牦牛Cyclin D1基因的克隆及IGF-I對(duì)其在睪丸支持細(xì)胞表達(dá)的影響

王亞營(yíng)，潘陽(yáng)陽(yáng)，葉小琳，李谷月，何翃閎，王 萌，樊江峰，崔 燕，余四九

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

牦牛是能夠適應(yīng)高寒低氧環(huán)境的珍稀物種，主要分布在我國(guó)青藏高原海拔3 000 m以上的地區(qū)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但其自然繁殖率低，限制了牧區(qū)的發(fā)展。在牦牛上應(yīng)用輔助生殖技術(shù)(Assisted reproductive technology，ART)是提高其繁殖率的重要手段，而雄性牦牛提供高質(zhì)量的精子是體外繁殖成功的前提。睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cell，SC)是唯一與生精細(xì)胞(Germ cell，GC)直接接觸的體細(xì)胞，其共同構(gòu)成睪丸曲細(xì)精管。睪丸支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)上緊密相連構(gòu)成了血-睪屏障(Blood-testis barrier，BTB)，為生殖細(xì)胞的發(fā)育提供獨(dú)特的微環(huán)境[1]。睪丸支持細(xì)胞產(chǎn)生一系列蛋白質(zhì)來(lái)調(diào)控垂體激素的釋放，從而影響生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的活性并促進(jìn)精子的釋放[2]，對(duì)生精過(guò)程起到至關(guān)重要的調(diào)控作用。成年雄性動(dòng)物睪丸的大小、生殖細(xì)胞的數(shù)量以及精子質(zhì)量與SC的數(shù)量直接相關(guān)[3]。

細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的一系列蛋白質(zhì)。細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)高表達(dá)于細(xì)胞G1期，與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4和6(Cyclin-dependent kinase4/6，CDK4/6)結(jié)合，形成Cyclin D1-CDK4/CDK6復(fù)合物，之后與磷酸化的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Phosphorylation retinoblastoma protein，pRb)結(jié)合，使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。G1/S是細(xì)胞周期中重要的時(shí)間點(diǎn)，其決定細(xì)胞是否進(jìn)行分裂增殖[4-5]。研究表明，Cyclin D1促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡[6]。將小鼠胚胎干細(xì)胞中CyclinD1基因的部分外顯子用非編碼序列替換，得到缺乏Cyclin D1蛋白的突變鼠，其在發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出生殖障礙等多種癥狀[7]。胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(Insulin-like growth factor-I，IGF-I)是一種促生長(zhǎng)因子，對(duì)生殖器官的功能起到重要的調(diào)控作用。IGF-I通過(guò)調(diào)控Bax和Bcl-2等凋亡相關(guān)基因，降低了卵丘細(xì)胞[8]、卵母細(xì)胞[9]和睪丸間質(zhì)細(xì)胞[10]等的凋亡率，同時(shí)還提高精子在低溫環(huán)境中的運(yùn)動(dòng)能力及冷凍復(fù)蘇的活性[9,11]。IGF-I顯著提高牦牛凍精活性和體外授精胚胎的囊胚產(chǎn)量，并且降低了囊胚中細(xì)胞凋亡比率[12-13]。缺乏胰島素受體(Insulin Receptor，InsR)和胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(Insulin-like growth factor Receptor，IGFR)的小鼠，睪丸支持細(xì)胞增殖率降低，從而導(dǎo)致精子產(chǎn)量降低，成年后睪丸的尺寸比正常鼠小75%[14]。IGF-I在維持與生殖相關(guān)細(xì)胞的正常生理功能方面發(fā)揮著重要作用，然而IGF-I是否調(diào)控睪丸支持細(xì)胞中周期相關(guān)蛋白的表達(dá)尚不清楚，牦牛CyclinD1基因的克隆及生物信息學(xué)分析在國(guó)內(nèi)外也尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以牦牛睪丸支持細(xì)胞為研究對(duì)象，克隆牦牛CyclinD1基因的CDS序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；同時(shí)研究IGF-I對(duì)Cyclin D1在睪丸支持細(xì)胞中表達(dá)的影響。研究結(jié)果將為調(diào)控睪丸支持細(xì)胞的發(fā)育提供試驗(yàn)依據(jù)，為探索精子發(fā)生機(jī)制和提高精子質(zhì)量奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))、PCR 儀(Rio-Rad，美國(guó))、熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國(guó))、倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)；DMEM/F-12、胎牛血清(Fetal Bovine serum，F(xiàn)BS)(Gibco)；胰蛋白酶、膠原蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、IGF-I(Sigma)；總RNA提取試劑盒(Omega)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、GoTaq Green Master Mix(Promega)；膠回收試劑盒(GenStar)；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、pMD 18-T Vector(TaKaRa)；Fasl多克隆兔抗、CyclinD1多克隆兔抗以及羊抗兔多克隆抗體(博奧森)。

