金匱腎氣丸對(duì)12月齡雄性小鼠脾組織代謝組 學(xué)增齡改變的影響

梁華，劉麗瑋，馬艷春，王燕，隋雨桐，李奇?zhèn)?，閆起

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

代謝組學(xué)自20世紀(jì)90年代提出開(kāi)始，近三十年得到了廣泛的研究與應(yīng)用，其作為一門(mén)新興的組學(xué)學(xué)科，與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等一起成為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。代謝組學(xué)運(yùn)用精準(zhǔn)的儀器和數(shù)據(jù)通過(guò)對(duì)機(jī)體代謝物的計(jì)量分析，找到代謝物與機(jī)體病理生理變化之間的聯(lián)系，對(duì)相關(guān)疾病的探索研究提供科學(xué)的理論支持[1]。以小見(jiàn)大，從局部分析整體，與中醫(yī)基礎(chǔ)理論不謀而合，代謝組學(xué)有效地將中醫(yī)與現(xiàn)代科學(xué)手段相結(jié)合，為中醫(yī)藥現(xiàn)代研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

金匱腎氣丸是治療腎陽(yáng)虛證的經(jīng)典方劑，由附子、肉桂、熟地黃、山藥、澤瀉等組成。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，金匱腎氣丸可使血液中的SOD升高，MDA降低，明顯改善腎虛癥狀[2]，抑制自由基生成并降低MDA水平，顯著降低細(xì)胞凋亡率，這些作用被認(rèn)為是金匱腎氣丸抗衰老作用的重要的機(jī)制[3]。補(bǔ)腎中藥通過(guò)多種靶點(diǎn)的綜合作用，對(duì)抗衰老發(fā)揮作用，因此補(bǔ)腎與抗衰老之間存在密切聯(lián)系[4]。朱明雪等[5]人對(duì)金匱腎氣丸的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了系統(tǒng)的歸納總結(jié)，發(fā)現(xiàn)金匱腎氣丸對(duì)老齡機(jī)體、陽(yáng)虛機(jī)體和荷瘤機(jī)體有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，為研究抗衰老與免疫學(xué)機(jī)制之間的作用關(guān)系提供了理論基礎(chǔ)。另有研究表明，金匱腎氣丸可有效改善老年前列腺增生患者的臨床癥狀，提高患者的生活質(zhì)量，對(duì)老年性疾病的研究和治療具有重要意義[6]。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)金匱腎氣丸干預(yù)下的增齡小鼠的脾組織代謝物質(zhì)的變化進(jìn)行分析，探索與增齡密切相關(guān)的生物標(biāo)志物及代謝通路，以及金匱腎氣丸的調(diào)節(jié)作用，為今后研究金匱腎氣丸干預(yù)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

美國(guó)Waters公司ACQUITY UPLCTM液相色譜儀，美國(guó)Waters公司W(wǎng)aters LCT Premier XETOF 質(zhì)譜儀，KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)(中國(guó)科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)，MassLynx V4.1工作站，Progenesis QI 2.1軟件，P80MX超速冷凍離心機(jī)，超純水純化系統(tǒng)，-80℃冰箱。

1.2 藥品與試劑

金匱腎氣丸湯劑(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂)；生理鹽水(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司)；屈臣氏蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；色譜甲醇(美國(guó)賽默飛世爾公司)；色譜乙腈(美國(guó)賽默飛世爾公司)；甲酸(北京迪馬科技?xì)W泰科技發(fā)展中心)。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)ICR雄性小鼠，3月齡10只，12月齡20只，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供(許可證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001)。實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，濕度55%±15%，空氣新鮮，12 h避光，12 h光照，自由飲食飲水，喂食固體飼料(購(gòu)自哈爾濱市南崗區(qū)玉英養(yǎng)殖場(chǎng))。

1.4 藥品的制備

金匱腎氣丸配方：干地黃24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g，桂枝3 g，附子3 g，共81 g。加水煎煮兩次，每次1 h，合并藥液，制成生藥濃度為0.81 g/mL的藥液。

