蜜蜂巢脾多糖理化性質(zhì)及其對免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用分析

殷玲，吉挺，戰(zhàn)旭梅，李冠華

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院食品科技學院，江蘇泰州 225300）（2.揚州大學動物科技學院，江蘇揚州 225009）

蜜蜂發(fā)育會經(jīng)過卵、幼蟲、蛹到成蟲的一系列過程。由于蛻皮激素與保幼激素的作用，蜜蜂在每個發(fā)育階段必然經(jīng)歷若干次的蛻皮過程，蛻下的繭衣緊緊依附于巢房的內(nèi)壁，蜜蜂成蟲后會殘留下蛹退下的繭衣和一些排泄的物質(zhì)；同時巢房也是蜜蜂貯存食物的場所，蜂蜜、蜂膠、花粉和王漿等物質(zhì)也殘留在巢房中。因此，巢脾成分十分復雜，研究顯示蜜蜂巢脾含有大量的生物活性成分，如多糖、有機酸、生物堿、鞣質(zhì)以及苷類等[1～3]。蜜蜂巢脾具有抑菌殺菌，殺蟲攻毒，祛風鎮(zhèn)痛，降血壓，降血脂，抗氧化等多種生物學及藥理學價值[4～6]。我國是世界第一養(yǎng)蜂大國，養(yǎng)蜂生產(chǎn)淘汰下來的巢脾數(shù)量相當可觀，但巢脾常被用來提取蜂蠟，而其中的其它活性物質(zhì)卻被丟棄，造成了極大的資源浪費。同時由于對巢脾的基礎(chǔ)性研究、藥理學研究十分匱乏，巢脾的深加工推廣應用還有很多問題，制約了巢脾制品的規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。近年來，隨著人們對天然多糖研究的深入，天然多糖所具有的調(diào)節(jié)人體免疫、抗氧化、抗腫瘤和降低固醇等各種生理功能逐漸為人們所重視[7～10]，多糖已經(jīng)開始在食品、功能性保健品和藥物等領(lǐng)域進行開發(fā)應用[11,12]。蜜蜂巢脾多糖（下文簡稱巢脾多糖）是蜜蜂巢脾中的主要功效成分，有著重要的開發(fā)價值和廣闊的應用空間，而目前對于蜂巢多糖的生物活性及開發(fā)應用仍處于空白。本試驗對初步純化后的巢脾多糖進行理化性質(zhì)、急性毒性及對免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用進行分析，以期為蜜蜂巢脾多糖的生物活性及開發(fā)應用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西方蜜蜂老巢脾（使用三年以上）。

氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、咔唑、溴化鉀、乙腈、甲醇、磷酸二氫鈉均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；三氟乙酸（TFA）、1-苯基-3-甲基-5-吡啉酮（PMP）、單糖標準品均為色譜純，購自上海源葉生物科技有限公司。

綿羊紅細胞，南京森貝伽生物科技公司；小鼠免疫球蛋白IgG試劑盒，上海遠幕生物科技公司；豚鼠血清（補體）上海遠幕生物科技公司。

丙二醛（MDA）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測定試劑盒、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒均購自南京建成生物制藥研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計T6，北京普析通用儀器有限公司；雙光束紫外可見分光光度TU-1901，北京普析通用儀器有限公司；高效液相色譜1260，德國安捷倫公司；顯微紅外光譜儀670，美國Varian公司；全波長掃描式多功能讀數(shù)儀，美國Thermo公司。

1.3 實驗動物

SPF級KM小鼠，雌雄各半，共100只，6～8周齡，體重 18～22 g，購自揚州大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(蘇)2012-0004。使用小鼠全價顆粒飼料飼喂，飲用無菌水，環(huán)境安靜，室溫維持在20 ℃左右，通風良好。

1.4 方法

1.4.1 提取蜜蜂巢脾多糖

粉碎的蜜蜂巢脾→按1:15比例加入蒸餾水→50 ℃水浴鍋水浴90 min→120目紗布過濾→重復三次→濃縮至→冷卻離心→1:4無水乙醇→4 ℃靜置過夜→取沉淀離心→蜜蜂巢脾粗多糖→去色素→去蛋白→濾去離子等小分子雜質(zhì)→蜜蜂巢脾多糖

1.4.2 多糖基本理化性質(zhì)的測定

1.4.2.1 基本組成測定

分別采用費林試劑反應及硫酸-苯酚法測定蜜蜂巢脾多糖中還原糖及總糖含量；利用三氯化鐵反應及碘-碘化鉀反應分別檢測多羥基酚類物質(zhì)及淀粉；考馬斯亮藍法檢測蛋白質(zhì)含量；硫酸-咔唑法檢測糖醛酸含量；pH計在室溫下測其pH值；不同極性溶液檢測其溶解性。