1.2 樣品采集及細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

2016年10月在青海省西寧市樂(lè)家灣屠宰場(chǎng)，采取健康5～8月齡(此階段為牛睪丸支持細(xì)胞的增殖分化期)牦牛的睪丸樣品。獲得樣品后，將其放入生理鹽水(含雙抗)中，再置于冰盒密封，4 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，并對(duì)其進(jìn)行處理。牦牛睪丸支持細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)與鑒定參考M.D.Anway等[15]和H.Zhang等[16]的操作方法，采用兩次酶消化法獲得睪丸支持細(xì)胞，20 mmol·L-1Tris-Hcl低滲處理和饑餓培養(yǎng)以純化細(xì)胞，再用含10% FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%以上融合時(shí)，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104·mL-1，爬片培養(yǎng)48 h，采用Fasl免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定細(xì)胞。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中牛(Bostaurus)的CyclinD1和β-actin序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)牦牛的CDS序列擴(kuò)增引物Cyclin D1-C、熒光定量檢測(cè)引物Cyclin D1-Y和β-actin內(nèi)參引物。引物序列送上海華大基因科技公司合成。引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列

Table 1 Primer sequences of target and reference genes

引物Primer引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物大小/bpProductsize退火溫度/℃TmCyclinD1-CF:CCCAACCATGGCACACCR:CCCAACCATGGCACACC100960CyclinD1-YF:CGGTGTCCTACTTCAAGTGTGTGR:GACAGGAAGCGGTCCAGGTA14860β-actinF:AGGCTGTGCTGTCCCTGTATGR:GCTCGGCTGTGGTGGTAAA20058

1.4 牦牛CyclinD1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

當(dāng)原代SC生長(zhǎng)至80%以上融合時(shí)，提取細(xì)胞總的RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于冰箱-20 ℃，保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板， Cyclin D1-C為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，GoTaq Green Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收，將純化后的DNA與pMD 18-T Vector 載體連接，轉(zhuǎn)染到JM109感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)獲得的菌液，送至上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成之后，將結(jié)果進(jìn)行拼接，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用NCBI在線軟件Open reading frame finder(ORF Finder)對(duì)基因進(jìn)行開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF)分析；利用MEGA7.0軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；利用 DNAMAN對(duì)核苷酸和氨基酸的同源性進(jìn)行分析。

1.5 細(xì)胞免疫熒光法對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行定位

選取純化后的牦牛SC，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104·mL-1進(jìn)行細(xì)胞爬片。培養(yǎng)48 h后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，置于冰箱，4 ℃過(guò)夜；0.5%Tritonx-100透化1 h；1%BSA溶液室溫封閉2 h；CyclinD1抗體稀釋液(1∶100)孵育細(xì)胞，冰箱4 ℃過(guò)夜；二抗稀釋液(1∶100)孵育細(xì)胞，室溫2 h；5 ng·mL-1的DAPI染細(xì)胞核3 min；置于倒置熒光顯微鏡下拍照。每個(gè)步驟之間用PBS將玻片洗凈，且二抗孵育后應(yīng)避光操作。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)CyclinD1基因表達(dá)

