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    6-姜烯酚誘導(dǎo)SW480凋亡及對(duì)APC基因表達(dá)的影響

    2018-03-13 09:36:04王宇鋒楊春陳超鞏發(fā)海孫書豪李海
    現(xiàn)代食品科技 2018年2期
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)箱直腸誘導(dǎo)

    王宇鋒,楊春,陳超,鞏發(fā)海,孫書豪,李海

    (1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,寧夏銀川 750004)(2.上海兒童醫(yī)學(xué)中心,上海 200127)(3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院,寧夏銀川 750004)

    結(jié)直腸腫瘤(Colorectal neoplasms)是目前最常見的惡性腫瘤之一,每年大約有120萬人被診斷出患病率也在呈逐年上升趨勢(shì),并且已和世界平均水平相當(dāng),但治愈率仍然偏低[2]。在《2012年中國(guó)腫瘤登記有結(jié)直腸癌,而且此類疾病是多因素、多基因、多分子信號(hào)參與的復(fù)雜性過程[1]。在我國(guó),結(jié)直腸癌的發(fā)年報(bào)》中指出,前10名癌癥每10萬人發(fā)病數(shù)結(jié)直腸腫瘤占據(jù)第三位,僅次于肺癌、胃癌,并且在前 10名癌癥每10萬人死亡數(shù)結(jié)直腸腫瘤占據(jù)第五位[3]。目前來說,結(jié)直腸腫瘤的治療仍以西醫(yī)手術(shù)切除為主,并輔以放、化療,但不良反應(yīng)居多,對(duì)患者本身及預(yù)后造成十分大的影響。隨著中醫(yī)藥學(xué)的不斷發(fā)展進(jìn)步,中醫(yī)藥類對(duì)結(jié)直腸腫瘤的治療也凸顯出十分大的優(yōu)勢(shì),尤其在抑制腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡方面發(fā)揮著不錯(cuò)的療效[4]。

    生姜是姜科多年生草本植物姜(Zingiber officinale Roscoe)的新鮮根莖,高40~100 cm,品種居多,別名又稱姜根、百辣云、勾裝指、因地辛、炎涼小子、鮮生姜和蜜炙姜等[5]。在中醫(yī)藥學(xué)中,姜的根莖(干姜)、栓皮(姜皮)、葉(姜葉)均可入藥,還具有發(fā)散、止嘔、止咳和驅(qū)寒等功效[6]。6-姜烯酚作為生姜中提取的主要活性成分,因其優(yōu)異的生物活性和極高的穩(wěn)定性越來越受到廣泛的關(guān)注。近年來有報(bào)道稱,6-姜烯酚是抗腫瘤藥,對(duì)多種腫瘤如前列腺癌[7]、胃癌[8]、非小細(xì)胞肺癌[9]、皮膚癌[10]和乳腺癌[11]等都十分有效。

    本研究擬通過檢測(cè)不同濃度 6-姜烯酚對(duì) SW480干預(yù)表達(dá)作用及APC的表達(dá)變化,進(jìn)而探討6-姜烯酚在抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞增殖中的相關(guān)可能機(jī)制,旨在為中醫(yī)藥聯(lián)合西醫(yī)手術(shù)及與放、化療的綜合治療提供必要的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

    6-姜烯酚純度97%,購自于成都德瑞可生物科技有限公司;Leibovitz細(xì)胞培養(yǎng)液、Ausbian胎牛血清(FBS)原裝進(jìn)口于以色列;0.3%過氧化氫溶液購于中杉金橋;PAGE、SDS購于武漢博士德;雙抗(青霉素加鏈霉素)、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗,CCK8試劑盒、BCA蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自于南京凱基生物公司;脫脂牛奶、ECL、TEMED購于新西蘭生物公司;0.45 μm PVDF膜、抗APC抗體(兔抗人,1:1500稀釋)購于Thermo公司;PBS、甲醇、TBST、Tris-甘氨酸緩沖液購自于銀川偉博鑫化學(xué)試劑有限公司;30%聚丙烯酰胺購于 Bio-Rad Laboratories(Berkeley,CA);細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購于凱基生物公司。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

