MiR-182/FOXF2信號通路在三陰性乳腺癌侵襲及血管生成中的意義

于金玲， 沈衛(wèi)達(dá)， 高蓓敏， 趙海燕， 曹小曼

(上海市長寧區(qū)婦幼保健院乳腺科，上海 200051)

三陰性乳腺癌易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，目前臨床缺乏有效的治療靶點[1]。MicroRNAs(miRNAs)是具有大約22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過促進(jìn)靶基因mRNA的降解或抑制翻譯而調(diào)節(jié)靶基因的功能，在細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、代謝、凋亡、衰老和腫瘤的發(fā)生等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。多種miRNAs與三陰性乳腺癌(three-negative breast cancer, TNBC)的預(yù)后相關(guān)，可以作為轉(zhuǎn)移治療靶點[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-182在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)。miR-182高表達(dá)是三陰性乳腺癌獨立的預(yù)后因素之一，與不良預(yù)后相關(guān)[5-6]，是潛在的三陰性乳腺癌治療靶點。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXF2低表達(dá)可導(dǎo)致乳腺腫瘤進(jìn)展和預(yù)后不良，但目前尚未見miR-182與FOXF2的關(guān)聯(lián)性研究。本研究通過生物學(xué)信息軟件Targetscan(http:∥www.targetscan.org/vert_61/)發(fā)現(xiàn)miR-182在FOXF2的3′-UTR端688～695片段和485～491片段有潛在結(jié)合位點，為進(jìn)一步明確miR-182的表達(dá)水平與乳腺癌增殖、侵襲的關(guān)系，本研究探討miR-182/FOXF2信號通路在三陰性乳腺癌侵襲及血管生成的意義。

1 材料與方法

1.1 倫理申明

由于本實驗涉及人源細(xì)胞的采集，因此所有涉及倫理問題的實驗操作均報備了上海長寧區(qū)婦幼保健院倫理委員會，并已獲得倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)在37℃含10% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用DMEM培養(yǎng)基加10%體積的胎牛血清培養(yǎng)；質(zhì)粒及miRNA mimic使用LipofectamineTM2000試劑(Gibco公司)轉(zhuǎn)染。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 使用在線預(yù)測工具miRWalk對可靶向結(jié)合FOXF2基因3′-UTR的miRNA進(jìn)行預(yù)測。根據(jù)has-miR-182靶點預(yù)測信息，將FOXF2基因上的2個預(yù)測靶點分別構(gòu)入熒光素酶報告基因質(zhì)粒PGL3-3′UTR中，將構(gòu)建成功的熒光素酶報告基因質(zhì)粒與miR-182 mimics共轉(zhuǎn)染至低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，通過酶標(biāo)儀檢測熒光素酶活性是否降低。

1.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建及Luciferase測試報告實驗 將MCF-7細(xì)胞接種于48孔板。細(xì)胞鋪板24h后，使用Poly-Fecter轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔用量如下： has-miR-182 mimics 100ng，Luc-UTR報告基因質(zhì)粒100ng，內(nèi)參Renilla 5ng。以陰性參照siRNA(NC)100ng加Luc-UTR報告基因質(zhì)粒100ng，內(nèi)參Renilla 5ng為對照組實驗。每組設(shè)置3個重復(fù)孔。6h后換液；轉(zhuǎn)染48h后裂解細(xì)胞，測試luciferase活性。

1.2.4 miRNA靶點突變測試報告及內(nèi)源基因表達(dá)量檢測 根據(jù)前期miR-182對目的基因FOXF2 3′UTR的測試結(jié)果，將包含has-miR-182靶點的FOXF2-U2靶點序列突變，并將構(gòu)建成功的熒光素酶報告基因突變質(zhì)粒與miR-182 mimics共轉(zhuǎn)染至低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，通過酶標(biāo)儀檢測熒光素酶活性是否恢復(fù)，進(jìn)一步明確miR-182的結(jié)合位點。MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-182，對照組轉(zhuǎn)染si-NC。24～48h后提取RNA，通過qRT-PCR檢測FOXF2 mRNA表達(dá)量變化。

