骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)牙周組織再生的影響

倪 璞， 劉宏偉

(同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙周教研室，上海 200072)

種子細(xì)胞是牙周組織工程成功的關(guān)鍵因素之一，牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)，牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cells, PDLCs)及軀干骨來(lái)源的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)均被證明是牙周再生良好的種子細(xì)胞[1-3]。但種子細(xì)胞來(lái)源較少，培養(yǎng)難度較大，難以用于臨床治療。有外國(guó)學(xué)者利用骨髓充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stems, BMMSCs)培養(yǎng)液上清液制備瓊脂糖凝膠，填入大鼠顱骨缺損，刺激骨缺損周圍旁分泌因素，成功促進(jìn)骨缺損的再生[4]。本實(shí)驗(yàn)選取不同種子細(xì)胞及BMMSCs細(xì)胞的培養(yǎng)液，比較這些培養(yǎng)液對(duì)SD大鼠牙周組織的修復(fù)效果，為進(jìn)一步復(fù)雜的牙周組織工程的研究及臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與儀器

同批次6周齡雄性SD大鼠(SPF級(jí))，購(gòu)自同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；低糖型DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、谷氨酰胺、青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；0.25%胰蛋白酶、瓊脂糖粉劑、CO2恒溫孵箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；YJ-875型超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備廠；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)購(gòu)自日本Nikon公司；10cm培養(yǎng)皿及15、50mL離心管購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMMSCs的培養(yǎng) 選取6周齡SD大鼠，予1%戊巴比妥鈉0.006mL/g對(duì)大鼠行腹腔麻醉，75%乙醇浸泡5min，無(wú)菌條件下取出大鼠雙側(cè)股骨及脛骨，在無(wú)菌PBS中剝離多余組織，反復(fù)沖洗干凈。剪開兩端骨骼處，用5mL注射器抽取含10% FBS和1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)液從一端打入，沖出骨髓狀物滴至含有同樣培養(yǎng)液的10cm培養(yǎng)皿中，吹打成細(xì)胞懸液，置于5% CO2、37℃、95%飽和濕度的孵育箱中孵育。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底80%時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰酶消化，1∶3傳代。取3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 人牙周膜細(xì)胞培養(yǎng) 取正畸患者拔除的損壞較少的前磨牙，浸泡于含1%雙抗的低糖DMEM中，無(wú)菌條件下刮取牙根中1/3的牙周膜組織，剪成1.0mm×1.0mm×1.0mm小塊，平鋪于10cm培養(yǎng)皿底，加入含10% FBS和1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃、95%飽和濕度的孵育箱中孵育。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底80%時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰酶消化，1∶2傳代。取3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組，每組填入不同的材料。實(shí)驗(yàn)組： 填入BMMSCs培養(yǎng)液(BMMSCs-CM)凝膠；對(duì)照組： 填入BMMSCs凝膠(BMMSCs)或填入牙周膜細(xì)胞凝膠(PDLCs)?？瞻捉M： 無(wú)任何填充物。

1.2.4 BMMSCs培養(yǎng)液提取 取3～5代大鼠BMMSCs鋪滿皿底80%時(shí)，使用僅含雙抗的低糖DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，48h后收集上清液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 凝膠制備 實(shí)驗(yàn)組： 取BMMSCs培養(yǎng)液上清液，每毫升加入0.045g瓊脂糖粉劑，烘箱加熱至37℃溶解，冷卻至室溫凝結(jié)后即投入實(shí)驗(yàn)使用。對(duì)照組： 各自取3～5代大鼠BMMSCs和PDLCs離心(離心半徑30cm，2000r/min，5min)，棄上清液。離心后的BMMSCs及PDLCs，以PBS稀釋混勻，維持細(xì)胞濃度為3×105/mL?；靹颍亢辽屑尤?.045g瓊脂糖粉劑，加熱至37℃溶解，冷卻至室溫凝結(jié)后即投入實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.6 ELISA檢測(cè)BMMSCs培養(yǎng)液 取實(shí)驗(yàn)組預(yù)備好的BMMSCs培養(yǎng)液、對(duì)照組不含血清的低糖DMEM，按試劑盒說(shuō)明制備檢測(cè)樣品，對(duì)IGF-1、VEGF、PDGF-BB、BMP-2進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 BMMSCs-CM誘導(dǎo)后RT-PCR及Western印跡法檢測(cè) 分別利用實(shí)驗(yàn)組BMMSCs的培養(yǎng)液上清及對(duì)照組含10%FBS及雙抗的低糖DMEM的常規(guī)培養(yǎng)液對(duì)PDLCs進(jìn)行培養(yǎng)，48h后收集兩組PDLCs，提取總RNA，按照TRIzol Reagent試劑盒說(shuō)明，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按RT-PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及cDNA擴(kuò)增，再后對(duì)OPN、OCN、Runx2進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。將兩組誘導(dǎo)后的PDLCs，采用RIPA法提取細(xì)胞蛋白，依BCA法檢測(cè)蛋白濃度并統(tǒng)一上樣，15%分離膠和5%濃縮膠行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，放入BSA封閉液中搖床上2h，一抗孵育過(guò)夜，二抗孵育2h，行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。分析牙周膜細(xì)胞OPN、OCN、Runx2蛋白表達(dá)情況。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.8 大鼠牙周缺損模型制備 取同批次6周齡雄性SD大鼠，將大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。1%戊巴比妥鈉麻醉后，用微創(chuàng)牙齦分離器和刀片翻開左下頜第一磨牙頰側(cè)牙齦，使用低速裂鉆并以裂鉆直徑為標(biāo)準(zhǔn)，生理鹽水冷卻下磨除范圍為近根到遠(yuǎn)中根，高度為1mm，見(jiàn)圖1。分別向各組缺損中填充預(yù)備好的材料，術(shù)后嚴(yán)密縫合，無(wú)需放置牙周塞治劑，術(shù)中隨時(shí)吸取血液、唾液及生理鹽水。術(shù)后正常飲食。填充材料后4周每組處死3只，8周每組處死5只大鼠，分離左側(cè)下頜骨，4%多聚甲醛中體外固定48～72h。