    超凈工作臺(tái)(Bio-Rad,型號(hào)ESCO AC2);凝膠成像儀(Tanon 4200);紫外可見酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad,型號(hào):770);XSE電子分析天平(常州天之平儀器,型號(hào):DSH-50);倒置熒光顯微鏡(美國(guó)Thermo,型號(hào):Discover.V22);細(xì)胞溫室培養(yǎng)箱(Bio-Rad,型號(hào)03793-6732);液氮罐(河南天池儀器,型號(hào):YDS-20);全自動(dòng)高壓鍋(日本 SANYO,型號(hào):MLS-3750);高速冷凍離心機(jī)(Bio-Rad,型號(hào) 5435R);臺(tái)式水平搖床(上海赫田科學(xué)儀器,型號(hào)HTS-10)。

    1.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

    人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480購自于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫,由北京中原公司提供,單層貼壁生長(zhǎng),集落形成率40%,裸鼠致瘤性100%。細(xì)胞培養(yǎng)條件:10%胎牛血清的 Leibovitz培養(yǎng)基、含 100 U/mL鏈霉素和 100 μg/mL青霉素,置于37 ℃、95% O2、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與常規(guī)培養(yǎng)

    細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒,紫外照射 40 min以上,Leibovitz培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒溫水浴箱37 ℃預(yù)熱20 min,備用。二甲基亞砜(DMSO)在40 ℃冰箱中冷藏30 min,備用。從液氮保存罐中取出凍存管,立即放入37.5 ℃水浴中,快速搖晃,直至凍存液完全融化,然后將細(xì)胞懸液移入15 mL離心管,緩慢加入4 mL培養(yǎng)液,離心(1000 r/min,5 min)。用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度,方培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并記錄復(fù)蘇日期。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%以上時(shí),用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞,以1:3或1:4傳代,次日取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用。

    1.2.2 分組藥物干預(yù)

    設(shè)立五組不同濃度藥物干預(yù)組:SW480-對(duì)照、SW480-6姜烯酚(5 μM)、SW480-6姜烯酚(10 μM)、SW480-6姜烯酚15 μM)、SW480-6姜烯酚(20 μM)組,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,于倒置相差顯微鏡下觀察不同濃度 6-姜烯酚對(duì)不同分組SW480增殖的影響及細(xì)胞形態(tài)的不同變化。

    1.2.3 CCK8法制作細(xì)胞抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線

    在96孔板中配置100 μL的SW480細(xì)胞懸液,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h。次日向96孔培養(yǎng)板加入10 μL不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如:6、12、24或48 h),每孔加入10 μL CCK8溶液。最后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1~4 h,并用酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm處的吸光度。制作出一條以細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.4 提取細(xì)胞蛋白,并測(cè)定蛋白含量

    將上述不同藥物干預(yù)組細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,消化、收集細(xì)胞,提取各組細(xì)胞蛋白,并檢測(cè)蛋白濃度,按照每4 μL蛋白樣品加入1 μL 5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液比例混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液,于100 ℃水浴鍋中煮3~5 min,充分變性蛋白質(zhì),備用。

    1.2.5 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

    貼壁細(xì)胞,先用胰酶消化,細(xì)胞計(jì)數(shù)后取5×105~1×106個(gè)/mL細(xì)胞,1000 r/min,4 ℃離心10 min,棄去上清液,加入1 mL預(yù)冷的PBS,輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮,再次1000 r/min,4 ℃離心10 min,棄上清。重復(fù)以上步驟兩次,將細(xì)胞重懸于 200 μL Binding Buffer,加入10 μL Annexin V-FITC輕輕混勻,避光室溫反應(yīng)15 min。加入300 μL Binding Buffer(總反應(yīng)體積500 μL)以及5 μL PI,在1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

