刺五加提取物對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞紫外線輻射損傷的防護(hù)作用

張智，化洪苓，尹文哲，李晴，呂歌，劉洋，武天琦

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）（2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150086）

在現(xiàn)代生活中，紫外線（UV）輻射與我們聯(lián)系緊密，息息相關(guān)。紫外線照射會(huì)對(duì)人體皮膚造成嚴(yán)重傷害，如可影響真皮組織中的膠原及彈力纖維，產(chǎn)生皮膚光老化[1,2]；引起表皮層及真皮淺層的病變，產(chǎn)生日曬紅斑、免疫抑制及皮膚癌[3～5]。目前國內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)是開發(fā)天然的紫外線防護(hù)劑，主要研究的有黃酮類化合物、萜類化合物、鞣質(zhì)類和香豆素類等[6]。張琛等[7]研究枸杞多糖對(duì)中波紫外線輻射的HaCat細(xì)胞具有氧化損傷的保護(hù)作用，可減輕細(xì)胞形態(tài)變化和脫片現(xiàn)象。辛蕾等[8]研究羥基花色素A對(duì)紫外線對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞抗皮膚光老化具有一定的保護(hù)作用。郭硯等[9]研究臧雪蓮多糖可以通過P38絲裂原激活蛋白激酶通路減輕中波紫外線對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥損傷作用。崔礫礫等[10]研究蘋果多酚對(duì)UVB輻射的HepG2細(xì)胞具有防護(hù)作用。喻晶等[11]研究紫外線照射對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷效應(yīng)，顯示在紫外線作用于皮膚細(xì)胞，組織實(shí)質(zhì)產(chǎn)生變化之前，血管細(xì)胞會(huì)先出現(xiàn)異常反應(yīng)[12]。由于HUVEC細(xì)胞對(duì)輻射具有強(qiáng)烈敏感性，因此選用HUVEC細(xì)胞進(jìn)行抗紫外線輻射的研究。

刺五加是我國北方地區(qū)特產(chǎn)常用藥材之一，素有“補(bǔ)中益精、強(qiáng)志意、久服輕身耐勞”等功效。其作為藥物在古醫(yī)書上已有記載，刺五加全身是寶，其根、莖和葉均可入藥[13]，刺五加葉中含有豐富的黃酮類活性物質(zhì)[14]。刺五加在小鼠抗輻射方面已有大量研究，莫琳芳[15]等研究了刺五加多糖對(duì)60Co γ射線輻照大鼠的胃腸道及生殖系統(tǒng)有保護(hù)作用。陳月[16]等研究了刺五加皂苷可減輕經(jīng) X射線照射的小鼠免疫功能的損傷，提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。本實(shí)驗(yàn)擬探討四種刺五加提取物對(duì)經(jīng)紫外線輻射的HUVEC細(xì)胞的預(yù)防和修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 原料

未發(fā)酵刺五加水提物（Unfertilized Acanthopanax Extract，UAE）、未發(fā)酵刺五加醇提物（Unfertized Acanthopanax Alcohol Extract，UAA）、發(fā)酵刺五加水提物（Fermented Acanthopanax Extract，F(xiàn)AE）、發(fā)酵刺五加醇提物（Fermented Acanthopanax Alcohol Extracts，F(xiàn)AA）均由東北林業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室提供。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）由東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司；0.25%胰蛋白酶購自HyClone公司；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；雙抗購自Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自Biosharp公司；非必需氨基酸購自Biotopped公司、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和二甲基亞砜（DMSO）購自天津天力化學(xué)試劑有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測試盒和DNA-Ladder細(xì)胞凋亡試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器設(shè)備

經(jīng)濟(jì)型醫(yī)用離心機(jī)，北京鼎昊源科技有限公司；BCL-1000A型超凈工作臺(tái)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；GL-802A型微型臺(tái)氧式真空泵，其林貝爾儀器制造有限公司；倒置顯微鏡，Olympus公司；酶標(biāo)儀，基因有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，SANYO公司；高速冷凍離心機(jī)，ThermoFisher公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；電泳儀，北京六一儀器廠；722s可見分光光度計(jì)，中國上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