圖1 左下頜第一磨牙磨除頰側(cè)牙槽骨后橫斷面示意圖Fig.1 The cross section of the first molar of the left mandible

1.2.9 Micro-CT掃描及分析 利用Micro-CT系統(tǒng)在0.5mm鋁濾過(guò)、70kV電壓和200μA電流的條件下，將取下的頜骨以15μm分辨率掃描并三維重建。每個(gè)樣本均選擇其中有效的195張二維圖像，勾畫出第一磨牙頰側(cè)及根分叉區(qū)自牙根尖至牙槽嵴頂?shù)难啦酃峭鈬喞?，利用系統(tǒng)自帶軟件計(jì)算，新生骨率，公式如下：

BVd表示術(shù)后即刻處死的大鼠下頜第一磨牙頰側(cè)及根分叉區(qū)牙槽骨體積；BVc表示術(shù)前處死的同齡同批次未經(jīng)處理的大鼠同區(qū)域牙槽骨體積；BVd‘表示術(shù)后4周及8周處死的大鼠下頜第一磨牙頰側(cè)及根分叉區(qū)牙槽骨體積；BVc’表示術(shù)后4周及8周處死的同齡同批次未經(jīng)處理的大鼠同區(qū)域牙槽骨體積；BVd/BVc表示術(shù)后即刻剩余骨率；BVd‘/BVc’表示術(shù)后4周或8周剩余骨率；1-BVd/BVc表示術(shù)后即刻骨缺損率。

1.2.10 組織學(xué)分析 用EDTA-甘油溶液完全脫鈣后，沖水，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟后石蠟包埋，切片。H-E染色： 切片脫蠟入水，蘇木精染色8min，沖水返藍(lán)，伊紅染色2min，沖水，梯度脫水，透明，封片。40倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS20.0軟件對(duì)RT-PCR及Micro-CT所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠BMMSCs

體外培養(yǎng)原代大鼠BMMSCs，24h后部分貼壁，48～72h后可觀察到少量短梭形或多角形細(xì)胞貼壁，1～2d后呈集落狀生長(zhǎng)，5～7d后細(xì)胞匯合達(dá)到80%，可消化傳代。傳代后細(xì)胞呈梭形，P3～P5代細(xì)胞增殖迅速，形態(tài)穩(wěn)定，見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠BMMSCs形態(tài)(×100)Fig.2 Morphology of BMMSCs(×100)

2.2 人牙周膜細(xì)胞

用組織塊法培養(yǎng)PDLCs，5～7d內(nèi)貼壁組織塊邊緣有細(xì)胞爬出，呈長(zhǎng)梭形，數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間增加而增多。15～18d后細(xì)胞匯合達(dá)到80%，可消化傳代。傳代后細(xì)胞呈梭形，P3～P5代細(xì)胞增殖迅速，形態(tài)穩(wěn)定，見(jiàn)圖3。

圖3 人牙周膜細(xì)胞形態(tài)(×100)Fig.3 Morphology of PDLCs(×100)

2.3 生長(zhǎng)因子含量檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液內(nèi)檢測(cè)到IGF-1含量約1084.027pg/mL, VEGF含量約5.073pg/mL，未檢測(cè)到PDGF-BB及BMP-2。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)液內(nèi)則未檢測(cè)到任何生長(zhǎng)因子。表明BMMSCs分泌了大量的生長(zhǎng)因子，并累積在培養(yǎng)液中。

2.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)后相關(guān)基因的表達(dá)