    1.2.6 細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡周期

    采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)細(xì)胞凋亡,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組,并收集各分組細(xì)胞,用PBS洗滌細(xì)胞2次,并2000 r/min,4 ℃離心5 min,棄去上清液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL細(xì)胞,取1 mL單細(xì)胞懸液,去除上清液,細(xì)胞中加入體積分?jǐn)?shù)為70%冷乙醇500 μL固定,過夜,4 ℃保存,染色前用PBS洗去固定液,加入 100 μL RNaseA 37 ℃水浴 30 min,再加入 400 μL PI染色均勻,4 ℃避光保存30 min,最后上機(jī)在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)處記錄紅色熒光檢測(cè)。

    1.2.7 Western-Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

    根據(jù)所測(cè)蛋白樣品濃度,將蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳80 V,2 h(濃縮膠5%、分離膠10%),然后電轉(zhuǎn)液中濕性電轉(zhuǎn)120 V、0.5 h,電轉(zhuǎn)至PVDF膜,4%脫脂奶粉37 ℃封閉1.5 h,水平搖床搖勻,加入相應(yīng)的抗體 APC(1:1500稀釋)、β-actin(1:1000稀釋),4 ℃孵育過夜。應(yīng)用1% TBST洗膜,加入相應(yīng)的二抗(山羊抗兔)進(jìn)行免疫雜交反應(yīng),室溫孵育2 h,再用1% TBST洗膜后,化學(xué)發(fā)光(ECL),顯影,定影,在暗室凝膠成像儀下曝光成像并進(jìn)行凝膠圖像分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用ANOVA方差分析,p≤0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 6-姜烯酚可明顯抑制SW480細(xì)胞增殖

    不同分組 SW480加入 6-姜烯酚干預(yù)后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中培養(yǎng)24 h,在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)變化(放大倍數(shù):40×100 倍)。

    結(jié)果顯示(圖1),與對(duì)照組相比,隨著6-姜烯酚濃度的升高,SW480-6姜烯酚組細(xì)胞數(shù)明顯減少,甚至在6-姜烯酚(20 μM)時(shí),仍然可以明顯抑制細(xì)胞增殖。表明6-姜烯酚可以抑制SW480增殖,且隨濃度增加,抑制效果增加。

    圖1 顯微鏡下不同濃度6-姜烯酚干預(yù)SW480 24 h后細(xì)胞的形態(tài)變化(±s,n=3)Fig.1 Morphological changes of SW480 induced by different concentrations of 6-shogoal for 24 h (±s, n=3)

    2.2 CCK8法制作不同分組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

    圖2 CCK8法檢測(cè)不同濃度6-姜烯酚對(duì)SW480增殖能力的調(diào)控(±s,n=3)Fig.2 Proliferation of SW480 at different concentrations of 6-shogoal by CCK8 assay (24 h)

    培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1~4 h,并用酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm處的吸光度。CCK8法檢測(cè)顯示細(xì)胞的光密度明顯下降與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。結(jié)果顯示(圖 2),與陰性對(duì)照組相比,SW480-6姜烯酚(5 μM)、SW480-6姜烯酚(10 μM)、SW480-6姜烯酚15 μM)、SW480-6姜烯酚(20 μM)組細(xì)胞數(shù)明顯減少,尤其是SW480-6姜烯酚(20 μM)細(xì)胞數(shù)家減少更為明顯(p<0.05);隨著6-姜烯酚的濃度升高,可呈濃度依賴性地抑制細(xì)胞增殖(p<0.05)。

    2.3 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)6-姜烯酚誘導(dǎo)SW480凋亡

    圖3 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度6-姜烯酚誘導(dǎo)人SW480凋亡(±s,n=3)Fig.3 Apoptosis of SW480 at different concentrations of 6-shogoal by Annexin V-FITC/pI flow cytometry (±s, n=3)

