曲霉菌臨床分離株的分子鑒定及體外抗真菌藥物敏感性分析

張莉莉， 王強(qiáng)兄， 沈亮亮， 冀燕芬， 鄧淑文， 趙敬軍

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院皮膚科，上海 200065； 2. 上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所-上海市醫(yī)學(xué)真菌重點分子生物學(xué)實驗室，上海 200003)

曲霉菌是環(huán)境中廣泛存在的機(jī)會性致病真菌，可引起肺、眼、鼻、外耳道、皮膚等的感染。侵襲性曲霉病是曲霉菌感染最嚴(yán)重的一種類型，主要累及免疫功能嚴(yán)重受損患者，臨床治療診斷及困難，死亡率高達(dá)90%[1-2]。近年來，隨著骨髓、器官移植的廣泛開展，廣譜抗生素及免疫抑制劑的大量使用，侵襲性曲霉病的發(fā)生率明顯增高，在免疫抑制患者中已僅次于白念珠菌感染。煙曲霉是曲霉病最常見的致病菌，約占80%[3]，其次為黃曲霉、土曲霉、黑曲霉[4]。由于不同曲霉菌之間藥物敏感性存在差異，因此將曲霉菌鑒定到種可以更有針對性地選擇抗真菌藥物[5]。此外，鑒定到種的水平還可以確定感染性疾病的病因，進(jìn)行流行病學(xué)分析，有助于醫(yī)院感染控制。使用分子生物學(xué)方法如ITS及β-tubulin基因測序可以將曲霉菌準(zhǔn)確地鑒定到種水平[6]。目前，臨床上治療曲霉病的一線藥物為伊曲康唑、伏利康唑、泊沙康唑等，隨著曲霉菌抗真菌藥物的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，抗真菌藥敏試驗日趨重要。本研究采用ITS及β-tubulin基因測序?qū)?3株曲霉菌臨床分離株進(jìn)行分子鑒定，將菌株準(zhǔn)確鑒定到種及以下水平，并按照CLSI M38-A2方案測定伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、兩性霉素B、米卡芬凈、阿尼芬凈、卡泊芬凈對這些菌株的MIC值，分析不同抗真菌藥物對曲霉菌的體外敏感性特點，從而為臨床治療曲霉菌感染提供藥敏依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

菌株來自于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015—2016年從鏡檢陽性的臨床標(biāo)本中分離的53株經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為曲霉菌的菌株，其中16株分離自疑似肺曲霉感染患者痰液，其余37株分離自外耳道曲霉菌感染患者的耳道分泌物。

1.2 抗真菌藥物

伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、卡泊芬凈、兩性霉素B購自Sigma公司；米卡芬凈、阿尼芬凈購自多倫多化學(xué)品研究公司；米卡芬凈和卡泊芬凈用滅菌蒸餾水溶解，其余藥物用二甲基亞砜(DMSO)溶解，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基購自美國BD-Difco公司；RPMI-1640液體培養(yǎng)基購自Gibco公司。

1.4 菌種鑒定

將分離純化的菌株接種于PDA培養(yǎng)基，按照之前的方法對所有菌株提取DNA并進(jìn)行ITS基因擴(kuò)增測序及β-tubulin基因擴(kuò)增測序?qū)⒕觇b定到種水平[7-9]。

1.5 體外藥敏試驗

根據(jù)CLSI M38-A2方案進(jìn)行藥物敏感性測定。棘白菌素類藥物濃度梯度設(shè)置為0.008～4μg/mL，其余藥物均為0.031～16μg/mL。棘白菌素類藥物24h后觀察結(jié)果，其余藥物48h后觀察結(jié)果。選用標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 22019及ATCC MYA 3627作為質(zhì)控菌株。

1.6 結(jié)果判定

唑類藥物(伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑)和兩性霉素B最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)定義為肉眼直接觀察到的無真菌生長的最低藥物濃度；棘白菌素類藥物(米卡芬凈、卡泊芬凈、阿尼芬凈)最低有效濃度(minimum effective concentration, MEC)定義為出現(xiàn)短而異常分支的菌絲時的最低藥物濃度。由于M38-A2方案中尚未制定曲霉屬藥物敏感性的判讀折點，根據(jù)CLSI M38-A2方案及多中心推薦的曲霉菌流行病學(xué)臨界值(ECV)來評估藥物的敏感性[9-10]，MIC>ECV即為非野生株。伊曲康唑、伏立康唑?qū)熐?、土曲霉、黃曲霉ECV值為1μg/mL，對黑曲霉ECV值為2μg/mL；泊沙康唑?qū)熐埂⑼燎?、黑曲霉ECV值為0.5μg/mL，對黃曲霉為0.25μg/mL；兩性霉素B對煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉ECV值為2μg/mL，土曲霉為4μg/mL。塔賓曲霉和百歲蘭曲霉的ECV值尚未制定，按黑曲霉的ECV值進(jìn)行評估。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