1.3 細(xì)胞的CCK-8增殖實驗

將MDA-MB-231細(xì)胞和MCF7細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，3000細(xì)胞/孔。18h后轉(zhuǎn)染siRNA，高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染AntagomiR-182，低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-182分別作為實驗組。以不干擾任何基因的相應(yīng)的MicroRNA為對照組，每組重復(fù)3次，LipofectamineTMRNAiMAX的用量為0.25μL/孔，RNA的用量為5pmol/孔，6h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染72h后吸去培養(yǎng)基，每孔換成含有10%的CCK-8的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1h。在酶標(biāo)儀上檢測細(xì)胞活力值。

1.4 細(xì)胞的侵襲和遷移實驗

將MDA-MB-231細(xì)胞和MCF7細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。18h后轉(zhuǎn)染siRNA，高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染AntagomiR-182，低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-182，分別作為實驗組。以不干擾任何基因的MicroRNA為對照組，每組重復(fù)3次，LipofectamineTMRNAiMAX的用量為0.25μL/孔，RNA的用量為5pmol/孔，6h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24h后，將基質(zhì)膠和DMEM培養(yǎng)基以1∶3的比例混合后每孔上室加入20μL，放入37℃培養(yǎng)箱靜置30min，使膠凝結(jié)。將轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞消化打散，取100000個細(xì)胞，加入Transwell小室上層，總體積為100μL，不含血清，每組用3個小室。小室下層中加入600μL含有10%血清的培養(yǎng)基。48h后將Transwell小室用4%多聚甲醛固定，然后將上層膜的細(xì)胞輕輕擦除，下層膜的細(xì)胞用DAPI染色。將染色后的下層膜的細(xì)胞置于熒光顯微鏡下拍照，每個小室隨機(jī)選取5個視野，20×物鏡觀察。對每張照片中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計。

1.5 qRT-PCR

使用TRIzol抽取總RNA，并采用RNA-PCR試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用Sybr GreenMaster Mix(TaKaRa公司)行qRT-PCR，見表1。以GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化參照，使用ΔΔCt法計算不同基因的相對表達(dá)狀況。

表1 qRT-PCR中采用的引物序列

1.6 ELISA實驗

將MCF-7、HUVEC細(xì)胞分別接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到50%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實驗組轉(zhuǎn)染miR-182，陰性對照組轉(zhuǎn)染si-NC。轉(zhuǎn)染使用Lipofectami-neTMRNAiMAX Reagent試劑盒。轉(zhuǎn)染48h后，收集上清液，依ELISA試劑盒說明書操作檢測VEGF表達(dá)量變化。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 熒光素酶基因報告及內(nèi)源基因表達(dá)結(jié)果

預(yù)測結(jié)果顯示FOXF2基因的3′UTR序列端的2個靶點的目的片段分別為485～491(U1)、688～695(U2)，見表2。MiRNA靶點突變測試報告測試MCF-7，發(fā)現(xiàn)FOXF2-U1熒光素酶活性降低不顯著(P=0.145)，而FOXF2-U2熒光素酶活性降低較為明顯(P=0.001)。即FOXF2基因的688～695靶點為has-miR-182的預(yù)測靶點。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-182后MCF-7中FOXF2表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。

表2 has-miR-182與FOXF2的結(jié)合靶點表

2.2 miR-182對細(xì)胞增殖影響

細(xì)胞CCK-8增殖實驗發(fā)現(xiàn)，高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞，轉(zhuǎn)染AntagomiR-182后使其表達(dá)抑制，細(xì)胞增殖能力下降(P<0.01)，與預(yù)期結(jié)果相符；低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-182使其過表達(dá)，細(xì)胞增殖能力提高(P<0.01)，與預(yù)期結(jié)果相符，見圖1。

圖1 CCK-8中MDA-MB-231與MCF-7細(xì)胞系增殖率Fig.1 Proliferation rate of MDA-MB-231 and MCF-7 cell lines with CCK-8與Si-NC組比較，*P<0.01

2.3 細(xì)胞的侵襲和遷移實驗結(jié)果

Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組細(xì)胞膠穿(侵襲)和空穿(遷移)數(shù)量相比，轉(zhuǎn)染了AntagomiR-182的MDA-MB-231細(xì)胞膠穿和空穿數(shù)量減少(P<0.05)；與對照組細(xì)胞膠穿和空穿數(shù)量相比，轉(zhuǎn)染了miR-182的MCF-7細(xì)胞膠穿和空穿數(shù)量增多，且較為明顯(P<0.01)，見表3。