選取純化后的牦牛SC，以1×105·mL-1的細(xì)胞密度接種于6孔板中，每孔接種2 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h(使細(xì)胞全部處于靜止期)后，加入IGF-I，使其終濃度分別為0、25、50、100、150 ng·mL-1，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，24 h后提取細(xì)胞總RNA。IGF-I作用時(shí)間根據(jù)牦牛睪丸支持細(xì)胞分裂周期選取[16]。反轉(zhuǎn)錄后，將cDNA濃度調(diào)至200 ng·μL-1，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)CyclinD1 mRNA的表達(dá)。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，Rox Reference DyeⅡ 0.4 μL，ddH2O 7.6 μL，共20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s,60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.7 Western blotting檢測(cè)CyclinD1蛋白表達(dá)

細(xì)胞培養(yǎng)及因子作用等與1.6中相同，提取細(xì)胞總蛋白。獲得的蛋白質(zhì)樣品與蛋白上樣緩沖液(4×)按3∶1混合，置于100 ℃溫箱中，煮10 min，使蛋白質(zhì)充分變性；變性后的蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離；在300 mA恒定電流條件下，將凝膠上的目的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上；用5%脫脂奶粉溶液，將膜封閉2 h；Cyclin D1抗體4 ℃孵育過(guò)夜；二抗常溫孵育2 h；加電化學(xué)發(fā)光顯色液(Electrochemi- luminescence, ECL)避光顯色，X光片曝光，掃描蛋白條帶。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 牦牛睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

純化培養(yǎng)獲得原代牦牛SC(圖1 A)和三代SC(圖1 B)，均生長(zhǎng)良好。Fasl免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示，F(xiàn)asl蛋白在該細(xì)胞表達(dá)呈陽(yáng)性(圖1 C)，陰性對(duì)照不表達(dá)(圖1 D)，由此可確定試驗(yàn)所用為純度較高的牦牛睪丸支持細(xì)胞。

A. 原代SC； B. 三代SC；C. Fasl陽(yáng)性表達(dá)；D.陰性對(duì)照A. The first generation of SC；B. The third generation of SC；C. Positive staining for Fasl；D. Negative control圖1 牦牛睪丸支持細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定(標(biāo)尺：100 μm)Fig.1 The cultivation and identification of the yak Sertoli cells (Scale bar: 100 μm)

2.2 CyclinD1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

Cyclin D1-C進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳顯示，預(yù)期位置有明顯熒光條帶(圖 2)。利用NCBI在線軟件BLAST對(duì)拼接后的序列進(jìn)行比對(duì)，Cyclin D1-C擴(kuò)增產(chǎn)物序列與牛的CyclinD1(NM_001046273.2)序列為99%相似。將牦牛CyclinD1序列提交至GenBank，登錄號(hào)為KY 420723。

ORF分析表明，該基因編碼區(qū)長(zhǎng)888 bp，起始密碼子在8 bp處，終止密碼子在895 bp處，編碼295個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示(圖3)，牦牛CyclinD1基因與瘤牛、黃牛和水牛的親緣關(guān)系最近，與山羊和綿羊次之，與人和貓的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。同源性分析結(jié)果表明(表2)：牦牛Cyclin D1核苷酸序列同源性與黃牛和瘤牛的最高，為99.9%；與人的最低，為92.2%。牦牛Cyclin D1氨基酸序列同源性與黃牛、瘤牛和水牛的同源性均為100%，與人的同源性為93.5%。

M. DL2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2. Cyclin D1 基因擴(kuò)增產(chǎn)物M. DL2000 DNA marker; 1-2. Cyclin D1 RT-PCR products圖2 牦牛Cyclin D1基因的RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gels electrophoresis results of Cyclin D1 RT-PCR products