通過藥敏分析軟件Whonet 5.4計算7種藥物對不同曲霉菌株的MIC50、MIC90、MIC范圍等參數(shù)。采用SPSS 20.0對藥敏結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。用Kruskal-Wallis秩和檢驗比較不同藥物及不同曲霉菌的藥物敏感性差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 菌株鑒定結(jié)果

53株曲霉菌分子鑒定結(jié)果見表1。其中煙曲霉復(fù)合體22株(煙曲霉21株和侖圖盧斯曲霉1株)，黑曲霉復(fù)合體23株(塔賓曲霉16株、黑曲霉5株、百歲蘭曲霉2株)及土曲霉和黃曲霉各4株。

表1 53株曲霉臨床菌株分子鑒定結(jié)果及標(biāo)本來源Tab.1 Source and molecular identification results of 53 clinical Aspergillus strains

2.2 藥敏結(jié)果

米卡芬凈、阿尼芬凈、卡泊芬凈、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B對曲霉菌株的MIC90由低到高依次為0.031、0.031、0.25、0.5、0.5、1、2μg/mL,見圖1。7種藥物對兩性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、阿尼芬凈、米卡芬凈、卡泊芬凈的MIC范圍/MIC50/GM分別為：0.5～4/1/0.94μg/mL、0.063～16/0.5/0.62、0.063～2/0.5/0.43、0.031～0.5/0.25/0.18、0.008～0.031/0.015/0.015、0.008～0.031/0.015/0.018、0.125～0.25/0.25/0.2μg/mL。根據(jù)ECV值，1株煙曲霉對伊曲康唑(MIC≥16μg/mL)、伏立康唑(MIC為2μg/mL)判定為耐藥。僅有的1株侖圖盧斯曲霉對兩性霉素B耐藥(MIC為8μg/mL)。不同種曲霉菌對7種藥物的MIC范圍/MIC50/MIC90/GM見表2。棘白菌素類藥物阿尼芬和凈米卡芬凈對幾種曲霉菌的MIC50及MIC90最低。米卡芬凈和阿尼芬凈對曲霉菌的體外抑菌活性相當(dāng)(P>0.05)，均高于卡泊芬凈的體外抑菌活性(P<0.05)。阿尼芬凈對煙曲霉、黑曲霉、黃曲霉的MIC90均為0.015μg/mL，對塔賓曲霉和土曲霉均為0.031μg/mL。米卡芬凈對于黑曲霉和塔賓曲霉的MIC90高于阿尼芬凈，分別為0.031、0.063μg/mL，對其他3種曲霉菌的MIC90與阿尼芬凈相同。兩性霉素B對土曲霉MIC90最高，為4μg/mL，對黑曲霉和塔賓曲霉的MIC90相對較低，為1μg/mL，對煙曲霉和黃曲霉MIC90為2μg/mL。對于塔賓曲霉，3種唑類藥物(伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑)的MIC值的GM均較其他曲霉高，而兩性霉素B的MIC值GM低于其他幾種曲霉菌。4種曲霉復(fù)合體對7種抗真菌藥物的敏感性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 7種藥物對53株曲霉菌的MIC50/MIC90/GMFig.1 MIC50/MIC90/GM distribution of 7 antifungal agents against 53 Aspergillus strains

(μg/mL)

3 討 論

曲霉菌是臨床上最常見的致病絲狀真菌，可引起一系列的臨床表現(xiàn)[11-12]。煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉為最常見的4種致病曲霉。近年來，隨著分子工具的不斷應(yīng)用，更新了曲霉的分類[13-14]。除4種常見曲霉外，本研究還發(fā)現(xiàn)了少見的侖圖盧斯曲霉、塔賓曲霉及百歲蘭曲霉。侖圖盧斯曲霉為煙曲霉復(fù)合體中的一員，產(chǎn)孢能力較煙曲霉弱，常對一種或多種抗真菌藥物耐藥[15]。百歲蘭曲霉引起的感染在臨床上較為罕見。23株黑曲霉復(fù)合體中塔賓曲霉最多，而黑曲霉只占21.7%。臨床分離的鑒定為黑曲霉的菌株很大一部分為其他曲霉如塔賓曲霉等，這些曲霉與黑曲霉在形態(tài)學(xué)上難以區(qū)分，常被錯誤鑒定為黑曲霉[16]。

