肉蓯蓉多糖對(duì)更年期高血壓燥證大鼠內(nèi)分泌 功能調(diào)節(jié)的研究

張娜娜

(開(kāi)封市中醫(yī)院藥學(xué)部，河南 開(kāi)封 475001)

更年期高血壓是由于機(jī)體內(nèi)分泌代謝紊亂并伴有植物神經(jīng)功能失調(diào)從而引發(fā)的血壓波動(dòng)，有近80%的女性會(huì)出現(xiàn)該癥狀，并且該階段血壓波動(dòng)易受到情緒、睡眠等外界因素的干擾，導(dǎo)致血壓變異性較大，常規(guī)降壓藥控制不理想，并且長(zhǎng)期服用有不同程度的不良反應(yīng)發(fā)生?，F(xiàn)代研究更年期血壓異常波動(dòng)可能與患者內(nèi)分泌激素水平變化有明顯關(guān)聯(lián)[1]，臨床治療主要以雌激素替代療法進(jìn)行干預(yù)，而該方法不適用于有激素禁忌癥的患者，如肝腎功能障礙、乳腺癌、糖尿病等，與此同時(shí)也會(huì)增加患者心腦血管疾病及生殖系統(tǒng)副反應(yīng)發(fā)生的幾率[2]；相對(duì)于祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)該疾病的治療，則顯的更具有優(yōu)勢(shì)，中醫(yī)藥辨證組方不但能對(duì)血壓進(jìn)行不同幅度的調(diào)節(jié)，還能改善患者睡眠狀況、減輕患者臨床癥狀，臨床治療以療效確切、毒副作用少等優(yōu)點(diǎn)而受到患者的好評(píng)。肉蓯蓉為列當(dāng)科寄生植物，是“藥食兩用”之品，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有獨(dú)特的醫(yī)藥和保健功能，其中多糖(cistanche deserticola polysaccharides,CDPS)為其主要生物學(xué)活性組分，有研究顯示由肉蓯蓉組方制成的制劑能改善更年期綜合征的臨床癥狀[3]，且肉蓯蓉對(duì)雌性腎虛小鼠有促卵泡發(fā)育、促黃體生成作用，顯示了肉蓯蓉對(duì)雌性腎虛小鼠內(nèi)分泌功能的調(diào)節(jié)作用[4]，但對(duì)于肉蓯蓉多糖的調(diào)節(jié)作用機(jī)制尚未有深入研究，基于此，本研究以更年期婦女患者的臨床指征為基礎(chǔ)復(fù)制更年期高血壓燥證動(dòng)物模型，并給予肉蓯蓉多糖進(jìn)行干預(yù)治療，以考察肉蓯蓉多糖對(duì)更年期患者內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康雌性SPF級(jí)SHR大鼠65只，體質(zhì)量(200.0±15.0)g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(豫)2014-0009。大鼠喂養(yǎng)普通飼料，自由飲水，避免噪聲及其他環(huán)境因素干擾。

1.2 試藥與試劑

肉蓯蓉飲片500 g(購(gòu)自張仲景大藥房,產(chǎn)地：內(nèi)蒙古，批號(hào)20121025)；其他試劑均為分析純。坤泰膠囊(貴陽(yáng)新天藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)140507)；內(nèi)分泌指標(biāo)[雌二醇(estradiol,E2)、促卵泡生成激素(follicle stimulating hormone,FSH)、促黃體酮生成激素(luteinizing hormone,LH)] Elisa檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；神經(jīng)遞質(zhì)[去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、神經(jīng)肽Y(neuropettide Y,NPY)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)] Elisa檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

超聲波清洗器(KQ-300VDV，昆山市超聲儀器有限公司)；島津2010型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本)；ACCESS型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國(guó)BECKMAN COULTER公司)；AB204-S型梅特勒電子天平(北京梅特勒-托利多有限公司)；動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x(BP-100A型，程度泰盟科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 肉蓯蓉多糖的制備

取肉蓯蓉飲片500 g，加10倍量水浸泡30 min，加熱提取2次，每次1.5 h，合并煎液(呈棕紅色)，濃縮至2∶1(體積質(zhì)量比)，離心(3 000 r/min)15 min，取上清液，加入3倍量95%乙醇沉淀，冷藏并靜置24 h，離心分離沉淀，將沉淀物用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌，將洗滌后的沉淀真空干燥，采用蒽酮-硫酸法測(cè)定肉蓯蓉多糖的含量，即得到肉蓯蓉多糖粗品(灰棕紅色，得率為10.13%)。