RT-PCR檢查結(jié)果顯示： BMMSCs培養(yǎng)液誘導(dǎo)組的骨相關(guān)基因OPN、OCN、Runx2表達(dá)均增高(P<0.05)，見(jiàn)表2。Western印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示： 經(jīng)BMMSCs培養(yǎng)液誘導(dǎo)后，OPN、OCN、Runx2表達(dá)增高，優(yōu)于常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)效果(P<0.05)，結(jié)果與RT-PCR一致，見(jiàn)圖4。

表2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

圖4 Western印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.4 Detection of related proteins by Western blotting與DMEM培養(yǎng)基比較，*P<0.05

2.5 Micro-CT三維重建

術(shù)后4周和8周的Micro-CT三維重建結(jié)果顯示： 8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠下頜骨第一磨牙頰側(cè)牙槽骨恢復(fù)情況較好，已基本恢復(fù)牙槽骨術(shù)前形態(tài)。對(duì)照組及空白組牙槽骨恢復(fù)較差，見(jiàn)圖5。

圖5 術(shù)后4周及8周左側(cè)下頜骨micro-CT三維重建Fig.5 Micro-CT 3D reconstructions of the Mandible in 4 weeks and 8 weeks after the operation

2.6 Micro-CT定量分析結(jié)果

Micro-CT三維掃描結(jié)果顯示： 4周時(shí)，各組新生骨率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組新生骨率明顯高于對(duì)照組及空白組(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 各組8周時(shí)新生骨率

2.7 組織學(xué)表現(xiàn)

H-E染色結(jié)果顯示： 4周時(shí)，各組第一磨牙頰側(cè)牙槽骨在術(shù)后恢復(fù)的形態(tài)影像學(xué)表現(xiàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故僅對(duì)8周時(shí)做比較。術(shù)后8周的切片結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組近中根頰側(cè)均出現(xiàn)不同程度骨覆蓋，形態(tài)不規(guī)則，由于在牙根標(biāo)記切線制作過(guò)程中及術(shù)后恢復(fù)過(guò)程中，出現(xiàn)生理等不可預(yù)見(jiàn)問(wèn)題，且切片過(guò)程中，切片角度及包埋角度無(wú)法做到完全一致，故該結(jié)果只能作為參考，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，見(jiàn)圖6。對(duì)部分實(shí)驗(yàn)組切片頰側(cè)進(jìn)行放大，可見(jiàn)牙周膜結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖7。

圖6 8周時(shí)左下頜第一磨牙近中根雙側(cè)改建H-E染色(×4)Fig.6 H-E staining of the rat mandibular first molar(×4)

圖7 8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組左下頜第一磨牙近中根頰側(cè)改建H-E染色結(jié)果(×40)Fig.7 H-E staining of the rat mandibular first molar buccal side(×40)箭頭處為牙周膜

3 討 論

PDLCs是一組異質(zhì)性的細(xì)胞群，由成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞及未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞多種細(xì)胞組成。Wang等[4]發(fā)現(xiàn)： 牙周膜干細(xì)胞更多存在于牙槽骨表面的牙周膜中，分離培養(yǎng)的牙槽骨表面的牙周膜干細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力和成骨成纖維分化的潛能。PDLCs是最具有牙周結(jié)締組織附著再生能力的細(xì)胞，但仍然難以滿足臨床治療和實(shí)驗(yàn)研究的需求。BMMSCs雖對(duì)很多特殊疾病有療效，但實(shí)際操作中，常有移植后2d到數(shù)周，細(xì)胞消失的情況[5]。故Chen等[6]提出BMMSCs移植至缺損處后，其生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子的分泌能刺激缺損周邊的旁分泌因素，并能在BMMSCs的培養(yǎng)液中累積。

Osugi等[7]利用BMMSCs培養(yǎng)液制備凝膠，填入大鼠顱骨缺損，成功促進(jìn)骨缺損的再生。從發(fā)育角度看，頜骨與其他顱面部骨骼一樣來(lái)自于神經(jīng)外胚層的神經(jīng)嵴細(xì)胞[8]，而細(xì)胞培養(yǎng)液易于獲取，且其數(shù)量巨大，如其也能通過(guò)刺激牙周缺損處的旁分泌因素，從而達(dá)到了修復(fù)牙周缺損的效果，則為牙周組織的再生提供了新的途徑和可能。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ELISA法對(duì)BMMSCs培養(yǎng)液及低糖DMEM中的生長(zhǎng)因子濃度進(jìn)行檢測(cè)，僅在培養(yǎng)液中檢測(cè)到VEGF及IGF-1，未檢測(cè)到其他指標(biāo)，DMEM中則未檢測(cè)到任何生長(zhǎng)因子。表明BMMSCs分泌了大量的生長(zhǎng)因子，并累積在培養(yǎng)液中。

