利用Y染色體基因分析梅花鹿種公鹿的遺傳多樣性和父系起源

周永娜，劉華淼，鞠 妍，張然然，王 磊，董世武，邢秀梅

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 特種經(jīng)濟動物分子生物重點實驗室，長春 130112)

梅花鹿(Cervusnippon)屬于哺乳綱、偶蹄目，雌性無角，雄性有角，是重要的經(jīng)濟動物，具有極高的觀賞價值、藥用價值和食用價值。中國有著豐富的梅花鹿資源和悠久的梅花鹿馴鹿歷史，已經(jīng)育成品種有雙陽梅花鹿、敖東梅花鹿、四平梅花鹿、東豐梅花鹿、興凱湖梅花鹿、西豐梅花鹿，培育的品系有長白山梅花鹿。梅花鹿種公鹿則是養(yǎng)殖企業(yè)為培育優(yōu)質(zhì)的鹿群，依據(jù)生產(chǎn)性能、年齡、體質(zhì)外貌、遺傳性能等綜合因素選育出來的種用資源。

動物的起源進化研究主要圍繞線粒體DNA和Y染色體。線粒體DNA遵循母系遺傳，進化速率快，具有多態(tài)性，被廣泛的用于母系起源的研究，研究熱點主要集中在Cytb基因、D-loop區(qū)、12S rRNA和16S rRNA基因以及線粒體DNA全序列。Y染色體遵循父系遺傳，具有非重組區(qū)，有效群體小，是研究遺傳多樣性[1-2]、父系起源[3-4]及遷徙路線[5]的重要工具，研究熱點主要集中在Y-SNP、Y-STR及Y-CNV，其中Y-SNP研究主要圍繞AMELY、DBY、SRY、USP9Y、ZFY、UTY等基因，在牛[6-7]、羊[8-10]、馬[11-13]、豬[14-16]等物種中研究的較多。目前，關(guān)于中國家養(yǎng)梅花鹿的起源進化和遺傳多樣性的研究主要集中在線粒體DNA，吳華等[17]對來自9個東北家養(yǎng)群體的45只梅花鹿的D-loop區(qū)進行研究，定義了14種單倍型，分成了3個單系，并指出東北家養(yǎng)梅花鹿的遺傳多樣性較高。李歡霞[18]測定了來自4個家養(yǎng)群體的194只梅花鹿的Cytb基因，發(fā)現(xiàn)23個變異位點，定義了8種單倍型，并分成了兩個單系。而目前中國家養(yǎng)梅花鹿Y染色體的研究卻不多見，僅見周盼伊[19]對來自8個家養(yǎng)群體的690只生產(chǎn)鹿群梅花鹿的Y染色體進行研究，定義了10種單倍型，有兩個父系類型。雖然線粒體DNA可為家養(yǎng)梅花鹿的遺傳多樣性和母系起源的研究提供較為明確的分子生物學(xué)證據(jù)，但單一的線粒體DNA的研究結(jié)果并不能全面反映家養(yǎng)梅花鹿的遺傳多樣性和起源進化，仍需利用Y染色體從父系遺傳多樣性和父系起源進化的角度進行補充。梅花鹿種公鹿是家養(yǎng)梅花鹿群體的核心，決定著整個梅花鹿群體的生產(chǎn)性能。

本研究利用Y染色體的AMELY、DBY、USP9Y、SRY基因作為分子標(biāo)記對我國梅花鹿種公鹿的遺傳多樣性和父系起源進行探討，摸清梅花鹿種公鹿的父系類型，為我國梅花鹿保種和育種工作提供數(shù)據(jù)支持與理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別從吉林省和黑龍江省采集梅花鹿種公鹿抗凝血樣171份(表1)。

表1 樣品信息

Table 1 Sample information

群體Population數(shù)量Number采集地點Collectionlocation興凱湖梅花鹿XKH24黑龍江省密山市興凱湖農(nóng)場鹿場東大梅花鹿種群DD59吉林省長春市東大鹿業(yè)鹿場東豐梅花鹿DF31吉林省東豐縣橫道河鹿場四平梅花鹿SP11吉林省四平市吉春藥業(yè)股份有限公司鹿場雙陽梅花鹿SY11吉林省雙陽縣虹橋鹿業(yè)鹿場長白山梅花鹿品系CBS19吉林省通化市山寶鹿業(yè)鹿場敖東梅花鹿AD16吉林敖東藥業(yè)集團股份有限公司