圖3 Cyclin D1 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of Cyclin D1

2.3 Cyclin D1蛋白在SC中的分布與定位

細(xì)胞免疫熒光顯示(圖4)，Cyclin D1蛋白在SC胞核上高表達(dá)，部分細(xì)胞核中呈強(qiáng)表達(dá)，在SC胞質(zhì)上呈極微弱表達(dá)。

表2 牦牛和不同物種間CyclinD1基因序列和氨基酸序列同源性比較

Table 2 Homologous comparisons of nucleotide and amino acids sequences of yakCyclinD1 gene with that of other species %

A. Cyclin D1；B. DAPI；C.合成A. Cyclin D1；B. DAPI；C. Merge圖4 牦牛SC Cyclin D1蛋白表達(dá)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)(標(biāo)尺：100 μm)Fig.4 The detection of Cyclin D1 protein on yak SC by immunofluorescence method (Scale bar: 100 μm)

2.4 IGF-I對(duì)牦牛SC 中Cyclin D1 mRNA的調(diào)節(jié)

IGF-I作用于體外培養(yǎng)的SC，對(duì)獲得的樣品進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示(圖5)：IGF-I濃度為25和150 ng·mL-1時(shí)，CyclinD1 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，前者表現(xiàn)促進(jìn)，后者表現(xiàn)抑制；IGF-I濃度為50和100 ng·mL-1時(shí)，CyclinD1 mRNA表達(dá)量顯著高于其他各組(P<0.05)，其中50 ng·mL-1組的表達(dá)量最高，為對(duì)照組的1.65倍。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)；相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Different letters mean significant difference (P<0.05); same letter means no significant difference (P>0.05). The same as below圖5 不同濃度IGF-I對(duì)Cyclin D1 mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Effect of different concentration of IGF-I on Cyclin D1 mRNA expression

2.5 IGF-I對(duì)牦牛SC 中Cyclin D1 蛋白的調(diào)節(jié)

不同濃度IGF-I加入體外培養(yǎng)的SC，作用24 h，對(duì)獲得的蛋白樣品進(jìn)行Western blotting，結(jié)果顯示(圖6和7)：與對(duì)照組相比， IGF-I作用組的Cyclin D1蛋白的表達(dá)量均有提高，IGF-I濃度為100 ng·mL-1組蛋白表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，IGF-I濃度為25、50和150 ng·mL-1組蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中，50 ng·mL-1組的蛋白表達(dá)量最高，為對(duì)照組的1.20倍。

1～5. 0、25、50、100、150 ng·mL-1 IGF-I1-5.0, 25, 50, 100, 150 ng·mL-1 IGF-I圖6 Cyclin D1和β-actin蛋白檢測(cè)Fig.6 The detection of Cyclin D1 and β-actin protein

圖7 不同濃度IGF-I對(duì)Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of different concentration of IGF-I on Cyclin D1 protein expression

3 討 論

本研究成功克隆出牦牛CyclinD1基因的CDS序列(GenBank登錄號(hào)：KY 420723)。生物信息學(xué)分析顯示，牛屬動(dòng)物CyclinD1核酸序列同源性達(dá)到99%以上，氨基酸序列完全一致，與其他物種相比均有較高同源性，表明CyclinD1基因在進(jìn)化過(guò)程中具有保守性。 Cyclin D1蛋白在細(xì)胞中呈周期性表達(dá)，于G1期表達(dá)量最高。異步生長(zhǎng)的人成纖維細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示， Cyclin D1蛋白在絕大多數(shù)細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)，且定位于細(xì)胞核[17]。本研究中，用于免疫熒光檢測(cè)的SC未做同步生長(zhǎng)處理，其結(jié)果顯示，絕大多數(shù)細(xì)胞核中高表達(dá)Cyclin D1蛋白，這與前人的研究結(jié)果一致，但胞核中Cyclin D1的熒光強(qiáng)度并不同，可能由于細(xì)胞處于周期進(jìn)程中的不同階段。

