AEP小分子抑制劑compound#11對(duì)小鼠脊髓損傷的修復(fù)作用

林 升， 羅丹丹， 李 琛， 孫 毅,

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，上海 200092； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院干細(xì)胞臨床轉(zhuǎn)化中心，上海 200065)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)通常會(huì)造成永久性感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)功能障礙，難以治愈。天冬酰胺內(nèi)肽酶(asparagine endopeptidase, AEP) 與年齡密切相關(guān),在衰老大腦中表達(dá)上調(diào)并被活化。在酸性緩沖液中可剪切β淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid β precursor protein, APP)以及Tau蛋白[1]，因而影響認(rèn)知功能。而敲除了AEP基因的老年小鼠則不能剪切APP。最近，Emory大學(xué)Zhang等[2](KeqiangYe團(tuán)隊(duì))通過(guò)小分子藥物高通量篩選，找到AEP特異性小分子抑制劑，暫時(shí)命名為compound#11，4-(哌啶-1-取代)苯胺基團(tuán)是其關(guān)鍵藥效基團(tuán)。其能與AEP結(jié)合，在初級(jí)神經(jīng)元中阻斷APP和Tau蛋白的剪切[2]。脊髓損傷部位的炎性微環(huán)境中，由于K+大量外流[3]導(dǎo)致?lián)p傷部位細(xì)胞的胞內(nèi)基質(zhì)的pH值比正常組織略低，而且會(huì)大量表達(dá)某些種類(lèi)的蛋白酶[4]。其中，損傷部位的AEP表達(dá)量上調(diào)，推測(cè)其活性也會(huì)升高。但是其是否有助于SCI小鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)及功能的恢復(fù)尚不明確。所以，本研究觀(guān)察腹腔注射compound#11對(duì)SCI小鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)及運(yùn)動(dòng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年雌性C57BL/6小鼠28只，8～10周齡，體質(zhì)量(20±1.0)g，購(gòu)于斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)公司，由同濟(jì)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，SPF級(jí)別。溫度(20±3)℃，濕度(50±20)%，每日光照12h，全營(yíng)養(yǎng)鼠糧及適當(dāng)飲食用水；compound#11由Keqiang Ye教授實(shí)驗(yàn)室提供；丙戊酸(VPA)購(gòu)于Sigma公司；解剖顯微鏡購(gòu)于Olympus公司；Rotarod轉(zhuǎn)棒儀購(gòu)于濟(jì)南益延科技公司；肌電誘發(fā)電位儀購(gòu)于丹麥丹迪公司；顯微鏡和數(shù)碼攝像顯微圖像系統(tǒng)購(gòu)于Leica公司；改造動(dòng)脈夾，維持前端壓力恒定為60g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組、模型制作及給藥 (1) 動(dòng)物分組。將28只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為compound#11干預(yù)組、VPA干預(yù)組、生理鹽水對(duì)照組、假手術(shù)組，每組7只。(2) 小鼠脊髓損傷模型的構(gòu)建。采用腹腔注射5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，背部去毛，將小鼠固定于手術(shù)臺(tái)上。除假手術(shù)組以外的3組小鼠，在外科顯微鏡下，縱行切開(kāi)皮膚去除T9椎板，充分暴露T9脊髓節(jié)段后采用改造后的動(dòng)脈夾鉗夾脊髓3s造成急性脊髓損傷模型。假手術(shù)組只行椎板切除術(shù)，未進(jìn)行脊髓鉗夾。逐層縫合肌肉、皮膚，將術(shù)后小鼠安置于體溫維持墊上蘇醒；術(shù)后輔助小鼠排尿每日2次，每次排尿后使用碘伏消毒尿道。(3) 給藥方法。術(shù)后蘇醒30min給藥。compound#11干預(yù)組腹腔注射compound#11 10mg/kg，每日1次，連續(xù)28d；VPA干預(yù)組腹腔注射VPA 200mg/kg，每日1次，連續(xù)7d；生理鹽水對(duì)照組在每日相同時(shí)間點(diǎn)，腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)28d。

1.2.2 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)方法 術(shù)后7、14、21、28d，進(jìn)行BMS評(píng)分、Rotarod檢測(cè)，對(duì)小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。所有的行為學(xué)評(píng)價(jià)采用雙盲方法。BMS評(píng)分： 內(nèi)容包括后肢各關(guān)節(jié)活動(dòng)度、后肢步態(tài)和協(xié)調(diào)性、運(yùn)動(dòng)時(shí)爪子的精細(xì)運(yùn)動(dòng)，主評(píng)分滿(mǎn)分9分，副評(píng)分滿(mǎn)分11分。Rotarod檢測(cè)： 依據(jù)小鼠在固定轉(zhuǎn)速下所能承受的最長(zhǎng)時(shí)間，來(lái)比較組間差異。規(guī)定最長(zhǎng)時(shí)間不超過(guò)60s。