1.5 樣品采集與制備

3月齡小鼠10只為空白對(duì)照組，12月齡小鼠20只隨機(jī)分為模型組和金匱腎氣丸組各10只，并分別標(biāo)記。金匱腎氣丸組給藥量為13 mL/(kg·d)，空白組和模型組對(duì)照同體積比生理鹽水。每天上午8:30—9:30之間給藥，共計(jì)30 d。小鼠在第30天禁食，不禁水，次日處死小鼠，取脾組織，測(cè)重標(biāo)記后液氮凍存，后存入-80℃冰箱備用。采用甲醇有機(jī)溶劑沉淀蛋白法，在脾組織中加入10倍甲醇勻漿(冰浴條件下)，勻漿液在12 000×g，4℃條件下離心15 min，取上清液重復(fù)以上離心，最后取200 μL供UPLC-TOP/MS分析。

1.6 分析條件

1.6.1 超高液相色譜條件

色譜柱ACQUITY UPLCTMBEH C18(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；流速0.4 mL/min；柱溫40℃；樣品倉(cāng)溫4℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸—乙腈溶液；流動(dòng)相B：0.1%甲酸—超純水溶液；梯度洗脫條件：0 min，2%A，98%B；15 min，100%A，0%B。

1.6.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)：毛細(xì)管電壓正離子模式下1 300 V；負(fù)離子1 500 V；正離子樣本錐孔電壓60 V；負(fù)離子70 V；脫溶劑溫度350℃；離子源溫度110℃；脫溶劑氣體流速750 L/h；錐孔氣體流速20 L/h；碰撞能60 V；采用美國(guó)Waters公司Lockspray校正系統(tǒng)進(jìn)行在線(xiàn)質(zhì)量校正，正離子模式下校正液為亮氨酸—腦啡肽(Leucine—Enkephalin，[M+N]+556.2771)溶液，負(fù)離子模式下校正液為亮氨酸—腦啡肽(Leucine—Enkephalin，[M+N]-554.2615)溶液；濃度為1 ng/mL，流速20 μL/min；校正頻率為15 s；全掃描方式，質(zhì)量掃描范圍:m/z100—1 500。

1.6.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Progenesis QI 2.1軟件進(jìn)行色譜峰識(shí)別及峰匹配，采用主成分分析法(PCA)和正交偏最小二乘-判別分析法(OPLS-DA)分析青年對(duì)照組與12月模型組的代謝差異物，選取潛在生物標(biāo)志物。