液相色譜條件[13]，色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，250 mm×4.6 mm×5 μm；流動相：0.1 mol/L磷酸二氫鉀（pH 6.7）緩沖液-乙腈（0～18 min體積比為82:18，18～40 min體積比為83:17）；柱溫：25 ℃；檢測波長：250 nm；流速：1 mL/min；進樣體積：20 μL。檢測器：DAD。

1.4.2.2 光譜分析

采用紫外光譜和紅外光譜判斷蜜蜂巢脾的多糖結(jié)構(gòu)。巢脾多糖樣品（0.05 mg/mL）置于紫外可見分光光度計中190 nm～380 nm波長處進行掃描。巢脾多糖（充分干燥粉末）少許，加入少許溴化鉀晶體，在紅外燈照射下于瑪瑙研缽中輕輕研磨至極細，用壓片機壓制成透明薄片，經(jīng)顯微紅外光譜儀 400～4000 cm-1中紅外區(qū)掃描。

1.4.3 小鼠經(jīng)口急性毒性實驗[14]

1.4.3.1 霍恩氏法

按照GB 15193.3-2014進行急性經(jīng)口毒性試驗。采用霍恩氏法進行預實驗，選取SPF級KM小鼠12只，分為三組，每組4只，雌雄各半。試驗用巢脾多糖低劑量組為100 mg/kg，中劑量組1000 mg/kg，高劑量組10000 mg/kg。實驗組給藥設(shè)為24 h內(nèi)2～4次灌胃一次，灌胃量為20 mL/kg，實驗過程中禁食不禁水5 h后灌胃，連續(xù)觀察24 h動物的活動狀態(tài)，呼吸，采食和分泌物。實驗中若出現(xiàn)小鼠死亡，則按照動物死亡的情況進行霍恩氏法實驗測定LD50，若無死亡則采用限量法繼續(xù)實驗。

1.4.3.2 限量法

SPF級KM小鼠，按性別分別稱體重，隨機分為實驗組和對照組，每組十只，雌雄各半，實驗前禁食不禁水6 h。以巢脾多糖濃度10000 mg/kg，按照20 mL/kg的給藥量，24 h內(nèi)灌胃給藥。對照組采取同樣方法給予相同劑量的蒸餾水。每隔2 d測定小鼠體重，連續(xù)觀察14 d，記錄給藥后動物活動、飲食情況、精神狀態(tài)、不良反應情況、動物死亡數(shù)和死亡時間。實驗結(jié)束室，眼眶取血檢查血液常規(guī)指標，尸檢動物觀察各臟器有無異常。

1.4.4 動物的分組與處理

SPF級KM小鼠70只，雌雄各半，將小鼠隨機分組，分別為空白對照組、模型對照組、陽性對照組及巢脾多糖高劑量組（200 mg/kg）、中劑量組（100 mg/kg）、中低劑量組（50 mg/kg）以及低劑量組（25 mg/kg）。除空白對照組外，各組小鼠第1、2、3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，建立免疫抑制小鼠模型。給免疫抑制的小鼠連續(xù)7 d灌胃巢脾多糖，陽性對照組灌胃鹽酸左旋咪唑(40 mg/kg)，在實驗結(jié)束前3 d免疫動物，每只腹腔注射2%的綿羊紅細胞0.2 mL，3 d后用眼眶取血法采血，放入4 ℃冰箱中保存，隔天取上層血清備用。

1.4.5 血清溶血素與免疫球蛋白IgG檢測

將小鼠血清 1:100稀釋于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)各100 μL，與加入5%的綿羊紅細胞50 μL和10%補體50 μL混勻，置于37 ℃溫水育30 min后，冰水終止反應，以不加補體的空白管作對照，取上清液 540 nm測OD值（A540），數(shù)據(jù)進行t檢驗[15]。酶聯(lián)免疫法檢測血清中免疫球蛋白IgG。

1.4.6 血清抗氧化能力檢測

按照試劑盒方法測定血清中 MDA、T-SOD及CAT。

1.5 統(tǒng)計方法

采用spss 19.0對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蜜蜂巢脾多糖理化性質(zhì)鑒定

2.1.1 蜜蜂巢脾多糖基本組成

圖1 巢脾多糖水解樣品-PMP衍生化產(chǎn)物的HPLC譜圖Fig.1 HPLC spectrum of PMP derivative products of comb polysaccharide

經(jīng)計算巢脾多糖中總糖含量為75.77%，蛋白質(zhì)的含量為13.82%，糖醛酸的含量為0.19%，還原糖的含量為 4.20%，不含淀粉及多酚類物質(zhì)。該多糖的 pH值為7.06，呈中性。可溶于水、稀酸及稀堿，不溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機溶液。