1.2 主要的試劑和儀器

全血基因組DNA提取試劑盒(DP1101)購自北京百泰克公司；TaqDNA聚合酶購自于大連寶生物工程有限公司；50×TAE、瓊脂糖、異丙醇、無水乙醇、Loading Buffer、DNA Marker(DL 2000和DL15000)均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

PCR擴增儀(Eppendorf)；電泳儀(Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；離心機(Sigma公司)；電子天平(Mettler Toledo公司)。

1.3 基因組DNA提取和引物設(shè)計

按照百泰克全血基因組DNA提取試劑盒的說明書對梅花鹿種公鹿的基因組DNA進行提取，參考文獻(xiàn)[19]對梅花鹿Y染色體上的AMELY、DBY、USP9Y、SRY基因片段設(shè)計引物，并在此基礎(chǔ)上進行修改，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表2。

表2 引物信息

Table 2 Primer information

基因名稱Genename退火溫度/℃Annealingtemperature片段長度/bpProductslength序列(5'-3')SequenceAMELY160840F:GGGACATGAAGCAATAAGCAR:TCCAGGTCCCCATTTCTTGATAMELY260911F:CACCTCTGAAGTGGTATCAGAACAR:ATGGGGTGCACAGGTGACDBY581050F:TGATGATCGTGGGCGGAAR:CCTCTCAGTCCCAAACTCATAUSP9Y57724F:TTGGCACATTAAATGGGTTCR:CATTCAGGGCATTCATCTTCSRY601677F:AGCTTAGCAGTTACTTCCCATCGR:CGGCTGGACTGTAAACATCG

1.4 PCR擴增

50 μL擴增體系：ddH2O 35 μL，dNTP和10×buffer各5 μL，Taq酶0.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，模板基因組DNA 2.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，最佳Tm 30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存。使用1%的凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢驗，將合格的樣品送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。

1.5 序列的生物信息學(xué)分析

利用BioEdit7.2.5軟件進行人工校正，刪除不準(zhǔn)確的序列；DNAMAN V6軟件進行序列的拼接；Mega6.0軟件[20]確定核苷酸突變位點、堿基組成、轉(zhuǎn)換與顛換比(Ti/Tv)；DNASP5.1軟件[21]定義單倍型，計算單倍型多樣性(Hd)、種群內(nèi)核苷酸多樣性(π)和種群間的核苷酸歧義度(Dxy)；使用Mega6.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，馬鹿(Cervuselaphus)相應(yīng)的同源序列作為外源，將Bootstrap設(shè)置1 000次重復(fù)抽樣來檢驗NJ系統(tǒng)進化樹各個分支的置信度[22]；利用Mega6.0和iTOLS3.5.3構(gòu)建171只梅花鹿種公鹿個體的分子系統(tǒng)進化樹；Structure2.3.4軟件計算群體遺傳結(jié)構(gòu)，設(shè)定群體數(shù)(K)的預(yù)測值范圍為2～9，MCM(Markov chain monte carlo)開始時的不作數(shù)迭代(Length of burn-in period)設(shè)為 20 000 次，不作數(shù)迭代后的 MCMC 為 120 000 次，重復(fù)運行6次。使用Structure Harvester Web v0.6.94在線工具及J.K.Pritchard等[23]描述的方法確定最優(yōu)群體數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 梅花鹿種公鹿Y染色體上5個基因片段的擴增結(jié)果

采用普通PCR方法進行擴增，取3 μL PCR擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂凝膠電泳檢測，AMELY1、AMELY2、DBY、USP9Y、SRY基因片段均符合目的片段的大小，無雜帶且條帶清晰，特異性好，可用于后續(xù)的PCR產(chǎn)物測序(圖1)。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1.AMELY1；2.AMELY2；3.DBY；4.USP9Y；5.SRYM.DL2000 DNA marker; 1.AMELY1; 2.AMELY2; 3.DBY; 4.USP9Y; 5.SRY圖1 AMELY1、AMELY2、DBY、USP9Y、SRY擴增結(jié)果Fig.1 Result for PCR amplification of AMELY1, AMELY2, DBY, USP9Y, SRY