2 結(jié)果

利用代謝組學(xué)研究技術(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從三組樣本的PCA得分圖(圖1、圖2)可見(jiàn)：正負(fù)離子條件下，3月對(duì)照組，12月模型組和金匱組所有樣本有明顯區(qū)分，而金匱組于Y軸上位于3月對(duì)照組與12月模型組之間，并更接近于3月對(duì)照組。表明三組樣本的內(nèi)源性代謝物存在顯著差異，而金匱組對(duì)于12月模型組有顯著回調(diào)作用。對(duì)3月對(duì)照組和12月模型組小鼠進(jìn)行OPLS-DA(圖3、圖4)分析，可見(jiàn)在正負(fù)離子條件下，3月對(duì)照組與12月模型組沿Y軸區(qū)分明顯，說(shuō)明兩組樣品有明顯區(qū)分。在S-Plot圖(圖5、圖6)和VIP散點(diǎn)圖(圖7、圖8)中，碎片離子呈S型、V型排列，并且遠(yuǎn)端更為分散，說(shuō)明對(duì)代謝軌跡產(chǎn)生較大影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)VIP 值大于2且P值小于0.05作為篩選條件，找到對(duì)代謝輪廓變化起關(guān)鍵性作用的內(nèi)源性生物標(biāo)記物。采用 UPLC-HDMS 的方法檢測(cè)標(biāo)記物，利用HMDB及KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并結(jié)合Progenesis QI 2.1軟件進(jìn)行化合物鑒定，確定出與增齡相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物26個(gè)(圖9-1、9-2)，如表1所示，其中11個(gè)代謝差異物表現(xiàn)為不同程度的上調(diào)(2-Octenoic acid、Xanthine、Lactosylceramide (d18:1/12:0)、Taurine、Pyruvic acid、Threonic acid、6,8-Dihydroxypurine、Lipoxin A4、Monoethylhexyl phthalic acid、Canrenone、Isodeoxycholic acid)，15個(gè)代謝差異物表現(xiàn)為不同程度的下調(diào)(Stearoylcarnitine、Glycocholic acid、9-Hexadecenoylcholine、N-Acetylserine、Uric acid、Pyroglutamic acid、17-alpha,20-alpha-Dihydroxypregn-4-en-3-one、Taurodeoxycholic acid、Homoanserine、20-Hydroxyeicosatetraenoic acid、Varanic acid、Dodecanoylcarnitine、Phosphoribosyl-ATP、Docosahexaenoic acid、Arachidonic acid)。如圖9所示，在確定的26個(gè)標(biāo)記物中，金匱組對(duì)其中的9個(gè)具有調(diào)節(jié)作用，分別是Taurodeoxycholic acid、Glycocholic acid、Xanthine、9-Hexadecenoylcholine、Lactosylceramide (d18:1/12:0)、Threonic acid、Homoanserine、6,8-Dihydroxypurine、Monoethylhexyl phthalic acid。將鑒定得到的與增齡相關(guān)的26個(gè)標(biāo)記物輸入METPA數(shù)據(jù)庫(kù)中，得到以下代謝通路(圖10)，將臨界值設(shè)定為0.10，主要得到以下代謝通路：a?；撬岷团；撬岽x(Taurine and hypotaurine metabolism)、b花生四烯酸代謝(Arachidonic acid metabolism)、c、丙酮酸代謝(Pyruvate metabolism)。以上結(jié)果說(shuō)明金匱腎氣丸對(duì)增齡性相關(guān)生物標(biāo)記物及代謝通路有一定的調(diào)節(jié)作用。

圖1 正離子條件下3月對(duì)照組、12月模型組、 金匱組PCA分析后Scores plot圖

圖2 負(fù)離子條件下3月對(duì)照組、12月模型組、 金匱組PCA分析后Scores plot圖

圖3 正離子條件下3月對(duì)照組、12月模型組OPLS—DA圖

圖4 負(fù)離子條件下3月對(duì)照組、12月模型組OPLS—DA圖

圖5 正離子條件下12月模型組S-Plot圖

圖6 負(fù)離子條件下12月模型組S-Plot圖

圖7 正離子條件下12月模型組VIP散點(diǎn)圖

圖8 負(fù)離子條件下12月模型組VIP散點(diǎn)圖

注：↑表示與空白組相比，模型組表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)；↓表示與空白組相比，模型組表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用自然增齡小鼠模型，利用代謝組學(xué)研究方法分析金匱腎氣丸對(duì)12月齡雄性小鼠的內(nèi)源性代謝差異物的調(diào)節(jié)作用，初步判定9個(gè)生物標(biāo)記物：Taurodeoxycholic acid、Glycocholic acid、Xanthine、9-Hexadecenoylcholine、Lactosylceramide (d18:1/12:0)、Threonic acid、Homoanserine、6,8-Dihydroxypurine、Monoethylhexyl phthalic acid。

圖9-1 生物標(biāo)記物在3月空白組、12月模型組、 金匱組中的水平表達(dá)注：與空白組比較，*P<0.05；**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05；##P<0.01