HUVEC細(xì)胞用含10%的FBS、1%的雙抗和1%的非必需氨基酸的DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[17]。0.25%胰蛋白酶消化傳代，隔天換液，3天一傳代。HUVEC細(xì)胞分為空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組（給藥預(yù)防組，給藥修復(fù)組）和輻射組。給藥預(yù)防組于照射前12 h加入不同質(zhì)量濃度的刺五加提取物進(jìn)行孵化。

1.4.2 輻射模型的建立

取生長狀態(tài)良好的HUVEC細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化制得細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/孔，每孔200 μL加入96孔板中，空白對(duì)照組不加細(xì)胞懸液。24 h貼壁后吸出培養(yǎng)液，每孔加入磷酸鹽緩沖液（PBS）200 μL，空白對(duì)照組用錫箔紙覆蓋，實(shí)驗(yàn)組和輻射組接受紫外線輻射，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每組試驗(yàn)重復(fù)三次。紫外燈強(qiáng)度120 μw/cm2，分別照射1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min，輻射后換液培養(yǎng)24 h后用MTT法[18]確定輻射劑量。

輻射劑量(mJ/cm2)=輻射強(qiáng)度(mw/cm2)×輻射時(shí)間(s)

1.4.3 MTT法測刺五加提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響

將對(duì)數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/孔，每孔200 μL加入96孔板中，24 h貼壁后吸出上清液，再分別加入終濃度為50、100、200、400和800 μg/mL的刺五加提取物200 μL，空白對(duì)照組只加入200 μL的DMEM高糖培養(yǎng)基，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每組試驗(yàn)重復(fù)三次，于37 ℃，5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后各孔加入質(zhì)量濃度5 mg/mL的MTT 50 μL，于37 ℃，5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后棄上清，加入150 μL DMSO后振蕩搖勻3～5 min，于酶標(biāo)儀490 nm處測定各孔吸光度值（OD）[19]。根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞存活率[20]。

1.4.4 刺五加提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞紫外輻射損傷的預(yù)防作用

根據(jù)1.4.3，細(xì)胞做相同處理。先加入不同質(zhì)量濃度的刺五加提取物預(yù)孵化12 h[21]后用1.4.2得到的輻射劑量輻射細(xì)胞。再培養(yǎng)12 h后進(jìn)行MTT檢測，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每組試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4.5 刺五加提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞紫外輻射損傷的修復(fù)作用

根據(jù)1.4.3，細(xì)胞做相同處理。根據(jù)1.4.2得到的輻射劑量輻射細(xì)胞后加入不同終質(zhì)量濃度的刺五加提取物細(xì)胞懸液培養(yǎng)24 h后進(jìn)行MTT檢測，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每組試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4.6 MDA和SOD的檢測

根據(jù)1.4.3，細(xì)胞做相同處理后加胰酶消化，收集細(xì)胞，10000 r/min離心5 min，并用PBS液洗2次，放入高速冷凍離心機(jī)中，4 ℃，10000 r/min離心 20 min。離心后，取上清液據(jù)試劑盒說明測定各組 SOD的活性和MDA的含量[22～24]。

1.4.7 DNA-Ladder試驗(yàn)

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 不同輻射劑量對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響

HUVEC細(xì)胞于10%FBS、1%的雙抗和1%的非必需氨基酸的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h后細(xì)胞形態(tài)見圖1a，經(jīng)紫外線輻射后形態(tài)變化如圖b、c、d。

由圖1可知，HUVEC細(xì)胞在96 h后基本達(dá)到對(duì)數(shù)生長期，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞為單層生長細(xì)胞，細(xì)胞貼壁生長，呈梭形，飽滿，鋪路石狀生長。生長匯合后互不重疊，緊密鑲嵌，隨著緊密程度的提高，細(xì)胞體積還會(huì)稍微縮小[25]。經(jīng)過紫外線輻射HUVEC細(xì)胞，細(xì)胞體積變小，胞膜氣泡化，與鄰近細(xì)胞分離，細(xì)胞間連接松散，空隙越來越大，細(xì)胞凋亡。