表3 Transwell實驗?zāi)z穿與空穿細(xì)胞計數(shù)

2.4 qRT-PCR檢測MCF-7和HUVEC細(xì)胞系中VEGF基因表達(dá)

轉(zhuǎn)染miR-182的MCF-7細(xì)胞系和HUVEC的VEGF基因表達(dá)情況如圖2。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞系和HUVEC的VEGF基因表達(dá)與miR-182的濃度無關(guān)(P>0.05)。

圖2 MCF-7和HUVEC細(xì)胞系中VEGF基因表達(dá)Fig.2 VEGF gene expression in MCF-7 and HUVEC cell linesA： VEGF基因在MCF-7細(xì)胞系中表達(dá)；B： VEGF基因在HUVEC細(xì)胞系中表達(dá)

2.5 ELISA檢測MCF-7和HUVEC細(xì)胞系中VEGF蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染miR-182后，MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中VEGF蛋白較對照組含量升高(P=0.021，見圖3)；而HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中VEGF蛋白含量升高更加顯著(P=0.004)，見圖4。

圖3 細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中VEGF蛋白含量的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of VEGF protein in the cell culture medium

圖4 MCF-7和HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中VEGF蛋白含量Fig.4 VEGF protein content in MCF-7 and HUVEC cell culture medium與si-NC組比較，*P<0.05

3 結(jié) 論

本研究通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灒炞C了FOXF2基因的688～695靶點為has-miR-182的靶點。細(xì)胞的CCK-8增殖實驗發(fā)現(xiàn)，對于高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞，轉(zhuǎn)染AntagomiR-182使其表達(dá)抑制，細(xì)胞增殖能力下降；對于低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-182使其過表達(dá)，細(xì)胞增殖能力有所提高，與預(yù)期結(jié)果相符。通過transwell實驗發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-231細(xì)胞中，AntagomiR-182可以抑制細(xì)胞遷移和浸潤能力；在MCF-7細(xì)胞中，miR-182可以促進(jìn)細(xì)胞遷移和浸潤能力。轉(zhuǎn)染miR-182后，MCF-7和HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中VEGF蛋白含量均升高，但miR-182對VEGF基因基本沒有影響。

三陰性乳腺癌侵襲性強(qiáng)，復(fù)發(fā)早，預(yù)后差，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，缺乏內(nèi)分泌及抗HER-2治療靶點，是乳腺癌研究的熱點和難點。Liu等[6]報道了miR-182促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖和遷移，抑制其凋亡等；Kong等[7]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXF2低表達(dá)可能與乳腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Lei等[8]發(fā)現(xiàn)，miR-182的高表達(dá)與乳腺癌的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，Hirata等[9]發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-182-5p可下調(diào)FOXF2促進(jìn)前列腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移，但目前尚無系統(tǒng)研究miR-182與靶基因FOXF2之間的相關(guān)性及其與TNBC病理學(xué)特征之間的關(guān)系。前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，miR-182在三陰性乳腺癌組織中高表達(dá)，并與差預(yù)后相關(guān)。本研究在FOXF2基因的3′UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)了兩個miR-182的結(jié)合位點(U1和U2)，可能是其潛在靶基因。3′UTR區(qū)域的熒光素酶報告質(zhì)粒驗證，初步確認(rèn)FOXF2-U2為miR-182的靶基因。進(jìn)一步的體外細(xì)胞實驗證明，has-miR-182通過與FOXF2基因的688～695靶點結(jié)合，降解靶基因FOXF2。CCK-8實驗及Transwell實驗表明，has-miR-182可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，提高癌細(xì)胞浸潤和遷移。miR-182作為乳腺癌促癌因素，直接作用于FOXF2基因，引起該基因下調(diào)，導(dǎo)致該通路所調(diào)控的細(xì)胞凋亡受到抑制，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、浸潤和遷移，最終影響TNBC患者預(yù)后。進(jìn)一步的研究應(yīng)致力于闡明has-miR-182的致癌機(jī)制，從而更深入認(rèn)識TNBC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移影響因素。

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