1.4.2 分組與給藥

所有大鼠購(gòu)回后分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)1周后分組，剔除體質(zhì)量偏差較大的SHR大鼠3只，其余62只按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，分別為SHR組，假手術(shù)組，模型組(更年期高血壓燥證模型)，陽(yáng)性組(坤泰膠囊，1.08 g/kg)，肉蓯蓉高劑量組(相當(dāng)于肉蓯蓉生藥量11.84 g，1.2 g/kg)、低劑量組(相當(dāng)于肉蓯蓉生藥量5.92 g，0.6 g/kg)；按照《藥理實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人間的等效劑量換算》公式換算大鼠給藥劑量，2015版《中國(guó)藥典》肉蓯蓉用量為6～10 g/d，肉蓯蓉多糖粗品1 g相當(dāng)于肉蓯蓉生藥量9.87 g，給藥前取肉蓯蓉多糖適量于滅菌生理鹽水中，配制成0.1 g/mL的肉蓯蓉多糖溶液，陽(yáng)性組取內(nèi)容物配制成濃度為0.1 g/mL的水溶液，按照體質(zhì)量計(jì)算每次給藥劑量，正常對(duì)照組和模型組給予等劑量的生理鹽水。除肉蓯蓉多糖兩個(gè)劑量組分別11只大鼠外，其余三組均為10只。各組動(dòng)物連續(xù)給藥4周，觀察并記錄藥物干預(yù)期間動(dòng)物行為學(xué)特征變化。

1.4.3 動(dòng)物模型的復(fù)制

方法復(fù)制更年期高血壓燥證大鼠模型[5-6]，采用手術(shù)方法摘除雙側(cè)卵巢，復(fù)制更年期高血壓大鼠，在模型復(fù)制成功1周后，每日給予特殊飼料(飼料配方：普通大鼠飼料+0.5%孜然+0.5%五香粉+10%動(dòng)物脂肪+2.5%油炸花生仁+2.5%熟芝麻)100 g，飲用水200 mL，保持飼養(yǎng)籠溫度和相對(duì)濕度恒定，連續(xù)造模3周，復(fù)制更年期高血壓燥證大鼠，模型復(fù)制期間密切觀察動(dòng)物生物學(xué)特性并及時(shí)記錄。

1.4.4 指標(biāo)的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前后大鼠尾動(dòng)脈收縮壓(測(cè)量3次，取平均值)。10%水合氯醛溶液腹腔麻醉(35 mg/kg)，腹主動(dòng)脈取血約5 mL，以3 000 r/min速度離心15 min，分離血清于Eppendorf管，-20 ℃冷凍保存待測(cè)。采用放免法測(cè)定血清內(nèi)分泌指標(biāo)(E2、FSH、LH)。取血后的大鼠迅速斷頭取腦，采用化學(xué)熒光法測(cè)定下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)(5-HT、NE、DA、NPY、5-HIAA)含量。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，首先對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)(KS檢驗(yàn))，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析法進(jìn)行多組間比較；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Chi-square檢驗(yàn)，所有統(tǒng)計(jì)比較以P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 更年期高血壓燥證大鼠模型評(píng)價(jià)

更年期高血壓燥證模型大鼠表現(xiàn)出明顯的好斗、易怒、性情急躁等特點(diǎn)，動(dòng)物飲食量降低，毛發(fā)槁枯，該癥狀與臨床特征相一致。

2.2 各組大鼠在藥物干預(yù)前后血壓水平變化

表1 摘除卵巢前后各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓變化

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與陽(yáng)性組比較，cP<0.05

由表1可以看出：假手術(shù)組與SHR組相比血壓變化不明顯，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組大鼠血壓較SHR組有明顯上升，與假手術(shù)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 各組大鼠在藥物干預(yù)前后血清內(nèi)分泌水平變化

由表2可以看出：與假手術(shù)組和SHR組大鼠相比模型組大鼠內(nèi)分泌激素水平較大，組間差異明顯(P<0.05)，集中體現(xiàn)在E2水平大幅度下降，F(xiàn)SH、LH表達(dá)水平明顯上升，提示模型組大鼠內(nèi)分泌指標(biāo)出現(xiàn)紊亂，符合更年期高血壓臨床特征。給予藥物干預(yù)后，陽(yáng)性組和CDPS高、低劑量組大鼠的內(nèi)分泌水平有不同程度的改善，其中陽(yáng)性組改善作用更為明顯，CDPS高、低劑量組對(duì)E2水平的改善程度稍弱，與模型組相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而對(duì)FSH、LH指標(biāo)改善明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清內(nèi)分泌指標(biāo)水平比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與陽(yáng)性組比較，cP<0.05

2.4 各組大鼠在藥物干預(yù)前后各血清神經(jīng)遞質(zhì)含量變化

由表3可以看出：模型組大鼠與假手術(shù)組相比，各神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)水平有顯著差異(P<0.05)，提示模型組大鼠神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)水平異常，該癥狀符合更年期高血壓燥證臨床特征。經(jīng)藥物干預(yù)治療后，與模型組相比，除CDPS低劑量組對(duì)DA調(diào)節(jié)作用稍弱以外(P>0.05)，陽(yáng)性組和CDPS各劑量組均能不同程度的調(diào)整各神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)水平，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中陽(yáng)性組作用強(qiáng)度較CDPS高劑量組強(qiáng)。