圖1 HUVEC細(xì)胞形態(tài)Fig.1 The morphology of HUVEC cell

2.2 不同輻射劑量對(duì)細(xì)胞存活率的影響

圖2 不同輻射劑量下的HUVEC細(xì)胞存活率Fig.2 Cell viability of HUVEC cells under different doses of radiation

按1.4.2建立輻射模型，紫外燈管距離HUVEC細(xì)胞垂直15 cm處照射細(xì)胞，時(shí)間分別為1 min、2 min、3 min、4 min、5 min和6 min。經(jīng)MTT染色測數(shù)，得到圖2。

由圖2可知，0～3 min內(nèi)，HUVEC細(xì)胞在紫外線輻射下能促進(jìn)其增殖，在第2 min中達(dá)到最高。第3 min后紫外線輻射開始抑制其增殖，隨著時(shí)間的增加，輻射劑量的累積，細(xì)胞所承受的損傷越大，細(xì)胞存活率快速下降。應(yīng)用SPSS 21.0分析得出在5.5 min時(shí)到達(dá)到半致死劑量，對(duì)應(yīng)的輻射劑量為39.6 mJ/cm2。

2.3 刺五加提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響

取生長狀態(tài)良好的HUVEC細(xì)胞，制成細(xì)胞懸浮液，以每孔2 mL的量將細(xì)胞接種于6孔板上，每孔5×104個(gè)，試驗(yàn)按1.4.3和試劑盒說明進(jìn)行。

圖3 四種刺五加提取物不同質(zhì)量濃度下HUVEC細(xì)胞存活率Fig.3 The cell viability of HUVEC cells at different concentrations of Acanthopanax senticosus extract

2.4 刺五加提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞紫外輻射損傷的預(yù)防作用的結(jié)果

按1.4.4所示方法，經(jīng)過處理的細(xì)胞先加入不同質(zhì)量濃度的四種刺五加提取物孵育12 h后，用紫外線輻射5.5 min，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，經(jīng)MTT測數(shù)得到表2。

由表2可知，對(duì)照組細(xì)胞存活率為49.05%，四種刺五加提取物在低劑量50～200 μg/mL時(shí)，均無顯著影響。

在中劑量200～400 μg/mL時(shí)，UAA，F(xiàn)AE有顯著差異（p<0.05），F(xiàn)AA 有極顯著差異（p<0.01）；在高劑量400～800 μg/mL時(shí)，除了UAE有顯著差異外，其余均有極顯著差異。在最高劑量800 μg/mL時(shí)，UAE僅僅到達(dá)56.64%的存活率與FAE在400 μg/mL時(shí)得細(xì)胞存活率相近。FAA在800 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)到65.67%，與對(duì)照組相比提高了33.88%，抗輻射預(yù)防效果顯著。根據(jù)表2整體趨勢，可看出發(fā)酵組比未發(fā)酵組抗輻射效果顯著；醇提物比水提物抗輻射效果好。

表1 刺五加提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞存活率的影響（±s，n=4）%Table 1 Effects of Acanthopanax senticosus extract on the cell viability of HUVEC cells (ˉx ± s, n = 4)%

表1 刺五加提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞存活率的影響（±s，n=4）%Table 1 Effects of Acanthopanax senticosus extract on the cell viability of HUVEC cells (ˉx ± s, n = 4)%

刺五加提取物質(zhì)量濃度/(μg/mL) UAE UAA FAE FAA對(duì)照組 100.00±2.55 100.00±2.55 100.00±2.55 100.00±2.55 50 101.61±2.57 99.73±1.50 101.13±2.20 101.02±1.68 100 100.81±2.42 99.19±1.68 100.00±1.60 101.29±1.60 200 98.12±0.36 98.06±0.42 99.19±1.68 98.66±0.84 400 97.02±0.82 96.83±1.33 97.72±0.92 97.96±0.54 800 96.72±0.87 96.72±0.95 97.37±1.51 97.07±1.13

表2 刺五加提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞輻射損傷的預(yù)防作用Table 2 Preventive effect of Acanthopanax senticosus extract on the radiation injury of HUVEC cells

2.5 刺五加提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞紫外輻射損傷的修復(fù)作用的結(jié)果

按1.4.5所示方法，經(jīng)過處理的細(xì)胞直接紫外線輻射5.5 min后再加入不同質(zhì)量濃度的四種刺五加提取物孵育24 h，經(jīng)MTT測數(shù)得到表3。