本研究結(jié)果顯示，棘白菌素類藥物對曲霉菌臨床分離株顯示了很高的體外抗菌活性，與之前的研究[17-18]結(jié)果相似。米卡芬凈和阿尼芬凈對曲霉菌的體外抑菌活性相當(dāng)，高于卡泊芬凈的體外抑菌活性(P<0.05)。米卡芬凈、阿尼芬凈MEC均為0.063μg/mL時能有效抑制全部菌株生長，卡泊芬凈MEC為0.25μg/mL時能有效抑制全部菌株生長。

唑類藥物的體外抗曲霉菌活性優(yōu)于兩性霉素B，這與其他文獻(xiàn)[19,22]報道的結(jié)果一致。近年來，對唑類耐藥的煙曲霉報道不斷增多，本實驗21株中有1株對伊曲康唑、伏立康唑耐藥，占所有煙曲霉菌株的4.76%。對于唑類藥物，塔賓曲霉的敏感性最低，煙曲霉的敏感性最高。3種唑類藥物對曲霉菌的體外抑菌活性由高到低依次為： 泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑。泊沙康唑與卡泊芬凈體外抗曲霉活性活性相當(dāng)(P>0.05)，但對于土曲霉，泊沙康唑的抗真菌活性優(yōu)于卡泊芬凈。

與其他幾種藥物相比，兩性霉素B體外抗曲霉菌活性最低。兩性霉素B對煙曲霉、黃曲霉、土曲霉的抑菌活性較低(尤其是土曲霉)，對于這些曲霉菌引起的感染，兩性霉素B不是好的選擇。但對于塔賓曲霉，兩性霉素B較伊曲康唑敏感(P<0.05)，這與其他研究[23-24]結(jié)果一致。

總的來說，棘白菌素藥物米卡芬凈和阿尼芬凈對曲霉的MECs最低，體外抗菌活性最高，兩性霉素B的MICs最高，體外抗菌活性最低，唑類藥物介于兩者之間。阿尼芬凈和米卡芬凈對幾種曲霉均具有很好的抗菌活性。對于抗真菌藥物活性的研究，需要大樣本菌株的調(diào)查及藥效學(xué)和藥動學(xué)的實驗[25]；體外藥物試驗的結(jié)果與臨床療效的關(guān)系，需要臨床醫(yī)生參與和對病例進(jìn)行回顧性分析。

[1] CHOWDHARY A, KATHURIA S, XU J, et al. Emergence of Azole-Resistant Aspergillus fumigatus Strains due to Agricultural Azole Use Creates an Increasing Threat to Human Health[J]. PLoS Pathog, 2013,9(10): e1003633.

[2] KOSMIDIS C, DENNING D W. The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis[J]. Thorax, 2015,70(3): 270-277.

[3] MESSER S A, JONES R N, FRITSCHE T R. International surveillance of Candida spp. and Aspergillus spp.: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program(2003)[J]. J Clin Microbiol, 2006,44(5): 1782-1787.

[4] BALAJEE S A, KANO R, BADDLEY J W, et al. Molecular identification of Aspergillus species collected for the Transplant-Associated Infection Surveillance Network[J]. J Clin Microbiol, 2009,47(10): 3138-3141.

[5] ALASTRUEY-IZQUIERDO A, MELLADO E, CUE-NCA-ESTRELLA M. Current section and species complex concepts in Aspergillus: recommendations for routine daily practice[J]. Ann N Y Acad Sci, 2012,1273(1): 18-24.

[6] LI Y, WAN Z, LIU W, et al. Identification and susceptibility ofspergillus section Nigri in China: prevalence of species andaradoxical growth in response to Echinocandins[J]. J Clin Microbiol, 2015,53(2): 702-705.

[7] 冀燕芬,張莉莉,鄧淑文等.煙曲霉臨床菌株對體外抗真菌藥物的敏感性研究[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2017,38(1): 74-79.

[8] KIM M N, SHIN J H, SUNG H, et al. Candida haemulonii and closely related species at 5 university hospitals in Korea: identification,antifungal susceptibility,and clinical features[J]. Clin Infect Dis, 2009,48(6): e57-61.