2.2 梅花鹿種公鹿Y染色體上5個基因片段的堿基組成分析

利用BioEdit7.2.5軟件對比峰圖對測序結(jié)果進行人工校正，刪除不準(zhǔn)確的序列，可得到AMELY1、AMELY2、DBY、USP9Y、SRY基因片段的長度分別為708、877、1 086、581、1 523 bp，種公鹿間的各片段無序列長度差異。利用Mega6.0計算5個片段總堿基組成，東豐梅花鹿種公鹿A+T的含量為63.8%、C+G含量為36.2%。興凱湖梅花鹿種公鹿A+T含量為63.6%、C+G含量為36.4%。其余梅花鹿種公鹿群體的A+T和C+G含量均為

63.7%和36.3%?？芍狝+T含量明顯大于C+G含量，說明Y染色體的這5個基因片段存在AT堿基偏好性。由表3可知，東豐梅花鹿種公鹿和四平梅花鹿種公鹿間具有最大的核苷酸歧義度(0.000 50)，敖東梅花鹿種公鹿和和雙陽梅花鹿種公鹿具有最低的核苷酸歧義度(0.000 14)，東豐梅花鹿種公鹿具有最高的核苷酸多樣性(0.000 42)，敖東梅花鹿種公鹿具有最低的核苷酸多樣性(0.000 12)。

2.3 梅花鹿種公鹿Y染色體上5個基因片段的單倍型分析

利用DNASP5.1軟件共定義10種單倍型，分別為H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10(表4)。如表5所示，興凱湖梅花鹿種公鹿有4種單倍型(H1、H3、H4、H6)，東大梅花鹿種公鹿有6種單倍型(H1、H2、H3、H7、H8、H9)，四平梅花鹿種公鹿有3種單倍型(H1、H2、H7)，雙陽梅花鹿種公鹿有4種單倍型(H1、H4、H6、H8)，敖東梅花鹿種公鹿有3種單倍型(H1、H2、H9)，長白山梅花鹿種公鹿有3種單倍型(H1、H2、H3)，東豐梅花鹿種公鹿有5種單倍型(H1、H2、H3、H5、H10)，四平梅花鹿種公鹿和敖東梅花鹿種公鹿分別具有最高和最低的單倍型多樣性(表3)。H5和H10為東豐梅花鹿種公鹿獨有。H1為所有梅花鹿種公鹿群體共有，所占頻率為49.1%，是優(yōu)勢單倍型，而H5、H6、H7、H8、H9、H10所占頻率較低，分別為0.59%、3.5%、2.9%、1.75%、1.17%、0.59%，為稀有單倍型(表5)。

表3 種群間核苷酸歧義度(Dxy)、種群內(nèi)核苷酸多樣性(π)和單倍型多樣性(Hd)

Table 3 TheDxybetween populations,πandHdwithin the population

DDADDFSPCBSXKHSYπHdDD0.000320.62404AD0.000260.000120.34167DF0.000440.000340.000420.68602SP0.000400.000270.000500.000350.69091CBS0.000400.000270.000370.000440.000330.52632XKH0.000330.000250.000460.000400.000410.000320.67532SY0.000270.000140.000370.000300.000310.000270.000170.60000

2.4 梅花鹿種公鹿Y染色體上5個基因片段的多態(tài)性分析

利用Mega6.0軟件比對分析后，未發(fā)現(xiàn)缺失和插入，全為堿基替換，共統(tǒng)計出8個突變位點(表4)，其中在AMELY1的66位出現(xiàn)C→T轉(zhuǎn)換、136位T→G顛換、624位T→C轉(zhuǎn)換，AMELY2的128位T→A顛換、590位 A→G轉(zhuǎn)換，DBY的404位G→A轉(zhuǎn)換，USP9Y的362位置出現(xiàn)C→T轉(zhuǎn)換，SRY的38位T→A顛換，轉(zhuǎn)換與顛換比(Ti/Tv)為2.223，表明AMELY、DBY、USP9Y、SRY基因的所有突變以轉(zhuǎn)換為主。對AMELY、DBY、USP9Y、SRY基因進行中性檢驗，得到的Tajima’S D值[24]分別為-0.445 03、0.351 58、1.243 27、1.341 26，P>0.1，為不顯著差異，表明4個基因的所有的突變均符合中性進化。梅花鹿種公鹿Y染色體的5個基因片段Hd=0.696 80，π=0.000 36。