由表3可知，四種刺五加提取物在低劑量50～200 μg/mL時(shí)，均無明顯的抗輻射修復(fù)作用。在中劑量200～400 μg/mL階段，四種刺五加提取物均表現(xiàn)出極顯著差異；在高劑量階段400～800 μg/mL階段細(xì)胞存活率仍在上升，只是逐漸緩慢，可見繼續(xù)增加給藥濃度對(duì)HUVEC細(xì)胞仍有修復(fù)作用，但必須在給藥安全質(zhì)量濃度范圍內(nèi)進(jìn)行。

FAA在800 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率為59.83%，僅為同一條件預(yù)防作用的91.11%。對(duì)比表2和表3，可以得出刺五加提取物在 HUVEC細(xì)胞抗紫外線輻射時(shí)，預(yù)防效果要優(yōu)于修復(fù)效果。

表3 刺五加提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞輻射損傷的修復(fù)作用Table 3 The recovery effect of Acanthopanax senticosus extract on the radiation injury of HUVEC cells

2.6 刺五加提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞中SOD和MDA的影響

根據(jù)2.4和2.5的結(jié)果選取對(duì)HUVEC細(xì)胞作用明顯的高劑量組（400、600、800 μg/mL）來檢測MDA的含量和SOD的活性。結(jié)果見表4～表7。

表4 藥物預(yù)防組對(duì)HUVEC細(xì)胞中MDA含量（nmol/mL）的影響Table 4 Effects of drug prevention group on the MDA content (nmol/mL) in HUVEC cells

表5 藥物修復(fù)組對(duì)HUVEC細(xì)胞中MDA含量（nmol/mL）的影響Table 5 Effects of drug repair group on the MDA content (nmol / mL) in HUVEC cells

由表4和表5可知，紫外線輻射使輻射對(duì)照組的MDA含量較空白對(duì)照組增加，但給藥組均比輻射對(duì)照組降低，隨著給藥濃度的增加，HUVEC細(xì)胞中MDA含量也隨之減少。

MDA間接反映了細(xì)胞受自由基攻擊的程度，降低說明多余自由基已被清除，直接說明了刺五加提取物能有效預(yù)防和修復(fù)紫外線輻射對(duì)HUVEC細(xì)胞帶來的損傷。

由表6和表7可知，輻射對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，SOD活性顯著降低。但給藥組均比輻射對(duì)照組增加，隨著給藥濃度的增加，HUVEC細(xì)胞中MDA含量也隨之遞增。SOD間接反映了細(xì)胞清除自由基的能力，SOD活性的增強(qiáng)直接說明了刺五加提取物能有效預(yù)防和修復(fù)紫外線輻射對(duì)HUVEC細(xì)胞帶來的損傷。

SOD是需氧生物體內(nèi)的一種含金屬離子的酶蛋白，其功能為催化超氧自由基的歧化反應(yīng)，對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用[16]。MDA是脂質(zhì)過氧化過程中的代謝產(chǎn)物，其生成量間接反應(yīng)過氧化氫對(duì)細(xì)胞的損傷程度，它可在膜內(nèi)形成交聯(lián)，使膜成分多聚化，進(jìn)而導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)和流動(dòng)性改變，通透性上升[26]。SOD活性與MDA含量經(jīng)常一起反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)自由基的清除情況。經(jīng)紫外線輻射，HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生大量多余自由基，刺五加提取物可以降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量，增加SOD活性，減緩了細(xì)胞的凋亡，其結(jié)果與盧芳[22]和顧曉蘇[27]一致。

表6 藥物預(yù)防組對(duì)HUVEC細(xì)胞中SOD活力（U/mL）的影響Table 6 Effects of drug prevention group on the activity of SOD (U/mL) in HUVEC cells

表7 藥物修復(fù)組對(duì)HUVEC細(xì)胞中SOD活力（U/mL）的影響Table 7 Effects of drug repair group on the activity of SOD (U/mL) in HUVEC cells