1.2.3 電生理 采用運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(motor evoked potentials, MEP)評(píng)價(jià)SCI后脊髓傳導(dǎo)功能完整性。評(píng)價(jià)指標(biāo)包MEP的潛伏期、波幅。小鼠經(jīng)鹽酸氯胺酮注射液麻醉，測(cè)試均重復(fù)2次，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.4 組織形態(tài)觀(guān)察方法 H-E染色： 術(shù)后28d小鼠處死,取脊髓組織在4%多聚甲醛中固定,用石蠟包埋,連續(xù)切片,進(jìn)行H-E染色,顯微鏡下觀(guān)察并拍照。免疫組化： 術(shù)后28d對(duì)小鼠進(jìn)行在體灌注，分離出來(lái)的脊髓組織置于OCT中，并在液氮中冰凍OCT完全變成固體后，-80℃冰箱過(guò)夜。冰凍切片機(jī)切片后，滴加一抗、二抗進(jìn)行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)評(píng)價(jià)

損傷后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠BMS雙盲法評(píng)分見(jiàn)表1。28d后，compound#11干預(yù)組、VPA干預(yù)組、生理鹽水對(duì)照組BMS評(píng)分與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雖然compound#11干預(yù)組、VPA干預(yù)組與生理鹽水對(duì)照組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但兩給藥組BMS評(píng)分在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)都高于生理鹽水對(duì)照組，評(píng)分呈總體升高的趨勢(shì)，見(jiàn)圖1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組BMS評(píng)分統(tǒng)計(jì)

在5r/min條件下，compound#11干預(yù)組、VPA干預(yù)組、生理鹽水對(duì)照組能夠承受最長(zhǎng)時(shí)間分別為(18.9±0.75)、(18.7±0.85)、(16.5±1.07)s，均顯著低于假手術(shù)組[(60±0.00)s，P均<0.05]；compound#11干預(yù)組、VPA干預(yù)組高于生理鹽水對(duì)照組(P<0.05)。

雖然compound#11干預(yù)組、VPA干預(yù)組與生理鹽水對(duì)照組BMS評(píng)分無(wú)明顯差異，但在耐力實(shí)驗(yàn)中，Rotarod能檢測(cè)到其差異性存在，見(jiàn)圖1～2。由此可知，損傷后需采用不同的敏感檢測(cè)方式全方面的評(píng)估功能恢復(fù)才能獲得更為完善、可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.2 組織學(xué)分析

損傷后28d，鉗夾損傷區(qū)軸突脫髓鞘明顯，神經(jīng)元減少，角質(zhì)細(xì)胞增生發(fā)生改變，受損部位的下行神經(jīng)元凋亡，膠質(zhì)瘢痕形成；生理鹽水組與compound#11干預(yù)組、VPA干預(yù)組相比，呈現(xiàn)出更加活躍的膠質(zhì)細(xì)胞增生以及更大的空洞面積，神經(jīng)元凋亡程度也稍重于其他給藥兩組，但是給藥組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3～4。

圖1 BMS評(píng)分Fig.1 BMS behavioral score

圖2 Rotarod檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of Rotarod behavioral

圖3 術(shù)后28 d各組H-E染色結(jié)果Fig.3 H-E staining results of compound #11 group, VPA group, saline control groupA： compound#11干預(yù)組；B： VPA干預(yù)組；C： 生理鹽水組

圖4 術(shù)后28d兩組NeuN(b)染色結(jié)果Fig.4 NeuN staining results of compound #11 group, saline control groupA： compound#11干預(yù)組；B： 生理鹽水組

2.3 電生理檢測(cè)結(jié)果

MEP潛伏期的長(zhǎng)短主要由脊髓的破壞程度來(lái)決定，從而反映神經(jīng)傳導(dǎo)速度。MEP波幅則一般反映刺激后，引起同步放電神經(jīng)元數(shù)量的多少。采用MEP來(lái)檢測(cè)損傷脊髓運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)功能，不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠神經(jīng)電生理檢查延長(zhǎng)期結(jié)果見(jiàn)表2、潛伏期結(jié)果見(jiàn)表3。隨著手術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，compound#11干預(yù)組、VPA干預(yù)組、生理鹽水組3組延長(zhǎng)期波幅逐漸增加；compound#11干預(yù)組、VPA干預(yù)組、生理鹽水組3組潛伏期開(kāi)始縮短。compound#11干預(yù)組、VPA干預(yù)組無(wú)論是延長(zhǎng)期波幅還是延長(zhǎng)期時(shí)間都比對(duì)照組的變化趨勢(shì)更好一些，但是3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組神經(jīng)電生理檢查延長(zhǎng)期