    Nidhi等[12]研究 6-姜烯酚在人皮膚癌細(xì)胞 A431中的具體作用,發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚可以產(chǎn)生活性氧(ROS),從而降低線粒體膜電位水平,調(diào)節(jié)凋亡基因Bax/Bcl-2的比率,誘導(dǎo)皮膚癌細(xì)胞A431發(fā)生凋亡,抑制細(xì)胞增殖。同時(shí)還有專家Debrup[13]也證實(shí)了6-姜烯酚可以使處理過的Hela細(xì)胞活性減弱,并發(fā)生形態(tài)學(xué)改變,同時(shí)誘導(dǎo)DNA構(gòu)象發(fā)生改變,促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)的各分組細(xì)胞(SW480)分別上流式細(xì)胞儀檢測(cè),從熒光雙參數(shù)點(diǎn)圖可以觀察(圖3a),其中右上象限、右下象限為死亡細(xì)胞數(shù),圖 3b顯示的是不同分組的死亡細(xì)胞數(shù)。在 SW480各分組細(xì)胞中,隨著6-姜烯酚的濃度增加,死亡細(xì)胞數(shù)明顯不同程度增加(p<0.05)。從而證實(shí)6-姜烯酚可以誘導(dǎo)SW480發(fā)生凋亡,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。

    2.4 細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒檢測(cè) 6-姜烯酚誘導(dǎo)SW480凋亡后細(xì)胞周期改變

    本實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)的各分組細(xì)胞(SW480)分別上流式細(xì)胞儀檢測(cè),從表1可以觀察不同濃度6-姜烯酚作用于SW480 24 h后,細(xì)胞增殖周期中各期細(xì)胞構(gòu)成發(fā)生明顯變化。其中 G0/G1期的細(xì)胞數(shù)由對(duì)照組的53.97%下降到37.42%和20.76%(p<0.05),而G2/M期的細(xì)胞數(shù)由對(duì)照組2.96%增加到33.81%和51.61%(p<0.05),提示SW480細(xì)胞被阻斷在G2/M期。

    表1 細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同濃度6-姜烯酚誘導(dǎo)人SW480凋亡細(xì)胞周期變化(±s,n=3)Table 1 Cell cycle changes of apoptosis of SW480 at different concentrations of 6-shogoal by cell cycle detection kit(±s,n=3)

    表1 細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同濃度6-姜烯酚誘導(dǎo)人SW480凋亡細(xì)胞周期變化(±s,n=3)Table 1 Cell cycle changes of apoptosis of SW480 at different concentrations of 6-shogoal by cell cycle detection kit(±s,n=3)

    注:##p<0.01 vs 對(duì)照組, *p<0.05, **p<0.01 vs 對(duì)照組.

    濃度/μM G0/G1/%S/% G2/M/%0 59.37 ± 0.88 37.67 ± 0.33 2.96 ± 0.33 5 50.46 ± 1.48* 38.57 ± 1.36* 10.97 ± 0.75*10 42.09 ± 0.87* 31.73 ± 1.29* 26.18 ± 1.21*15 37.42 ± 1.19* 28.77 ± 0.91* 33.81 ± 1.59*20 20.76 ± 1.07* 27.63 ± 0.69* 51.61 ± 1.37*

    2.5 6-姜烯酚可促進(jìn)APC的表達(dá)

    圖4 Western-blot檢測(cè)不同濃度6-姜烯酚對(duì)SW480中APC表達(dá)的影響(±s,n=3)Fig.4 Effects of 6-shogoal on the expression of APC in SW480 by Western-blot(±s, n=3)

    楊平等[14]在研究藤黃酸抑制人結(jié)腸癌及與 APC表達(dá)關(guān)系中指出,藤黃酸可以在不同時(shí)間不同濃度下促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,并且與激活A(yù)PC的表達(dá)密切相關(guān),同時(shí)也闡述了APC基因的表達(dá)可能是藤黃酸抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。同時(shí),國(guó)內(nèi)學(xué)者劉楊等[15]也提出了散發(fā)性大腸腺瘤性息肉患者糞便中 APC基因突變表達(dá)有助于大腸腺瘤性息肉的篩查,與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示如圖 4(a、b)所示,與對(duì)照組(1組)比較,Western-blot檢測(cè)不同濃度的6-姜烯酚對(duì)APC表達(dá)呈現(xiàn)不同程度升高(p<0.05),與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