2.7 DNA-Ladder評(píng)價(jià)細(xì)胞DNA損傷

圖4 刺五加提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞輻射損傷的預(yù)防作用Fig.4 Preventive effect of Acanthopanax senticosus extract on the radiation injury of HUVEC cells

圖5 刺五加提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞輻射損傷的修復(fù)作用Fig.5 Effects of Acanthopanax senticosus extract on the radiation injury of HUVEC cells

按1.4.7進(jìn)行DNA-Ladder檢測細(xì)胞凋亡，運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)拍照，結(jié)果如圖4和圖5。

紫外線輻射造成細(xì)胞凋亡的機(jī)制已有大量研究，其中主要熱點(diǎn)為絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，紫外線可將其激活，是調(diào)節(jié)紫外線誘導(dǎo)多重細(xì)胞反應(yīng)中的關(guān)鍵因素[28,29]。MAPK主要由四個(gè)家族組成，其中其中p38介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和凋亡在維護(hù)表皮完整性和對(duì)抗紫外線誘導(dǎo)的腫瘤效應(yīng)方面具有重要作用[30]。刺五加提取物含有大量的黃酮類成分，是天然的強(qiáng)抗氧化劑。猜想加入干預(yù)后可抑制p38MAPK途徑活化和炎癥因子分泌，進(jìn)而減輕紫外線輻射造成的細(xì)胞凋亡。

圖4為藥物預(yù)防組的DNA條帶，從左至右分別為 DNA Marker：DL2000、空白對(duì)照組、800 μg/mL、600 μg/mL、400 μg/mL組、輻射組。由圖4可知，經(jīng)紫外線輻射后，不同的給藥濃度處理后均產(chǎn)生典型的DNA條帶。空白對(duì)照組（未經(jīng)紫外線輻射）與輻射組比較，未產(chǎn)生DNA-Ladder明顯條帶，說明空白對(duì)照組 DNA含量多且完整；輻射組則有明顯的DNA-Ladder凋亡條帶。給藥組三個(gè)濃度均比輻射組條帶有所改善。隨著給藥濃度的增加，DNA凋亡減少。同理圖5為藥物修復(fù)組的DNA條帶，組內(nèi)趨勢與給藥預(yù)防組相同。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果分析，可見刺五加提取物可有效的預(yù)防和修復(fù)經(jīng)紫外線輻射對(duì)HUVEC細(xì)胞的損傷，且與給藥濃度呈劑量依賴性關(guān)系。

紫外線現(xiàn)已成為主要的輻射傷害源，紫外線引起的皮膚光老化的主要機(jī)制有：氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、膠原和彈性蛋白的降解等。由于紫外線損傷是皮膚健康的主要危險(xiǎn)因素，也是皮膚衰老過程的主要原因，保護(hù)人體皮膚免受紫外線損傷具有重要價(jià)值[31]。刺五加提取物中含有大量的皂苷類成分，主要包括紫丁香苷，金絲桃苷和齊墩果酸等，此外還含有豐富的黃酮類活性成分，均具有優(yōu)良的抗氧化抗衰老作用。為解釋刺五加提取物抗輻射作用提供一定的理論支持。

3 結(jié)論

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是重要的輻射敏感細(xì)胞，用其構(gòu)建紫外線輻射模型可有效的解釋和說明刺五加提取物抗紫外線輻射的能力。經(jīng)試驗(yàn)HUVEC細(xì)胞半致死紫外線輻射劑量為39.6 mJ/cm2，質(zhì)量濃度≤800 μg/mL均為安全濃度，在其范圍內(nèi)不會(huì)因?yàn)榇涛寮幼陨硪餒UVEC細(xì)胞的凋亡。刺五加提取物可有效預(yù)防和修復(fù)經(jīng)紫外線輻射后的HUVEC細(xì)胞，減少其凋亡數(shù)量，DNA-Ladder試驗(yàn)出現(xiàn)明顯的凋亡條帶。FAA在給藥預(yù)防組濃度800 μg/mL時(shí)，可提高細(xì)胞存活率33.88%，預(yù)防組效果均優(yōu)于修復(fù)組。通過SOD水平和MDA含量可協(xié)同反映出刺五加提取物含有有效的天然抗氧化成分，為開發(fā)天然抗氧化劑提供一定參考依據(jù)。

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