具有較高的生物相關(guān)性，因而成為當(dāng)前評價食物抗氧化活性的廣泛使用的方法。

綜合分析文獻報道，迄今對荔枝果肉的抗氧化活性評價主要采用體外化學(xué)法，利用細(xì)胞模型全面評價不同荔枝品種果肉的抗氧化活性的研究鮮見報道，而有關(guān)荔枝果肉的抗增殖活性研究則未見報道。因此，本研究擬采用細(xì)胞模型對我國南方地區(qū)主要種植的十種荔枝品種果肉的細(xì)胞抗氧化和抗增殖活性進行全面系統(tǒng)的評價，研究結(jié)果可為進一步探索荔枝果肉的保健功能與活性成分間關(guān)系提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10種荔枝鮮果均在最佳食用時間采摘并進行抗氧化、抗增殖活性評價研究。其中，妃子笑、桂味、糯米糍、淮枝和黑葉產(chǎn)自廣東省深圳市，小米枝、雞咀荔、白蠟、蜜糖糍產(chǎn)自廣東省湛江市，荔枝王產(chǎn)于海南省?？谑?。

HepG2人肝癌細(xì)胞，購自美國 ATCC公司；Folin-ciocalteu試劑（AR）、沒食子酸（AR）、兒茶素（AR）、熒光素鈉鹽（AR）、Trolox（AR）、2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA，AR）、二甲基亞砜（DMSO，AR）、2,2’-偶氮二異丁基脒鹽酸鹽（AAPH，AR）、Hepes（AR）、HBSS、槲皮素（HPLC）、青鏈霉素混合液（100×）、慶大霉素、氫化可的松、胰島素、非必需氨基酸（100×）、臺盼藍（0.4%）、WME（1×）、FBS、胰酶，均購自美國Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96微孔板，購自美國Corning公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HR25850型組織搗碎機，珠海飛利浦電器有限公司；T25 digital ULTRA-TURRAX高速勻漿機，德國IKA公司；5810 R型冷凍離心機，德國Eppendorf公司。HERA Cell 240型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；BHC-ⅡA2生物安全柜，蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；DM IRB型熒光倒置顯微鏡，德國Leica儀器有限公司；Spectra Max M2型連續(xù)光譜密度熒光檢測儀，美國Molecular公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 荔枝果肉總多酚提取

荔枝果肉總多酚提取方法參考吳丹玲等[9]的方法。取凍存荔枝，去梗、去皮、去核后，按料液比1:2（m/V）加入90%濃度的冷丙酮，組織搗碎機（預(yù)冷）搗碎3 min，高速勻漿機12000 r/min勻漿5 min（冰浴），勻漿液在4 ℃、12000 r/min下離心10 min，提取三次，合并離心上清液于45 ℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，以超純水重溶解濃縮物，得荔枝果肉多酚提取液，分裝后置于-80 ℃冰箱貯存待測。

1.3.2 總多酚含量測定

多酚含量測定采用Folin-ocalteu法[10]。分別取提取液及不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL至已加入 400 μL去離子水的試管中，搖勻，加入 100 μL Folin-Ciocalteu試劑，混勻，放置6 min，加入1 mL 7%濃度的Na2CO3溶液和0.8 mL去離子水，混勻，室溫下反應(yīng)90 min，在酶標(biāo)儀上于760 nm測定吸收值?？偡雍坑?mg沒食子酸當(dāng)量/100 g鮮果（mg GAE/100 g鮮果）表示。

1.3.3 總黃酮類含量測定

黃酮類含量測定采用氯化鋁-亞硝酸鈉比色法[10]。分別取提取液及不同濃度的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL到試管中，加入75 μL 5%濃度的NaNO2溶液，混勻靜置6 min后加入150 μL 10%濃度的AlCl3·6H2O溶液，靜置5 min。加入0.5 mL的1 mol/L的NaOH溶液，再加入去離子水使總液量達到3.0 mL，混勻后立刻在酶標(biāo)儀上于510 nm下測定吸收值?？傸S酮類含量用mg兒茶素當(dāng)量/100 g鮮果（mg GE/100 g鮮果）表示。