Runx2在成骨分化的信號(hào)過(guò)程中起核心作用，能誘導(dǎo)細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化。OCN、OPN是細(xì)胞質(zhì)和胞外分泌蛋白，是成骨分化的重要指標(biāo)。利用BMMSCs培養(yǎng)液對(duì)PDLCs進(jìn)行48h的培養(yǎng)后，對(duì)以上指標(biāo)進(jìn)行RT-PCR和Western印跡法的分析，對(duì)比于常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)的PDLCs，三組指標(biāo)均顯示BMMSCs培養(yǎng)液組表達(dá)較高。這說(shuō)明BMMSCs培養(yǎng)液中含有的大量生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)PDLCs向成骨分化。綜上分析得出如下結(jié)論： (1) 種子細(xì)胞可分泌大量生長(zhǎng)因子，并在培養(yǎng)液中累積；(2) 經(jīng)過(guò)BMMSCs培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞，成骨能力增強(qiáng)，更有利于牙周組織的再生。

目前,尚無(wú)相關(guān)利用細(xì)胞培養(yǎng)液恢復(fù)牙周組織的研究，且本課題組前期研究利用BMMSCs和PDLCs雙膜片與牙根復(fù)合進(jìn)行了動(dòng)物的原位移植(牙生物性種植)，系單個(gè)牙位實(shí)驗(yàn)，故本實(shí)驗(yàn)亦選擇單個(gè)磨牙牙位(大鼠下頜第一磨牙近遠(yuǎn)中約1mm)的頜骨范圍為實(shí)驗(yàn)區(qū)域。本實(shí)驗(yàn)將PDLCs及BMMSCs兩種種子細(xì)胞及BMMSCs的培養(yǎng)液分別制備凝膠，放入統(tǒng)一規(guī)格的牙周缺損模型處進(jìn)行比較，Micro-CT分析結(jié)果表明，同等情況下，BMMSCs培養(yǎng)液比細(xì)胞更能促進(jìn)和誘導(dǎo)缺失的頜骨再生。BMMSCs-CM組的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，牙槽骨恢復(fù)情況已接近術(shù)前狀態(tài)。組織學(xué)分析結(jié)果提示，BMMSCs-CM組恢復(fù)了部分牙周膜結(jié)構(gòu)。

在頜骨微環(huán)境(micro-environment)中，多種細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及體內(nèi)的各種細(xì)胞因子相互作用共同促成了組織發(fā)育的過(guò)程，在此過(guò)程中，各種信號(hào)分子通過(guò)微環(huán)境調(diào)控，導(dǎo)致了細(xì)胞的遷移，增殖和分化。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)軀干骨的BMSCs通過(guò)血管通道到達(dá)牙周組織參與修復(fù)[9]?？梢?jiàn)，頜骨微環(huán)境十分復(fù)雜，且與牙周組織的再生密不可分。目前，已有多種生物活性分子已被證明具有較強(qiáng)的促進(jìn)牙周組織修復(fù)的功能，包括TGF-β、IGF、BMP、PDGF、bFGF、EMD[10-12]等。

綜上所述，BMMSCs培養(yǎng)液在頜骨微環(huán)境中能更好地刺激原位細(xì)胞再生，這可能是由于BMMSCs培養(yǎng)液內(nèi)可能累積了大量可以刺激缺損周邊的旁分泌因素的細(xì)胞因子等。但并非所有實(shí)驗(yàn)組大鼠都恢復(fù)了牙周膜結(jié)構(gòu)，這可能是因?yàn)椋?(1) 缺損模型制備時(shí)可能牙骨質(zhì)受到損傷，導(dǎo)致恢復(fù)時(shí)牙本質(zhì)與牙槽骨直接結(jié)合，從而未能有效形成牙骨質(zhì)及牙周膜結(jié)構(gòu)；(2) 所使用的大鼠BMMSCs并非來(lái)自頜骨，而是來(lái)自軀干骨，頜骨微環(huán)境相當(dāng)復(fù)雜，非自體原位的細(xì)胞受到的不利影響較多；(3) 術(shù)后恢復(fù)過(guò)程中有炎癥的存在，導(dǎo)致牙周膜結(jié)構(gòu)無(wú)法正常形成。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BMMSCs培養(yǎng)液在頜骨微環(huán)境中能更好的刺激各種信號(hào)分子，增強(qiáng)缺損周邊乃至軀干骨的相關(guān)細(xì)胞向缺損處遷徙，從而達(dá)到修復(fù)牙周組織的效果。這可能是由于BMMSCs培養(yǎng)液中積累了大量能刺激旁分泌因素的生長(zhǎng)因子等。這為牙周組織再生提供了新的途徑，但培養(yǎng)液利用旁分泌因素的具體機(jī)制，仍需進(jìn)一步探討。

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