    3 結(jié)論

    3.1 APC基因是一個(gè)很大的管家基因(housekeeping gene),也屬于一種腫瘤抑制基因,全長(zhǎng)含有一個(gè)8538 bp開放式可讀框架,共15個(gè)外顯子,其中6個(gè)可變地表達(dá)。其中第15外顯子獨(dú)自含有6571個(gè)bp,組成77%的編碼區(qū),是人類已知最大外顯子,它共編碼2843個(gè)氨基酸,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA分子為8.9 kb,在很多細(xì)胞和組織中均有表達(dá)。APC蛋白可結(jié)合微管,在細(xì)胞分裂和移動(dòng)中起作用[16]。APC還可通過調(diào)控周期素依賴周期素激酶復(fù)合物活性而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,通過誘導(dǎo)凋亡而介導(dǎo)其在結(jié)腸腺瘤發(fā)生中作用,故被譽(yù)為結(jié)腸上皮完整性的分子性“門衛(wèi)”(molecular “gatekeeper”)[17]。有報(bào)道稱[18],APC基因的突變可改變APC蛋白與β連環(huán)蛋白及E鈣黏附蛋白之間的平衡,導(dǎo)致細(xì)胞細(xì)胞、細(xì)胞基質(zhì)之間黏附作用以及接觸抑制信號(hào)傳遞的改變,引起細(xì)胞分裂與細(xì)胞死亡之間的平衡失調(diào),以致生長(zhǎng)失控,成為結(jié)直腸癌一個(gè)限速分子因素。

    3.2 中藥及其提取物的生物活性成分具有毒副作用小、殘留少、藥理作用強(qiáng)、藥性溫和等特點(diǎn),當(dāng)今,中藥在抗腫瘤方面的獨(dú)特作用,尤其是機(jī)制方面的研究更是越來越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[19]。中藥可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖,主要是通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的原癌基因和抑癌基因的表達(dá),進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的相關(guān)凋亡通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖周期抑制來實(shí)現(xiàn)的[20]。有報(bào)道顯示,6S具有抗炎,鎮(zhèn)痛,解熱,抗氧化劑和抗癌的特性。在小細(xì)胞肺癌 A-549細(xì)胞系中,6S可以通過抑制AKT/mTOR通路誘發(fā)腫瘤細(xì)胞自我吞噬[21]。另外,Tan等[22]表明,6S可通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ而抑制乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。Park等[23]報(bào)道,6S可通過靶向TBK1抑制TRIF依賴信號(hào)通路。在人體、動(dòng)物和腫瘤細(xì)胞系,6S的重要代謝路徑是硫醇尿酸路徑,6S最初通過谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與谷光甘肽(GSH)形成共軛化合物。其半胱氨酸共軛衍生物M14較6S具有更強(qiáng)的抑制結(jié)腸癌生長(zhǎng)作用,在結(jié)腸癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)M14較其母體毒性降低。

    3.3 為進(jìn)一步了解 6-姜烯酚可能參與結(jié)直腸腫瘤凋亡的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)檢測(cè)了不同濃度的6-姜烯酚對(duì)人SW480的細(xì)胞增殖影響作用,發(fā)現(xiàn)在不同濃度6-姜烯酚的作用下,均可對(duì) SW480造成明顯的抑制作用,而且隨著藥物濃度增加,SW480凋亡細(xì)胞數(shù)也不同程度的增加,表明了 6-姜烯酚對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。同時(shí)也證實(shí)了6-姜烯酚可不同程度地抑制SW480的DNA合成和有絲分裂,致使SW480細(xì)胞增殖周期阻斷在G2/M期,這種周期阻滯會(huì)與腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)停滯關(guān)系密切相關(guān),當(dāng)腫瘤細(xì)胞自身不能修復(fù)或完全修復(fù)不了時(shí),細(xì)胞就會(huì)生長(zhǎng)停滯直至凋亡。