A. Dance等[18]通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)證明，IGF-I促進(jìn)體外培養(yǎng)的牛SC數(shù)目增殖。本研究則從分子水平進(jìn)行探究，分析不同濃度的IGF-I對(duì)牦牛睪丸支持細(xì)胞中Cyclin D1基因和蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示：添加IGF-I后，Cyclin D1基因和蛋白的表達(dá)量總體上升，且具有劑量依賴性，表明IGF-I可以通過(guò)調(diào)控Cyclin D1的表達(dá)，促進(jìn)SC周期進(jìn)程，引起細(xì)胞增殖；但高濃度的IGF-I可能激活了抑制Cyclin D1表達(dá)的途徑，在本研究中，IGF-I 為150 ng·mL-1時(shí)，試驗(yàn)組CyclinD1 mRNA表達(dá)量低于對(duì)照組(P>0.05)，可能與PI3K介導(dǎo)的胰島素家族的負(fù)調(diào)控機(jī)制有關(guān)[19]。P.Ye等[20]研究發(fā)現(xiàn)，100 ng·mL-1的IGF-I作用于大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞24 h，CyclinD1 mRNA表達(dá)量為對(duì)照組的7倍；Y. Jiang等[21]發(fā)現(xiàn)，100 ng·mL-1的IGF-I作用于鼠系膜細(xì)胞，Cyclin D1蛋白表達(dá)量為對(duì)照組的1.6倍。在本研究中，IGF-I 為100 ng·mL-1時(shí)，Cyclin D1 mRNA和蛋白的表達(dá)量分別為對(duì)照組的1.21和1.05倍。IGF-I作用于細(xì)胞時(shí)，首先與細(xì)胞表面的受體相結(jié)合，激活下游分子。研究顯示，不同組織器官中IGF-I及其受體的含量[22-23]與活性[24]均不同。因此，以上差異可能與試驗(yàn)對(duì)象在機(jī)體內(nèi)的位置及功能有關(guān)，提示生長(zhǎng)因子對(duì)生殖器官的調(diào)控可能存在特異性。本研究中Cyclin D1基因和蛋白表達(dá)呈現(xiàn)一定差異性，可能是由于Cyclin D1蛋白表達(dá)過(guò)程受到多條信號(hào)通路的調(diào)控。目前研究表明，Cyclin D1至少存在兩條轉(zhuǎn)錄后調(diào)控通路，即mTOR和/或PI3-p70S6通路和PI3 -eIF4E通路，它們可與Ras偶聯(lián)，對(duì)Cyclin D1進(jìn)行蛋白翻譯水平的調(diào)控[25]。Ras是生長(zhǎng)因子作用靶標(biāo)，將刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)傳遞給下游分子，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展[26]。同時(shí)，IGF-I還可以激活PI3K/Akt和MEK/ERK激酶途徑，調(diào)控Cyclin D1的表達(dá)[27]。因此，Cyclin D1在SC上的表達(dá)可能受到多方面的調(diào)控。

雄性動(dòng)物成年后， SC在體內(nèi)不再進(jìn)行增殖分化，雄性動(dòng)物的生精質(zhì)量在其成年之前就已決定[3]。SC的成熟障礙是多數(shù)雄性生殖障礙的根本原因，且SC的成熟障礙可能在出生之前就已經(jīng)存在[28-29]。總結(jié)本研究及前人成果發(fā)現(xiàn)，IGF-I上調(diào)牦牛SC中Cyclin D1蛋白的表達(dá)，同時(shí)還可抑制多種生殖相關(guān)細(xì)胞的凋亡。因此，IGF-I可能通過(guò)促進(jìn)牦牛SC周期進(jìn)程，抑制其凋亡，從而促進(jìn)SC的增殖和成熟，使其數(shù)量和質(zhì)量維持正常。這對(duì)提高牦牛的生精能力及精子質(zhì)量具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆牦牛CyclinD1基因(GenBank登錄號(hào)：KY 420723)，生物信息學(xué)分析顯示，其在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，Cyclin D1蛋白主要在SC胞核表達(dá)。IGF-I上調(diào)SC中Cyclin D1基因和蛋白的表達(dá)，具有劑量依賴性，最佳作用濃度為50 ng·mL-1。IGF-I可以通過(guò)影響SC中Cyclin D1的表達(dá)調(diào)控睪丸發(fā)育，從而影響雄性胚胎的生殖發(fā)育和成年動(dòng)物的精子質(zhì)量。