表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組神經(jīng)電生理檢查潛伏期

3 討 論

脊髓是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要組成部分，脊髓損傷容易造成肢體癱瘓，如何提高神經(jīng)再生能力、促進(jìn)神經(jīng)環(huán)路重建是脊髓損傷治療所面臨的重要科學(xué)問(wèn)題。小分子藥物(small molecule drugs)是指一類(lèi)可以影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的小分子物質(zhì)，它們通過(guò)作用細(xì)胞中某些關(guān)鍵的信號(hào)通路，使其調(diào)控的下游信號(hào)通路得以抑制或激活[5]，具有神經(jīng)再生、保護(hù)作用和免疫調(diào)節(jié)作用，在維護(hù)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞微環(huán)境方面具有廣闊的應(yīng)用前景[6-9]。比如雷帕霉素是治療脊髓損傷是比較常用的一種小分子免疫抑制劑，減緩炎癥反應(yīng),提高神經(jīng)元的存活率[10]。本研究選擇VPA作為陽(yáng)性對(duì)照組。VPA具有促進(jìn)移植神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷功能的作用，可以提高脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能。但是單獨(dú)使用VPA給藥處理的小鼠與未處理的小鼠相比，并沒(méi)有顯著性改善，猜測(cè)VPA很可能是影響了移植細(xì)胞的功能[11]。

AEP是溶酶體產(chǎn)生的一種半胱氨酸蛋白酶,它可以在天冬氨酸殘基之后剪切蛋白質(zhì)。AEP在衰老大腦中表達(dá)上調(diào)并被活化,并能同時(shí)剪切APP和Tau蛋白[2]，從而影響認(rèn)知功能，并發(fā)現(xiàn)敲除AEP基因的老年小鼠不能再剪切APP。最近,Zhang等[2](Keqiang Ye團(tuán)隊(duì))通過(guò)小分子藥物的高通量篩選,找到了AEP特異性小分子抑制劑compound#11，它能夠與AEP結(jié)合,在初級(jí)神經(jīng)元中阻斷對(duì)APP和Tau蛋白的剪切。通過(guò)對(duì)AD模型鼠給予compound#11，發(fā)現(xiàn)它具有明顯的認(rèn)知及運(yùn)動(dòng)功能修復(fù)[12]。在脊髓損傷部位的炎性微環(huán)境中,由于K+大量外流[3]導(dǎo)致?lián)p傷部位細(xì)胞的胞內(nèi)基質(zhì)的pH值比正常組織略低,而且會(huì)大量表達(dá)某些種類(lèi)的蛋白酶[4]。其中,損傷部位的AEP表達(dá)量上調(diào)。因此,推測(cè)其活性也會(huì)升高。并且，Zhang等[2](Keqiang Ye團(tuán)隊(duì))現(xiàn)已經(jīng)在周?chē)窠?jīng)損傷疾病模型上證實(shí)，compound#11也具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。但是compound#11在脊髓損傷部位是否會(huì)抑制AEP，阻斷其對(duì)APP和Tau蛋白的剪切，從而有助于SCI小鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)及功能的恢復(fù)尚未有相關(guān)研究和文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)脊髓損傷小鼠腹腔注射compound#11，觀(guān)察其對(duì)SCI小鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)及運(yùn)動(dòng)功能的影響。

對(duì)于諸多行為學(xué)評(píng)價(jià)方法，哪種更加客觀(guān)，能夠反應(yīng)真實(shí)情況目前并無(wú)一致結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)采用BMS評(píng)及Rotarod綜合評(píng)價(jià)，和單獨(dú)使用BMS評(píng)分法相比，更進(jìn)一步細(xì)致、全面的評(píng)估小鼠后肢恢復(fù)過(guò)程中的行為學(xué)變化，并且與損傷程度有較高的契合度，結(jié)合評(píng)價(jià)可以判斷細(xì)小動(dòng)作恢復(fù)情況。本研究結(jié)果提示，兩組給藥組與生理鹽水對(duì)照BMS評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是Rotarod測(cè)試證實(shí)小鼠行為學(xué)之間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些行為學(xué)評(píng)價(jià)方法雖便于推廣，但標(biāo)準(zhǔn)復(fù)雜，觀(guān)察人員須要有一定經(jīng)驗(yàn)，并且至少兩名觀(guān)察者分別計(jì)分，以減少主觀(guān)因素影響。