1.3.4 化學(xué)抗氧化活性測定

荔枝果肉化學(xué)抗氧化活性測定采用氧自由基吸收能力（ORAC）法[11]。分別精確移取20 μL的磷酸緩沖液（空白）、不同質(zhì)量濃度的樣品液或Trolox標(biāo)準(zhǔn)液于96微孔板的相應(yīng)孔中，再將該96孔板置于已預(yù)熱至37 ℃的酶標(biāo)儀中，孵化10 min后按200 μL/孔加0.96 μmol/L的熒光素鈉鹽溶液，再于酶標(biāo)儀中37 ℃孵化20 min后，按20 μL/孔加入119 mmol/L AAPH溶液，最后于激發(fā)波長485 nm，入射波長520 nm下立即讀數(shù)，每4.5 min進行一次讀數(shù)，共檢測2.5 h?；瘜W(xué)抗氧化性活性（ORAC）值用μmol Trolox當(dāng)量/100 g鮮果（μmol TE/100 g鮮果）表示。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)

參照萬紅霞的方法[10]。HepG2人肝癌細(xì)胞用生長培養(yǎng)基（1×WME培養(yǎng)基含5%胎牛血清、10 mmol/L Hepes、5 μg/mL胰島素、0.05 μg/mL氫化可的松、50 U/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素和100 μg/mL慶大霉素）在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，本實驗用細(xì)胞為12～35代之間。

1.3.6 細(xì)胞毒性實驗

采用亞甲基藍染色法[10]。100 μL的HepG2單細(xì)胞懸液接種到 96微孔透明板中（4×104個/孔），5%CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h后，吸出生長培養(yǎng)基，1×PBS清洗貼壁細(xì)胞，加入100 μL不同濃度的荔枝多酚提取物（不同濃度提取物用生長培養(yǎng)基稀釋制備），設(shè)空白對照組（只加入生長培養(yǎng)基）。5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h，吸出提取物，1×PBS清洗貼壁細(xì)胞，加50 μL/孔亞甲基藍溶液（1×HBSS含 1.25%戊二醛和 0.6%亞甲基藍），5% CO2、37 ℃培養(yǎng)60 min，吸出亞甲基藍溶液，將微孔板輕輕浸入去離子水中清洗三次至洗凈細(xì)胞表面吸附的染料。將96孔板倒置在紙巾上控干水分，加100 μL/孔洗脫液（含49% 1×PBS、50%無水乙醇、1%冰醋酸）。將96孔板室溫旋轉(zhuǎn)震蕩20 min，置于多功能酶標(biāo)儀中測定570 nm處的吸收值。如果樣品組比對照組的吸收值顯著性減少（p<0.05）即判斷為水果提取物有細(xì)胞毒性。

1.3.7 細(xì)胞抗氧化活性測定

荔枝果肉的細(xì)胞抗氧化活性評價采用Wolfe的方法[8]。將100 μL對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)物接種到96孔黑壁透明底板中（6×104個/孔），于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，移去殘余生長培養(yǎng)基，1×PBS 清洗1 次。加入100 μL 用處理培養(yǎng)基（1×WME培養(yǎng)基含 2 mmol/L的 L-谷氨酰胺、10 mmol/L的Hepes和25 μmol/L的DCFH-DA）配制的不同稀釋濃度荔枝果肉多酚提取物和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液，空白組和對照組用處理培養(yǎng)基替代樣品提取液。37 ℃、5% CO2條件孵育1 h后，移去殘余處理培養(yǎng)基，然后加入100 μL/孔 1×PBS 清洗一次，加入 100 μL/孔 600 μmol/L 的AAPH溶液（空白組用含10 mmol/L Hepes的HBSS溶液處理），立即于發(fā)射波長538 nm、入射光波長485 nm條件下測定每孔熒光值，每5 min測定，共測定1 h。細(xì)胞抗氧化活性（CAA值）以μmol槲皮素當(dāng)量/100 g鮮果（μmol QE/100 g鮮果）表示。

1.3.8 細(xì)胞抗增殖實驗

荔枝果肉的抗增殖活性評價采用萬紅霞的方法[10]。取100 μL對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接于96孔白板中（2.5×104個/孔），于 37 ℃、5% CO2下培養(yǎng) 4 h后，移去殘余生長培養(yǎng)基，1×PBS清洗1次。加入100 μL用生長培養(yǎng)基配制的不同濃度（須在無細(xì)胞毒性濃度范圍內(nèi)）荔枝果肉多酚提取物和對照組提取液（對照組提取液為用去離子水替代荔枝果肉樣品的提取液），于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)96 h，按上述細(xì)胞毒性實驗方法測定吸收值。荔枝果肉抗細(xì)胞增殖活性分別用細(xì)胞增殖抑制率（%）和半抑制濃度（IC50，mg提取物/mL）表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個樣品3次重復(fù)實驗，實驗結(jié)果表示為平均值±SD，實驗數(shù)據(jù)的顯著性檢驗和相關(guān)性分析分別運用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件的one-way ANOVA法和雙變量相關(guān)進行分析，相關(guān)性用Pearson相關(guān)系數(shù)r表示，p<0.05視為有顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 10種荔枝品種果肉總多酚和總黃酮類含量比較