[1] WONG C H, CHENG C Y. The blood-testis barrier: its biology, regulation, and physiological role in spermatogenesis[J].CurrTopDevBiol, 2005, 71: 263-296.

[2] JOHNSON L, THOMPSON D L Jr, VARNER D D. Role of Sertoli cell number and function on regulation of spermatogenesis[J].AnimReprodSci, 2008, 105(1-2): 23-51.

[3] ORTH J M, GUNSALUS G L, LAMPERTI A A. Evidence from Sertoli cell-depleted rats indicates that spermatid number in adults depends on numbers of Sertoli cells produced during perinatal development[J].Endocrinology, 1988, 122(3): 787-794.

[4] BRADEN W A, MCCLENDON A K, KNUDSEN E S. Cyclin-dependent kinase 4/6 activity is a critical determinant of pre-replication complex assembly[J].Oncogene, 2008, 27(56): 7083-7093.

[5] HINDS P W, DOWDY S F, EATON E N, et al. Function of a humanCyclingene as an oncogene[J].ProcNatlAcadSciUSA, 1994, 91(2): 709-713.

[6] WANG H, YUAN Q Q, SUN M, et al. BMP6 regulates proliferation and apoptosis of human Sertoli cellsviaSmad2/3 and cyclin D1 pathway and DACH1 and TFAP2A activation[J].SciRep, 2017, 7: 45298.

[7] SICINSKI P, DONAHER J L, PARKER S B, et al. Cyclin D1 provides a link between development and oncogenesis in the retina and breast[J].Cell, 1995, 82(4): 621-630.

[8] 潘陽(yáng)陽(yáng), 崔 燕, 樊江峰, 等. 胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)對(duì)牦牛卵丘細(xì)胞熱休克蛋白70(HSP70)表達(dá)的影響及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)聯(lián)性分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2015, 23(9): 1208-1216. PAN Y Y, CUI Y, FAN J F, et al. The effect of insulin-like growth factor (IGF-1) on heat shock protein 70 (HSP70) expression of yak (Bosgrunniens) cumulus cells and its relation with apoptosis[J].JournalofAgriculturalBiotechnology, 2015, 23(9): 1208-1216. (in Chinese)

[9] PAN Y Y, CUI Y, BALOCH A R, et al. Insulinlike growth factor I improves yak (Bosgrunniens) spermatozoa motility and the oocyte cleavage rate by modulating the expression of Bax and Bcl-2[J].Theriogenology, 2015, 84(5): 756-762.

[10] YOON M J, ROSER J F. Insulin-like growth factor-I (IGF-I) protects cultured equine Leydig cells from undergoing apoptosis[J].AnimReprodSci, 2010, 122(3-4): 353-358.

[11] SHIN S M, KIM S, HONG J G, et al. IGF-I improves mitochondrial membrane potential during hypothermic storage of canine spermatozoa[J].JVetMedSci, 2014, 76(7): 1065-1067.

[12] SIRISATHIEN S, BRACKETT B G. TUNEL analyses of bovine blastocysts after culture with EGF and IGF-I[J].MolReprodDev, 2003, 65(1): 51-56.

[13] CHEN P, PAN Y, CUI Y, et al. Insulin-like growth factor I enhances the developmental competence of yak embryos by modulating aquaporin 3[J].ReprodDomestAnim, 2017, 52(5): 825-835.