隨著醫(yī)學(xué)電生理學(xué)的快速發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到了誘發(fā)電位在療效評(píng)估和功能評(píng)定方面的重要性。其良好的客觀(guān)性與敏感性，已經(jīng)越來(lái)越多的運(yùn)用于臨床SCI評(píng)價(jià)。MEP是繼SEP后檢測(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)的另一種神經(jīng)電生理檢查方法，提供了更加客觀(guān)、定量的依據(jù)。MEP潛伏期的長(zhǎng)短主要由脊髓的破壞程度來(lái)決定，從而反映神經(jīng)傳導(dǎo)速度[13]。MEP波幅則一般反映刺激后，引起同步放電神經(jīng)元數(shù)量的多少。本研究采用MEP來(lái)檢測(cè)損傷脊髓運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)功能，發(fā)現(xiàn)隨著手術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，compound#11干預(yù)組、VPA干預(yù)組、生理鹽水組3組延長(zhǎng)期波幅逐漸增加，潛伏期開(kāi)始縮短。但組間并無(wú)顯著性差異。

結(jié)合行為學(xué)，組織學(xué)以及電生理結(jié)果來(lái)看，compound#11干預(yù)SCI小鼠后與生理鹽水對(duì)照組相比，修復(fù)作用并沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的原因可能是compound#11類(lèi)似VPA，具有促進(jìn)移植神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷功能的作用，需要與移植干細(xì)胞或者其他治療方法協(xié)同治療脊髓損傷。

綜上所述，在脊髓損傷小鼠模型中，單獨(dú)使用compound#11修復(fù)脊髓損傷，具有一定改善作用，但其臨床藥用價(jià)值有待進(jìn)一步探索?；诒疚臄?shù)據(jù)我們推測(cè)，聯(lián)合使用compound#11與干細(xì)胞移植或者其他治療方法協(xié)同治療，進(jìn)而共同促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)方式可能更為可行。

[1] ZHANG Z, SONG M, LIU X, et al. Cleavage of tau by asparagine endopeptidase mediates the neurofibrillary pathology in Alzheimer’s disease[J]. Nat Med, 2014,20(11)： 1254-1262.

[2] ZHANG Z, SONG M, LIU X, et al. Delta-secretase cleaves amyloid precursor protein and regulates the pathogenesis in Alzheimer’s disease[J]. Nat Commun, 2015,6： 8762.

[3] TATOR C H, FEHLINGS M G. Review of the secondary injury theory of acute spinal cord trauma with emphasis on vascular mechanisms[J]. J Neurosurg, 1991,75(1)： 15-26.

[4] BAREYRE F M, SCHWAB M E. Inflammation, degeneration and regeneration in the injured spinal cord： insights from DNA microarrays[J]. Trends Neurosci, 2003,26(10)： 555-563.

[5] LU B, ATALA A. Small molecules and small molecule drugs in regenerative medicine[J]. Drug Discov Today, 2014,19(6)： 801-808.

[6] HUBBARD S R. Protein tyrosine kinases： autoregulation and small-molecule inhibition[J]. Curr Opin Struct Biol, 2002,12(6)： 735-741.

[7] KHALILI J S, YU X, WANG J, et al. Combination small molecule MEK and PI3K inhibition enhances uveal melanoma cell death in a mutant GNAQ and GNA11 dependent manner[J]. Clin Cancer Res, 18(16)： 4345-4355.

[8] SPIEGEL J, CROMM P M, ZIMMERMANN G, et al. Small-molecule modulation of Ras signaling[J]. Nat Chem Biol, 2014,10(8)： 613-622

[9] MANANDHAR S P, HILDEBRANDT E R, SCHMIDT W K. Small-Molecule Inhibitors of the Rce1p CaaX Protease[J]. J Biomol Screen, 2007,12(7)： 983-993.

[10] LIU D, MCILVAIN H B, FENNELL M, et al. Screening of immunophilin ligands by quantitative analysis of neurofilament expression and neurite outgrowth in cultured neurons and cells[J]. J Neurosci Methods, 2007,163(2)： 310-320.

[11] LV L, HAN X, SUN Y, et al. Valproic acid improves locomotion in vivo after SCI and axonal growth of neurons in vitro[J]. Exp Neurol, 2012,233(2)： 783-790.

[12] ZHANG Z, SONG M, LIU X, et al. Delta-secretase cleaves amyloid precursor protein and regulates the pathogenesis in Alzheimer’s disease[J]. Nat Commun, 2015,6(59)： 8762.

[13] GUHA A, TATOR C H, ROCHON J. Spinal cord blood flow and systemic blood pressure after experimental spinal cord injury in rats[J]. Stroke, 1989,20(3)： 372-377.