表4 變異位點和單倍型

Table 4 Mutation sites and haplotypes

單倍型Haplotype變異位點MutationsiteAMELY1AMELY2DBYUSP9YSRY6613662412859040436238H1CTTTAGCTH2CTTTAGTAH3TTTTGACTH4CTTTAGCTH5TTTTGGCTH6CGTTAGTTH7CTCAAGCTH8CTTTAGTTH9CTTTGGCTH10TTTTAACT

2.5 梅花鹿種公鹿的單倍型進化樹分析

對171只梅花鹿種公鹿的10種單倍型進行系統(tǒng)進化分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)H9是最原始的單倍型，與其它單倍型的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，并獨自形成單系I(Y1)。H3、H5和H10形成單系II(Y2)。H2、H4、H6、H7和H8 是由H1進化而來，并和H1一起形成單系III(Y3)。結(jié)合表5，敖東梅花鹿種公鹿和東大梅花鹿種公鹿的一部分個體是最原始種群，另外一部分個體則由最原始種群進化而來。除雙陽梅花鹿種公鹿和四平梅花鹿種公鹿均來自單系III(Y3)，其余梅花鹿種公鹿群體來自不同單系。

表5 單倍型頻率及其在群體中的分布

Table 5 Distribution and frequency of haplotypes

單倍型Haplotype頻率/%Frequency單倍型分布HaplotypedistributionH149.10DD、AD、DF、SP、CBS、XKH、SYH220.50DD、AD、DF、SP、CBSH312.90DD、DF、CBS、XKHH47.00XKH、SYH50.59DFH63.50XKH、SYH72.90DD、SPH81.75DD、SYH91.17DD、ADH100.59DF

圖2 10種單倍型的NJ系統(tǒng)進化樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of 10 haplotypes

2.6 梅花鹿種公鹿分子系統(tǒng)進化樹分析

利用Mega6.0軟件和iTOL3.5.3構(gòu)建171只梅花鹿種公鹿的圓形分子系統(tǒng)進化樹，由圖3可知，各群體間分界不明顯，存在基因交流和基因滲入現(xiàn)象，這可能是養(yǎng)殖企業(yè)在配種時引種雜交引起的。

圖3 171只梅花鹿種公鹿的圓形分子系統(tǒng)進化樹Fig.3 Circular phylogenetic tree of 171 breeder sika deer

2.7 梅花鹿種公鹿群體結(jié)構(gòu)分析

利用Structure2.3.4軟件分析171只梅花鹿種公鹿的群體結(jié)構(gòu)，如圖4所示，根據(jù)J.K.Pritchard 等[23]描述的方法，ΔK值在K=3時達(dá)到最大值，即K的最優(yōu)值為3。 繪制K=3的群體遺傳結(jié)構(gòu)圖(圖5)，結(jié)果表明171只梅花鹿種公鹿來自于3個祖先基因型。

3 討 論

本試驗對171只梅花鹿種公鹿Y染色體的AMELY1、AMELY2、DBY、USP9Y、SRY基因進行PCR擴增測序，得到長度為708、877、1 086、581、1 523 bp的基因片段，并分別檢測到3、2、1、1、1個突變位點。AMELY、DBY、USP9Y、SRY基因的Hd值分別為0.368、0.234、0.384、0.401，π值分別為0.001 90、0.001 46、0.001 06、0.000 96。AMELY基因共有5個突變位點，且具有較高的π值，而DBY、USP9Y、SRY基因均只有1個突變位點，且具有較低的π值，這可能是由基因功能的不同所導(dǎo)致的，AMELY基因是牙釉質(zhì)蛋白基因[25]，DBY和USP9Y基因與精子生成有關(guān)[26-27]，SRY基因則是性別決定基因[28-29]。從整體來看，本研究中梅花鹿種公鹿Y染色體的5個基因片段的Hd和π低于吳華等[17]對我國東北區(qū)馴養(yǎng)梅花鹿線粒體的Hd=0.889，π=0.031 73，一方面因為生產(chǎn)實踐中梅花鹿的配種方式為單公群母，另一方面因為種公鹿的選擇會參考重要產(chǎn)茸性能，人工選擇強度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種母鹿。

圖4 171只梅花鹿種公鹿的最優(yōu)K值Fig.4 The optimal K value of 171 breeder sika deer

3種顏色分別代表3種父系類型Three colours represent three paternal types圖5 171 只梅花鹿種公鹿的群體遺傳結(jié)構(gòu)Fig.5 Population genetic structure of 171 breeder sika deer