多酚是人體攝入抗氧化劑的最豐富的來源，總多酚含量也是衡量食物抗氧化能力的最基礎(chǔ)指標(biāo)[15]。10種荔枝品種果肉總多酚含量如表1所示，可見，荔枝品種不同，多酚含量也不同，多酚含量最高的妃子笑是最低的淮枝的2.02倍。迄今，國內(nèi)外研究者已從荔枝果肉中分離鑒定出沒食子酸、咖啡酸、綠原酸、兒茶素、表兒茶素、原花青素A2、原花青素B2、A型原花青素三聚體、B型原花青素二聚體、B型原花青素三聚體、槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、蘆丁、蘆丁-鼠李糖、香蜂草苷、香蜂草苷-鼠李糖、山萘酚-蕓香糖-鼠李糖苷、異鼠李素-3- O-蕓香糖甙、異鼠李素-蕓香糖-鼠李糖苷、山萘酚-蕓香糖苷、原天竺葵素和原飛燕草素等 21種多酚類化合物[3,4,12]。溫葉杰等[13]的研究表明，荔枝果肉多酚提取物中以黃酮類化合物含量為主，其中槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷含量最高，其次是原花青素B2和表兒茶素，三種黃酮類化合物含量總和占荔枝果肉多酚總含量的72.05%。從表1也可看出，不同品種荔枝的果肉黃酮含量有較大差異，黃酮含量最高的妃子笑是最低的淮枝的2.13倍，且多酚與黃酮含量之間呈現(xiàn)極顯著的相關(guān)性（r值0.926，p<0.01）。

表1 10種荔枝品種果肉總多酚和總黃酮含量Table 1 Total phenolics and flavonoids in pulp from ten litchi cultivars

2.2 10種荔枝品種果肉化學(xué)抗氧化活性比較

圖1 10種荔枝品種果肉化學(xué)抗氧化（ORAC）活性（平均值±SD，n=3）Fig.1 ORAC valus of pulp of ten litchi cultivars (mean±SD,n=3)

利用ORAC法對10種荔枝品種果肉的抗氧化活性進行的評價（圖 1）表明，妃子笑具有最大的化學(xué)抗氧化活性O(shè)RAC值（1895.37±235.68 μmol TE/100 g），其后 ORAC值由大到小的順序是小米枝（ 1733.37±154.74 μmol TE/100 g ）、 黑 葉（ 1410.44±192.81 μmol TE/100 g）、 雞 咀 荔（ 1355.26±189.49 μmol TE/100 g ）、 白 蠟（ 1342.18±130.27 μmol TE/100 g）、 糯 米 糍（ 1301.96±42.94 μmol TE/100 g ）、 荔 枝 王（ 1282.31±144.72 μmol TE/100 g）、 蜜 糖 糍（1244.19±142.00 μmol TE/100 g）、桂味（977.00±51.71 μmol TE/100 g）、淮枝（907.84±128.21 μmol TE/100 g）。許多研究都表明，食物的抗氧化活性（ORAC值）與總多酚含量間有顯著的正相關(guān)性[11,14,15]。本文的研究也表明，荔枝果肉ORAC值與多酚和黃酮含量之間具有極顯著的正相關(guān)性（r值分別為 0.984和 0.903，p<0.01）。

2.3 10種荔枝品種果肉細(xì)胞抗氧化活性比較

圖2 10種荔枝品種果肉細(xì)胞抗氧化（CAA）活性（平均值±SD，n=3）Fig.2 CAA valus of pulp from 10 litchi cultivars (mean±SD,n=3)