[9] AL-WATHIQI F, AHMAD S, KHAN Z. Molecular identification and antifungalsusceptibility profile of Aspergillus flavus isolates recovered from clinicalspecimens in Kuwait[J]. BMC Infect Dis, 2013,13: 126.

[10] ESPINEL-INGROFF A, DIEKEMA D J, FOTHERGI-LL A, et al. Wild-type MIC distributions and epidemiological cutoff values for the triazoles and six Aspergillus spp. for the CLSI broth microdilution method (M38-A2 document)[J]. J Clin Microbiol, 2010,48(9): 3251-3257.

[11] ESPINEL-INGROFF A, CUENCA-ESTRELLA M, FO-THERGILL A, et al. Wild-Type MIC Distributions and Epidemiological Cutoff Valuesfor Amphotericin B and Aspergillus spp. for the CLSI BrothMicrodilution Method (M38-A2 Document)[J].Antimicrob Agents Chemother, 2011,55(11): 5150-5154.

[12] ALASTRUEY-IZQUIERDO A, MELLADO E, PEL-EZ T, et al. Population-based survey of filamentous fungi and antifungal resistance in Spain(FILPOP Study)[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2013,57(7): 3380-3387.

[13] LASS-FL?RL C. The changing face of epidemiology of invasive fungal disease in Europe[J]. Mycoses, 2009,52(3): 197-205.

[14] BALAJEE S A, GRIBSKOV J L, HANLEY E, et al.Aspergillus lentulus sp. nov., a new sibling species of A. fumigatus[J]. Eukaryot Cell, 2005,4(3): 625-632.

[15] ALCAZAR-FUOLI L, MELLADO E, ALASTRUEY-IZQUIERDO A, et al. Species identification andntifungal susceptibility patterns of species belonging to Aspergillus section Nigri[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009,53(10): 4514-4517.

[16] VARGA J, HOUBRAKEN J, VAN DER LEE H A, et al. Aspergillus calidoustus sp. nov., causativegent of human infections previously assigned to Aspergillus ustus[J]. Eukaryot Cell, 2008,7(4): 630-638.

[17] MESSER S A,MOET G J,KIRBY J T, et al. Activity of contemporary antifungal agents, including the novel echinocandinanidulafungin, tested against Candida spp., Cryptococcus spp., and Aspergillus spp.: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (2006 to 2007)[J]. J Clin Microbiol, 2009,47(6): 1942-1946.

[18] PFALLER M A, BOYKEN L, HOLLIS R J, et al. In vitro susceptibility of clinical isolates of Aspergillus spp. to anidulafungin, caspofungin, and micafungin: a head-to-head comparison using the CLSI M38-A2 broth microdilutionmethod[J]. J Clin Microbiol, 2009,47(10): 3323-3325.

[19] SHI J Y, XU Y C, SHI Y, et al. In vitro susceptibility testing of Aspergillusspp. against voriconazole, itraconazole, posaconazole, amphotericinB and caspofungin[J]. Chin Med J(Engl), 2010,123(19): 2706-2709.

[20] PFALLER J B, MESSER S A, HOLLIS R J, et al. In vitro susceptibility testing of Aspergillus spp.: comparison of Etest and reference microdilution methods for determining voriconazole and itraconazole MICs[J]. J Clin Microbiol, 2003,41(3): 1126-1129.

[21] SERRANO M C, MORILLA D, VALVERDE A, et al. Comparison of Etest with modified broth microdilution method for testing susceptibility of Aspergillus spp. to voriconazole[J]. J Clin Microbiol, 2003,41(11): 5270-5272.

[22] PFALLER M A, MESSER S A, BOYKEN L, et al. In vitro susceptibility testing of filamentous fungi: comparison of Etest and reference M38-A microdilution methods for determining posaconazole MICs[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2003,45(4): 241-244.

[23] ALCAZAR-FUOLI L, MELLADO E, ALASTRUEY-IZQUIERDO A, et al. Species Identification and Antifungal Susceptibility Patterns of Species Belonging to Aspergillus Section Nigri[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009,53(10): 4514-4517.

[24] GAUTIER M, NORMAND A C, L’OLLIVIER C, et al. Aspergillustubingensis: a major filamentous fungus found in the airways of patients with lung disease[J]. Med Mycol, 2016,54(5): 459-470.

[25] 潘奕欣，馬寧寧，趙婧，等.4種病原菌體外培養(yǎng)對抗菌藥物持留形成特征[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)， 2017,43(4): 6-10.