HPLC分析結(jié)果如圖1所示，巢脾多糖中含有甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖，其摩爾比為：0.08:0.09:0.11:0.05:0.03:0.08:1.00:0.84:0.11:3.04。其中阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖含量最高，半乳糖醛酸含量最低（表1）。

表1 巢脾多糖的單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of comb polysaccharide

2.1.2 光譜分析

圖2 巢脾多糖的紫外光譜圖Fig.2 Ultraviolet spectrum of comb polysaccharide

圖3 巢脾多糖的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum of comb polysaccharide

紫外光譜掃描結(jié)果見圖2：在波長380 nm～190 nm中，未出現(xiàn)明顯的特征吸收峰，吸光度值隨著波長的縮短而增大，直至190 nm處出現(xiàn)最大吸收值。

紅外光譜是一種有效研究分子官能團特征的手段。用來檢測化合物結(jié)構(gòu)的紅外光譜通常指波數(shù)在4000～400 cm-1之間的中紅外光譜。其具有高度的特征性，能夠測定分子內(nèi)部原子間的相對振動和分子轉(zhuǎn)動等信息，是研究聚合物結(jié)構(gòu)和化學鍵，表征或鑒別不同化合物的常用手段之一。由于多糖的結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，所以多糖的紅外光譜具有某些相同的特征吸收峰。通過對一些特征峰的分析，對于多糖結(jié)構(gòu)中是否含有這些殘基或大致判斷結(jié)構(gòu)類型還是有一定的幫助的。巢脾多糖的紅外光譜圖如圖3所示，結(jié)果顯示巢脾多糖具有典型的多糖特征吸收峰（3387.3 cm-1，2934.4 cm-1，1413.4 cm-1，772.3 cm-1）[16]。在 3387.3 cm-1處出現(xiàn)的寬峰為分子間和分子內(nèi)羥基（O-H）伸縮振動特征峰[17]，2934.4 cm-1處吸峰收為糖鏈中飽和甲基或亞甲基（C-H）伸縮振動峰[18]，1413.4 cm-1處吸收峰為N-H的變角振動峰，772.3 cm-1處吸收峰為C-X伸縮振動[19]。此外，1630.2 cm-1處吸峰收為C=O伸縮振動峰，表明該多糖為糖蛋白綴合物[20,21]。而在1700 cm-1～1775 cm-1范圍內(nèi)無明顯吸收峰，表明樣品中不含梭基，即該多糖是一種中性糖[18]。1075.9 cm-1處吸收峰可能是吡喃糖環(huán)的特征吸收峰[19]，891.3 cm-1處有吸收說明該多糖存在β型吡喃糖苷[17]。

2.2 蜜蜂巢脾多糖急性毒性

2.2.1 預實驗

24 h內(nèi)各預試驗組小鼠均存活，小鼠表征無明顯變化，因此不需測定LD50，改為進行限量法實驗測定MTD值。

2.2.2 限量法實驗

觀察期內(nèi)小鼠體重變化情況如表1所示。

表2 巢脾多糖對實驗小鼠體重的影響Table 2 Effects of comb polysaccharide on the body weights of mice

由上圖得知兩組小鼠給藥前后體重變化，p>0.05，無統(tǒng)計學差異。且在喂食期間，小鼠活動如常，被毛潔白光澤緊貼皮膚，眼紅明亮，肌肉緊張有力豐滿，尿便正常，無小鼠死亡。本實驗按照限量法以劑量10000 mg/kg連續(xù)灌胃14 d，觀察期內(nèi)在此劑量下小鼠無任何不良反應，認為巢脾多糖的MTD值大于10000 mg/kg，此劑量相當于500 g/人，據(jù)此按照GB 15193.5-2014可判定巢脾多糖為無毒物質(zhì)[14]。

2.3 蜂巢多糖對免疫抑制小鼠免疫調(diào)節(jié)影響

血清溶血素高低反映了被綿羊紅細胞免疫后的小鼠特異性體液免疫功能[15]。與正常對照組相比較，模型組中溶血素抗體含量顯著降低（p<0.01），表明造模成功；與模型組相比，陽性對照組和巢脾多糖各劑量組溶血素抗體含量顯著升高（p<0.01或 p<0.05），其中巢脾多糖灌胃劑量100 mg/kg時，溶血素抗體含量極顯著升高（p<0.01），其OD值達0.09。表明巢脾多糖能夠提高免疫抑制小鼠血清中溶血素抗體的含量，從而增強免疫低下小鼠的免疫功能。在體液免疫中，B細胞在抗原刺激下轉(zhuǎn)化為漿細胞，合成免疫球蛋白，免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）分為IgG、IgM、IgA、IgE、IgD五類。IgG是最典型的抗體，親和力高，分布廣，是機體重要的抗菌、抗病毒、抗毒素抗體[22]。但實驗結(jié)果顯示巢脾多糖對免疫抑制小鼠免疫球蛋白IgG無顯著影響，巢脾多糖對免疫抑制小鼠免疫調(diào)節(jié)作用機理還需要進一步研究。