?；侨パ跄懰?Taurodeoxycholic acid)是肝臟中的膽鹽，由脫氧膽酸與?；撬峤Y(jié)合而成，能夠促進(jìn)肝臟的排泄和吸收，并能夠調(diào)節(jié)內(nèi)分泌。?；撬嶙鳛闄C(jī)體組織細(xì)胞中一種重要的小分子含硫氨基酸，具有廣泛的生理調(diào)節(jié)作用。大量實(shí)驗(yàn)證明牛磺酸具有增強(qiáng)免疫、抗氧化抗衰老、保護(hù)心血管、降血糖血脂、減輕脂肪肝、降轉(zhuǎn)氨酶等諸多作用[7]。有研究證實(shí)，?；撬崮軌蛴行p少高糖環(huán)境下線(xiàn)粒體呼吸鏈中活性氧ROS生成，降低ROS活性，從而提高機(jī)體抗氧化能力[8]。?；撬釋?duì)老年雄性大鼠的實(shí)驗(yàn)研究表明，其作用機(jī)制是增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基的能力，從而達(dá)到抗氧化目的，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，從而起到保護(hù)細(xì)胞，延緩衰老的作用[9]。同時(shí)，?；撬釋?duì)降低心肌梗死面積，改善心肌細(xì)胞，促進(jìn)血管新陳代謝，保護(hù)心臟起到重要作用[10]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M?；撬岷枯^空白組顯著降低，表明?；撬犭S增齡而減少，而在金匱腎氣丸給藥后，含量有所上升。

甘氨膽酸(Glycocholic acid)是膽汁酸?；拾彼?，膽汁酸是膽固醇在肝內(nèi)分解以及在腸-肝循環(huán)中的一組代謝產(chǎn)物，膽酸在肝內(nèi)與甘氨酸結(jié)合生成甘氨膽酸，然后隨膽汁排入腸道，膽汁酸是一種生理性的清潔劑，能促進(jìn)脂肪和固醇在腸道和肝臟中的排泄、吸收和運(yùn)輸。有研究表明，高、低劑量不同的甘氨膽酸均能夠不同程度的提高小鼠血漿、腦組織中T-AOC活性，以及小鼠腦組織中GSH活性，表明甘氨膽酸具有重要抗氧化作用[11]。本實(shí)驗(yàn)中模型組甘氨膽酸較空白組明顯降低，推測(cè)機(jī)體隨增齡而抗氧化能力減弱，而金匱腎氣丸給藥后，含量上升，說(shuō)明金匱腎氣丸具有提高抗氧化能力的作用。

黃嘌呤(Xanthine)是嘌呤衍生物，是嘌呤降解途徑的產(chǎn)物?，F(xiàn)代研究表明黃嘌呤氧化酶對(duì)于炎癥、組織修復(fù)以及多種腫瘤的發(fā)展有密切關(guān)系[12]。有學(xué)者研究聯(lián)合黃嘌呤氧化酶抑制劑治療慢性心力衰竭，結(jié)果顯示患者的心功能指標(biāo)有改善[13]。本實(shí)驗(yàn)中金匱腎氣丸組能顯著降低模型組黃嘌呤的含量，可以推斷其能夠提高機(jī)體免疫力，減少炎癥的發(fā)生。

單乙基己基鄰苯二甲酸(Monoethylhexyl phthalic acid,MEHP)是一種活性代謝產(chǎn)物，鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)的主要代謝產(chǎn)物是鄰苯二甲酸單(2-乙基已基)酯(MEHP)，有實(shí)驗(yàn)表明，低劑量的MEHP能刺激MLTC-1細(xì)胞睪酮合成，促進(jìn)相關(guān)酶基因和蛋白基因表達(dá)[14]。而睪酮作為一種重要的雄性激素，對(duì)蛋白質(zhì)合成，免疫功能，抗骨質(zhì)疏松等有重要影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)金匱腎氣丸組中的含量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)較模型組有所回落，表明其能夠促進(jìn)蛋白合成，提高免疫力。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用代謝組學(xué)研究方法，鑒定出在增齡過(guò)程中與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的26個(gè)潛在生物標(biāo)記物，在給予金匱腎氣丸干預(yù)后，9個(gè)生物標(biāo)志物得到調(diào)節(jié)，表明了金匱腎氣丸對(duì)12月雄鼠增齡性變化的干預(yù)作用，為今后研究金匱腎氣丸干預(yù)生長(zhǎng)發(fā)育及其方證相關(guān)的生物學(xué)基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)。

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