10種單倍型中，H1所占頻率為49.1%，是優(yōu)勢單倍型，為所有梅花鹿種公鹿群體共有。H5、H6、H7、H8、H9、H10所占的頻率分別為0.59%、3.5%、2.9%、1.75%、1.17%、0.59%，為稀有單倍型，其中H5和H10為東豐梅花鹿種公鹿獨有，H6存在于興凱湖梅花鹿種公鹿和雙陽梅花鹿種公鹿，H7存在于東大梅花鹿種公鹿和四平梅花鹿種公鹿，H8存在于東大梅花鹿種公鹿和雙陽梅花鹿種公鹿，H9存在于東大梅花鹿種公鹿和敖東梅花鹿種公鹿。各單倍型頻率相差懸殊的現(xiàn)象很可能是養(yǎng)殖企業(yè)只關(guān)注種公鹿的重要產(chǎn)茸性能并長期對其定向選擇造成的，而單公群母的配種方式更會導(dǎo)致稀有單倍型慢慢消失。某群體種公鹿的遺傳結(jié)構(gòu)代表了該群體未來幾年的遺傳結(jié)構(gòu)，為防止稀有單倍型慢慢消失而造成的遺傳多樣性降低，養(yǎng)殖企業(yè)應(yīng)在保證生產(chǎn)需求的情況下，根據(jù)該群體種公鹿的單倍型分布情況進行針對性的配種，從而縮小各單倍型之間的頻率差距，擴大稀有單倍型在梅花鹿群體中的比例，以達(dá)到保護我國梅花鹿遺傳多樣性與種質(zhì)資源的目的。

單倍型系統(tǒng)進化樹和群體結(jié)構(gòu)分析表明，中國梅花鹿種公鹿存在3種父系類型，分別為Y1、 Y2和Y3，其中Y1由H9組成，是最原始的父系類型。而H9僅存在于東大梅花鹿種公鹿和敖東梅花鹿種公鹿，且在兩種公鹿群體所占頻率僅為1.7%和6.3%，為防止該原始單倍型在梅花鹿群體中消失，應(yīng)針對性的選用該單倍型的種公鹿進行配種，以增加該單倍型的后代，達(dá)到保護原始單倍型的目的。另外，除雙陽梅花鹿種公鹿和四平梅花鹿種公鹿均來自Y3，其余梅花鹿種公鹿均為多父系類型，而某個群體的生產(chǎn)鹿絕大部分是該群體種公鹿的后代，所以本試驗對梅花鹿種公鹿父系類型的研究結(jié)果，也可代表梅花鹿群體的父系類型，為防止我國梅花鹿種質(zhì)資源因近交而引起的衰退，同一父系類型內(nèi)部的梅花鹿應(yīng)盡量減少基因交流，而相同單倍型的梅花鹿更應(yīng)避免近交。

由圖3可知，家養(yǎng)梅花鹿群體間存在著基因交流和基因滲入現(xiàn)象，這很可能是養(yǎng)殖企業(yè)引種雜交所引起的，為了避免引種雜交造成的種質(zhì)資源退化，養(yǎng)殖企業(yè)應(yīng)將科學(xué)研究與生產(chǎn)實踐結(jié)合起來，建立梅花鹿群體內(nèi)部種公鹿的表型性狀、生產(chǎn)性狀和遺傳性狀體系，并制定長遠(yuǎn)的選種選配方案，逐步提高該群體的遺傳多樣性，提高梅花鹿群體的環(huán)境適應(yīng)能力與進化潛力，發(fā)揮我國家養(yǎng)梅花鹿的種質(zhì)資源優(yōu)勢，培育出更優(yōu)秀的梅花鹿新品種。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，171只梅花鹿種公鹿的單倍型多樣性為0.696 80，核苷酸多樣性為0.000 36，表明我國梅花鹿種公鹿Y染色體具有較高的單倍型多樣性和極低的核苷酸多樣性。NJ系統(tǒng)進化樹和Structure群體結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果表明，梅花鹿種公鹿有3個父系類型，分別為Y1、Y2和Y3，除雙陽梅花鹿種公鹿和四平梅花鹿種公鹿均來自Y3，其余梅花鹿種公鹿群體均為多父系類型。

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