    3.4 本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了6-姜烯酚抑制人SW480細(xì)胞增殖可能與激活A(yù)PC的表達(dá)有關(guān),然而6-姜烯酚具體的抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞機(jī)制或APC直接(間接)與哪些通路有關(guān)尚未明確,仍需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來探討證實(shí)6-姜烯酚的具體抗結(jié)直腸腫瘤作用機(jī)制。隨著6-姜烯酚及其藥理活性的不斷深入研究,進(jìn)一步明確6-姜烯酚誘導(dǎo)結(jié)直腸腫瘤凋亡的機(jī)制,同樣可以成為篩選抗癌藥物的新靶點(diǎn)和新熱點(diǎn),也可為今后臨床治療提供切實(shí)有效的依據(jù)。

    [1]沈文艷,姚建國(guó),于亞威,等.結(jié)直腸高級(jí)別MANEC和NEC的臨床病理特征及預(yù)后[J].實(shí)用腫瘤雜志,2017, 32(2):141-147 SHEN Wen-yan, YAO Jian-guo, YU Ya-wei, et al.Clinicopathological features and prognosis of colorectal high-grade MANEC and NEC [J]. Journal of Practical Oncology, 2017, 32(2): 141-147

    [2]楊奕夫.結(jié)直腸病死率和并發(fā)癥率的生理學(xué)及手術(shù)嚴(yán)重性評(píng)分在結(jié)直腸癌診療中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)微創(chuàng)外科雜志,2017,17(5):458-460 YANG Yi-fu. Advances in physiology and severity of colorectal cancer mortality and complication rates in colorectal cancer diagnosis and treatment [J]. Chinese Journal of Minimally Invasive Surgery, 2017, 17(5): 458-460

    [3]許敬堯.結(jié)直腸腫瘤 WHO分類新進(jìn)展以及診斷與鑒別診斷[C]//浙江省病理學(xué)術(shù)年會(huì),2013 XU Jing-yao. New progress in WHO classification and diagnosis and differential diagnosis of colorectal cancer [C]//annual meeting of Pathology Society of Zhejiang, 2013

    [4]王偉.中藥在治療腫瘤方面的作用及其有效成分分析[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2017,36(3):109-109 WANG Wei. Effect of Chinese herbal medicine on the treatment of tumor and analysis of its effective components[J]. Chinese Medicine of Inner Mongolia, 2017, 36(3): 109-109

    [5]Wilson R, Haniadka R, Sandhya P, et al. Ginger (Zingiber officinale, Roscoe) the dietary agent in skin care: a review[M]. Bioactive Dietary Factors and Plant Extracts in Dermatology, Humana Press, 2013

    [6]趙文竹,李思慧,宋寶雯,等.生姜多糖類物質(zhì)的提取及抗氧化活性研究[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2017,8(4):1357-1362 ZHAO Wen-zhu, LI Si-hui, SONG Bao-wen, et al. Studies on extraction and antioxidant activities of polysaccharides from ginger [J]. Journal of Food Safety and Quality Control, 2017,8(4): 1357-1362

    [7]Chen H, Fu J, Chen H, et al. Ginger compound [6]-shogaol and its cysteine-conjugated metabolite (M2) activate Nrf2 in colon epithelial cells in vitro and in vivo [J]. Chemical Research in Toxicology, 2014, 27(9): 1575-85

    [8]Zick S M, Djuric Z, Ruffin M T, et al. Pharmacokinetics of 6-,8-, 10-Gingerols and 6-Shogaol and conjugate metabolites in healthy human subjects [J]. Cancer epidemiology, biomarkers& prevention: a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology, 2008, 17(8): 1930

    [9]Kim S O, Kundu J K Shin Y K, Park J H, et al. (6)-Gingerol inhibits COX-2 expression by blocking the activation of p38 MAP kinase and NF-kappaB in phorbol ester-stimulated mouse skin [J]. Oncogene, 2005, 24(15): 2558-67