采用CAA方法對10種荔枝品種果肉的細(xì)胞抗氧化活性評價表明（圖2），妃子笑具有最大的細(xì)胞抗氧化活性CAA值（13.17±1.27 μmol QE/100 g），其后由大到小的順序依次是小米枝（11.42±0.30 μmol QE/100 g）、雞咀荔（7.97±0.69 μmol QE/100 g）、白蠟（7.45±0.10 μmol QE/100 g）、荔枝王（7.42±0.75 μmol QE/100 g）、糯米糍（6.10±0.60 μmol QE/100 g）、蜜糖糍（5.58±0.40 μmol QE/100 g）、黑葉（4.99±0.56 μmol QE/100 g）、桂味（4.45±0.36 μmol QE/100 g）、淮枝（3.78±0.25 μmol QE/100 g），最大是最小的3.78倍。Wolfe等[11]分析了25種水果CAA值與總多酚含量和ORAC值之間的相關(guān)性表明，水果多酚含量與CAA值、ORAC值與CAA值之間都有良好的正相關(guān)性（r值分別為 0.890和0.823，p<0.05）。Song等[14]對27種蔬菜的CAA值與總多酚含量和ORAC值之間的相關(guān)性研究則表明，蔬菜多酚與 CAA值之間呈現(xiàn)良好的正相關(guān)性（r值0.702，p<0.05），但ORAC值與CAA值之間正相關(guān)性較弱（r值0.586，p>0.05）。本文的研究表明，荔枝果肉的CAA值與總多酚含量、總黃酮含量、ORAC之間都有顯著的正相關(guān)性（r值分別為 0.907、0.929、0.927，p<0.01），而且CAA值與黃酮含量之間正相關(guān)性最大，說明荔枝果肉多酚中起細(xì)胞學(xué)抗氧化活性的主要成分可能是黃酮類化合物。Su等人[16]研究表明，荔枝果肉中細(xì)胞抗氧化活性的主要黃酮類物質(zhì)是槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、原花青素 B2、表兒茶素和蘆丁，其中槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷具有最強的細(xì)胞抗氧化活性。

2.4 10種荔枝品種果肉抗腫瘤細(xì)胞增殖活性比較

圖3 10種荔枝品種果肉細(xì)胞增殖抑制率（平均值±SD，n=3）Fig.3 Antiproliferative activities of pulp from 10 litchi cultivars(mean±SD, n=3)

圖4 10種荔枝品種果肉IC50值（平均值±SD，n=3）Fig.4 IC50 of pulp from 10 lichi cultivars (mean±SD, n=3)

10種荔枝品種果肉抗HepG2增殖活性實驗結(jié)果如圖3和圖4所示，可見10種荔枝果肉對HepG2細(xì)胞增殖都有較強的抑制作用，其中妃子笑的抑制作用最強（IC50達到 11.41±0.38 mg/mL），其次是小米枝（20.23±1.13 mg/mL）、白蠟（30.51±3.04 mg/mL）、桂味（30.89±0.84 mg/mL）、淮枝（32.94±4.79 mg/mL）、蜜糖糍（43.85±6.17 mg/mL）、荔枝王（45.59±4.36 mg/mL）、雞咀荔（48.10±4.73 mg/mL）、黑葉（50.56±1.50 mg/mL）、糯米糍（63.10±4.69 mg/mL）。10種荔枝品種果肉提取物對HepG2細(xì)胞的抗增殖活性（IC50）與多酚含量、黃酮含量、ORAC和CAA值之間均呈現(xiàn)較弱的負(fù)相關(guān)性（r值分別為-0.404、-0.539、-0.433和-0.608，p>0.05），說明不能簡單用食物多酚含量、黃酮含量或抗氧化作用來解釋其抗增殖作用，提示可能某些特殊酚類單體或其協(xié)同作用在抗腫瘤細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮主要作用[17,18]。因此，需要進一步開展更深入的研究，以探明這些起抗增殖活性的多酚類單體及其協(xié)同作用機制。

3 結(jié)論

本課題對我國嶺南地區(qū)常見 10種荔枝品種的果肉的細(xì)胞抗氧化活性和抗腫瘤細(xì)胞增殖活性進行了比較研究。研究表明，荔枝果肉多酚含量、黃酮含量、化學(xué)抗氧化活性、細(xì)胞抗氧化活性和抗腫瘤細(xì)胞增殖活性隨荔枝品種不同而不同。荔枝果肉的CAA值與總多酚含量、總黃酮含量、ORAC之間都有顯著的正相關(guān)性（p<0.01），且CAA值與黃酮含量之間正相關(guān)性最大，說明荔枝果肉多酚中起細(xì)胞學(xué)抗氧化活性的主要成分可能是黃酮類化合物。但荔枝果肉對HepG2細(xì)胞的抗增殖活性與總多酚含量、總黃酮含量、ORAC和CAA值之間均呈現(xiàn)較弱的負(fù)相關(guān)性（p>0.05），提示某些特殊酚類單體或其協(xié)同作用在抗腫瘤細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮主要作用。

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