[14] PITETTI J L, CALVEL P, ZIMMERMANN C, et al. An essential role for insulin and IGF1 receptors in regulating sertoli cell proliferation, testis size, and FSH action in mice[J].MolEndocrinol, 2013, 27(5): 814-827.

[15] ANWAY M D, FOLMER J, WRIGHT W W, et al. Isolation of sertoli cells from adult rat testes: an approach toexvivostudies of Sertoli cell function[J].BiolReprod, 2003, 68(3): 996-1002.

[16] ZHANG H, LIU B, QIU Y, et al. Pure cultures and characterization of yak Sertoli cells[J].TissueCell, 2013, 45(6): 414-420.

[17] BALDIN V, LUKAS J, MARCOTE M J, et al. Cyclin D1 is a nuclear protein required for cell cycle progression in G1[J].GeneDev, 1993, 7(5): 812-821.

[18] DANCE A, KASTELIC J, THUNDATHIL J. A combination of insulin-like growth factor I (IGF-I) and FSH promotes proliferation of prepubertal bovine Sertoli cells isolated and culturedinvitro[J].ReprodFertilDev, 2016, 29(8): 1635-1641.

[19] TANIGUCHI C M, EMANUELLI B, KAHN C R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action[J].NatRevMolCellBiol, 2006, 7(2): 85-96.

[20] YE P, HU Q C, LIU H D, et al. β-catenin mediates insulin-like growth factor-I actions to promote cyclin D1 mRNA expression, cell proliferation and survival in oligodendroglial cultures[J].Glia, 2010, 58(9): 1031-1041.

[21] JIANG Y, CHENG D W, LEVI E, et al. IGF-1 increases laminin, cyclin D1, and p21Cip1expression in glomerular mesangial cells: an investigation of the intracellular signaling pathway and cell-cycle progression[J].JCellBiochem, 2006, 98(1): 208-220.

[22] WERTHER G A, ABATE M, HOGG A, et al. Localization of insulin-like growth factor-I mRNA in rat brain byinsituhybridization-relationship to IGF-I receptors[J].MolEndocrinol, 1990, 4(5): 773-778.

[23] WEISS O, ANNER H, NEPHESH I, et al. Insulin-like growth factor-I (IGF-I) and IGF-I receptor gene expression in the kidney of the chronically hypoinsulinemic rat and hyperinsulinemic rat[J].Metabolism, 1995, 44(8): 982-986.

[24] PFAFFL M W, GEORGIEVA T M, GEORGIEV I P, et al. Real-time RT-PCR quantification of insulin-like growth factor (IGF)-1, IGF-1 receptor, IGF-2, IGF-2 receptor, insulin receptor, growth hormone receptor, IGF-binding proteins 1, 2 and 3 in the bovine species[J].DomestAnimEndocrinol, 2002, 22(2): 91-102.

[25] GUO Y, STACEY D W, HITOMI M. Post-transcriptional regulation of cyclin D1 expression during G2 phase[J].Oncogene, 2002, 21(49): 7545-7556.

[26] FU M F, WANG C G, LI Z P, et al. Minireview: Cyclin D1: normal and abnormal functions[J].Endocrinology, 2004, 145(12): 5439-5447.

[27] YAN Y, LI X Y, KOVER K, et al. CREB participates in the IGF-I-stimulation cyclin D1 transcription[J].DevNeurobiol, 2013, 73(8): 559-570.

[28] SHARPE R M, MCKINNELL C, KIVLIN C, et al. Proliferation and functional maturation of Sertoli cells, and their relevance to disorders of testis function in adulthood[J].Reproduction, 2003, 125(6): 769-784.

[29] 梁洺源，朱化彬，陳曉麗,等，支持細(xì)胞調(diào)控精原干細(xì)胞增殖、分化和凋亡的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2016, 47(2): 225-231. LIANG M Y,ZHU H B,CHEN X L,et al. The study progress of the proliferation, differentiation and apoptosis of spermatogonial stem cells under the regulation of Sertoli cells[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2016, 47(2): 225-231.(in Chinese)