表3 巢脾多糖對免疫抑制小鼠溶血素抗體及IgG生成的影響(±s，n=10)Table 3 Effects of comb polysaccharide on the level of hemolysir and IgG in serum of immunosuppressive mice

表3 巢脾多糖對免疫抑制小鼠溶血素抗體及IgG生成的影響(±s，n=10)Table 3 Effects of comb polysaccharide on the level of hemolysir and IgG in serum of immunosuppressive mice

注：*p<0.05，**p<0.05。

組別 劑量/(mg/kg) OD值(平均值) IgG OD值空白對照組 - 0.12±0.01** 0.39±0.04**模型對照組 - 0.01±0.00 0.13±0.01陽性對照組 - 0.10±0.01* 0.34±0.04**低劑量組 25 0.03±0.01* 0.13±0.01中低劑量組 50 0.07±0.01* 0.13±0.01中劑量組 100 0.09±0.01** 0.13±0.01高劑量組 200 0.05±0.01* 0.12±0.01

2.4 巢脾多糖對免疫抑制小鼠血清中抗氧化能力的影響

機體的抗氧化能力與機體的免疫功能密切相關(guān)，某些內(nèi)源性自由基反應能通過自由基修飾免疫細胞膜上的受體、細胞分化和活性相關(guān)的微管系統(tǒng)，可逆地抑制免疫功能[23]。有研究表明，使用抗氧化劑可以提高免疫細胞微管系統(tǒng)的工作能力，提高機體細胞免疫與體液免疫[24]。多糖對物理、化學及生物來源的多種活性氧具有清除作用，提高抗氧化酶活性及機體抗氧化能力。巢脾多糖對免疫抑制小鼠血清中抗氧化能力的影響結(jié)果如表4所示。與模型組相比，巢脾多糖各劑量組小鼠血清的SOD、CAT值明顯的提高、MDA值顯著降低(p<0.01或p<0.05)，中劑量組（100 mg/kg）小鼠血清抗氧化能力提高最為明顯，此劑量下小鼠血清SOD活性提高到125.07 U/mg prot，CAT活性提高到13.85 U/mL，MDA活性降低至4.89 nmol/mL，與模型組相比存在極顯著差異(p<0.01)。本實驗結(jié)果顯示，巢脾多糖能顯著提高免疫抑制小鼠血清中 SOD和CAT的活性，并降低MDA的含量，表明其能提高機體抗氧化能力，有效預防機體的脂質(zhì)過氧化，同時促進了免疫抑制小鼠的免疫力恢復和提高。

表4 巢脾多糖對小鼠血清中SOD、CAT及MDA的影響(±s，n= 10)Table 4 Effects of comb polysaccharide on the level of SOD, CAT and MDA in serum of immunosuppressive mice (ˉx ± s, n = 10)

表4 巢脾多糖對小鼠血清中SOD、CAT及MDA的影響(±s，n= 10)Table 4 Effects of comb polysaccharide on the level of SOD, CAT and MDA in serum of immunosuppressive mice (ˉx ± s, n = 10)

注：*p<0.05，**p<0.05。

組別 劑量/(mg/kg) SOD含量/(U/mgprot) CAT含量/(U/mL) MDA含量/(nmol/mL)空白組 - 148.39±1.69** 17.01±1.57** 3.88±0.23**模型對照組 - 94.57±0.57 4.08±0.01 6.72±0.03陽性對照組 - 132.01±1.19** 15.81±1.36* 5.83±0.20*低劑量組 25 100.69±0.39* 4.67±0.15* 6.03±0.92中低劑量組 50 109.40±1.82* 5.87±0.26* 5.47±0.89*中劑量組 100 125.07±0.52** 13.85±0.66** 4.89±0.96**高劑量組 200 118.53±1.38** 7.83±0.40* 5.08±0.92**

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，巢脾總糖含量為75.77%，蛋白質(zhì)含量為13.82%，糖醛酸含量為0.19%，還原糖含量4.20%，該多糖由甘露糖、硫酸氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成，是一種不含淀粉和多酚類物質(zhì)的多糖，是無毒物質(zhì)。同時初步證實蜜蜂巢脾多糖能顯著降低環(huán)磷酞胺對小鼠的免疫抑制作用，通過提高小鼠血清中SOD和CAT的活性，并降低MDA的含量來提高環(huán)磷酞胺所致的免疫損傷小鼠的抗氧化能力，劑量為100 mg/kg的巢脾多糖的作用最為顯著。本研究為巢脾多糖的開發(fā)利提供理論依據(jù)和參考，而巢脾多糖對免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)的構(gòu)效關(guān)系及其活性作用機理有待于進一步探索。

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