    [10]Luo X J, Xuan-Rong M O, Zhou L L. The effect of Hsp72 on IL-6,IL-8 expression and activation of NF-κB in synoviocytes of rheumatoid arthritis [J]. Chinese Journal of Applied Physiology, 2012, 28(4): 336

    [11]Kim S O, Chun K S, Kundu J K, et al. Inhibitory effects of[6]-gingerol on PMA-induced COX-2 expression and activation of NF-kappaB and p38 MAPK in mouse skin [J].Biofactors, 2004, 21(4): 27-31

    [12]Nigam N, Bhui K, Prasad S, et al. [6]-Gingerol induces reactive oxygen species regulated mitochondrial cell death pathway in human epidermoid carcinoma A431 cells [J].Chemico-Biological Interactions, 2009, 181(1): 77

    [13]Chakraborty D, Bishayee K, Ghosh S, et al. [6]-Gingerol induces caspase 3 dependent apoptosis and autophagy in cancer cells: drug-DNA interaction and expression of certain signal genes in HeLa cells [J]. European Journal of Pharmacology, 2012, 694(1-3): 20-29

    [14]楊平,曹杰,張通,等.藤黃酸抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖過程中 APC 蛋白的表達(dá)變化[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2013,13(6):726-728,736 YANG Ping, CAO Jie, ZHANG Tong, et al. Gambogic acid inhibits APC protein on proliferation of human colon cancer SW480 cells the expression of [J]. Tropical Med., 2013, 13(6):726-728736

    [15]劉楊,鞏陽,林一帆,等.散發(fā)性大腸腺瘤性息肉患者糞便中APC基因突變的意義及與中醫(yī)體質(zhì)的關(guān)系[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2017,5:327-331 LIU Yang, GONG Yang, LIN Yi-fan, et al. Significance of APC gene mutations in feces of sporadic colorectal adenomatous polyps and its relationship with constitution of Chinese medicine [J]. Chinese Journal of Integrative Medicine Digest, 2017, 5: 327-331

    [16]Sansregret L, Patterson J O, Dewhurst S, et al. APC/C dysfunction limits excessive cancer chromosomal instability[J]. Cancer Discovery, 2017, 7(2): 218

    [17]Liu S, Tackmann N R, Yang J, et al. Disruption of the RP-MDM2-p53 pathway accelerates APC loss-induced colorectal tumorigenesis [J]. Oncogene, 2017, 36(10): 1374

    [18]Gausachs M, Borras E, Chang K, et al. Mutational Heterogeneity in APC and KRAS Arises at the Crypt level and Leads to Polyclonality in Early Colorectal Tumorigenesis[J]. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, 2017

    [19]邱淑敏,陳濤,劉美玲,等.中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,1:83-86 QIU Shu-min, CHEN Tao, LIU Mei-ling, et al. Advances in research on mechanism of chinese medicine inducing apoptosis of tumor cells [J]. Advances in Animal Medicine,2015, 1: 83-86

    [20]苗久旺,張欽德.姜黃素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑研究進(jìn)展[J].陜西中醫(yī),2014,12:1692-1694 MIAO Jiu-wang, ZHANG Qin-de. Progress in signal pathway of curcumin inducing apoptosis of tumor cells [J].Chinese Medical Science of Shaanxi, 2014, 12: 1692-1694

    [21]Hung J Y, Hsu Y L, Li C T, et al. 6-Shogaol, an active constituent of dietary ginger, induces autophagy by inhibiting the AKT/mTOR pathway in human non-small cell lung cancer A549 cells [J]. J. Agric. Food Chem.,2009, 57(20): 9809-9816

    [22]Tan B S, Kang O, Mai C W, et al. 6-Shogaol inhibits breast and colon cancer cell proliferation through activation of peroxisomal proliferator activated receptor gamma (PPAR gamma) [J]. Cancer Lett., 2013, 336:127-139

    [23]Park S J, Lee M Y, Son B S, et al. TBK1-targeted suppression of TRIF-dependent signaling pathway of Toll-like receptors by 6-shogaol, an active component of ginger [J]. Biosci., Biotechnol., Biochem., 2009, 73(7):1474-1478

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