表3 各組大鼠血清神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo)水平變化

注：與模型組比較，aP<0.05；與陽(yáng)性組比較，bP<0.05

3 討論

更年期綜合征(menopausal syndrome,MPS)是指更年期婦女由于卵巢功能衰退，E2分泌減少，機(jī)體對(duì)下丘腦-垂體系統(tǒng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用減弱，誘導(dǎo)下丘腦弓狀核和室旁核脈沖式分泌促性腺激素釋放激素(GnRH)至門脈循環(huán)系統(tǒng)，刺激垂體分泌FSH、LH增加，引起下丘腦-垂體-卵巢軸(hypothalamo-pituitary-ovarian axix,HPOA)功能紊亂[7]，進(jìn)而影響下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的平衡。神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)細(xì)胞間及神經(jīng)細(xì)胞與內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)之間信息傳遞有非常重要的作用，其中神經(jīng)遞質(zhì)中以單胺類神經(jīng)遞質(zhì)為主，包括兒茶酚胺類(如DA)、吲哚類(如5-HT)，而5-HT是控制人類情緒變化的最主要物質(zhì)，直接影響機(jī)體的生理及心理功能，更年期婦女神經(jīng)遞質(zhì)的異常變化會(huì)導(dǎo)致機(jī)體植物神經(jīng)功能的異常，進(jìn)而影響個(gè)人情緒與正常的生理功能，產(chǎn)生諸如失眠多夢(mèng)、煩躁不安等癥狀[8]；有研究證實(shí)[9]血清E2表達(dá)水平的降低與FSH、LH的升高與女性更年期發(fā)病有明顯關(guān)系。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中，對(duì)于更年期并與明確的名稱與之相對(duì)應(yīng)，根據(jù)患者臨床癥狀，可將本病與“臟燥”“盜汗”“眩暈”等疾病相關(guān)聯(lián)。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，女子以肝為先天，以血為用，更年期婦女天癸將絕而未絕，陰血虧虛，肝失所養(yǎng)，疏泄不力而致肝氣郁結(jié)不暢，故“肝郁”為更年期發(fā)生之標(biāo)；肝失條達(dá)，則氣機(jī)不暢，血行不利，可成血瘀之弊，故“血瘀”為其主要病理表現(xiàn)；肝失所養(yǎng)，日久累腎，腎氣日衰，精血不足，陰陽(yáng)失衡，故而“腎虛”為發(fā)生之本；根據(jù)辨證，兼以祛痰、解郁、瀉火之法；“更年期”實(shí)為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證，治則當(dāng)以“滋補(bǔ)肝腎”為主[10]，基于此，實(shí)驗(yàn)復(fù)制動(dòng)物模型時(shí)在更年期高血壓模型的基礎(chǔ)上復(fù)制了燥證模型更符合更年期特征。

肉蓯蓉屬于《神農(nóng)本草經(jīng)》“上品”類中藥，為列當(dāng)科植物肉蓯蓉(CistanchedeserticolaY .C.Ma)的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、添精補(bǔ)髓、養(yǎng)血潤(rùn)燥、悅色延年之功效，由于其資源的匱乏，目前已列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，肉蓯蓉有多種生物學(xué)活性，發(fā)揮該生物學(xué)活性的主要活性成分為多糖類成分，如促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生白介素-2、促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖、促進(jìn)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬、促進(jìn)胸腺成熟細(xì)胞向外周釋放等免疫調(diào)節(jié)作用[11-13]。坤泰膠囊(原名更年寧心膠囊)用于更年期綜合征，尤其是對(duì)絕經(jīng)過(guò)渡期更年期患者更為適合，提示該制劑可直接作用于卵巢組織，促進(jìn)卵巢內(nèi)微循環(huán)，增強(qiáng)卵巢供血功能，有效改善卵巢功能；同時(shí)組方中熟地黃、阿膠等中藥能刺激已經(jīng)閉鎖的卵泡，恢復(fù)卵巢分泌激素的功能，調(diào)節(jié)激素分泌平衡；延長(zhǎng)卵巢生命力，推遲女性絕經(jīng)期[14-15]，因此本文以坤泰膠囊作為陽(yáng)性藥物參與對(duì)照。

從研究結(jié)果來(lái)看：卵巢摘除前后模型組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓無(wú)明顯變化(P>0.05)，提示摘除卵巢對(duì)SHR大鼠的應(yīng)激性刺激尚未影響到血壓的波動(dòng)；摘除后的大鼠內(nèi)分泌指標(biāo)有異常變化，大鼠在被切除卵巢后，血清中雌激素E2表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，提示此時(shí)下丘腦-垂體的負(fù)反饋?zhàn)饔脺p弱，代償性使FSH、LH含量上升(P<0.05)，導(dǎo)致內(nèi)分泌功能出現(xiàn)紊亂，該變化符合更年期特征，而內(nèi)分泌的紊亂會(huì)影響到下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的平衡；研究顯示，CDPS高、低劑量組明顯下調(diào)FSH、LH表達(dá)水平(P<0.05)，但對(duì)E2表達(dá)水平調(diào)整作用不明顯，比模型組稍高，組間比較顯示差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。從神經(jīng)遞質(zhì)的角度來(lái)看：模型組大鼠血清5-HT、5-HIAA含量顯著上升，NPY、NE、DA含量明顯下降，該變化符合更年期婦女神經(jīng)遞質(zhì)的變化情況；其主要原因可能是兒茶酚胺類遞質(zhì)合成代謝受到抑制，而分解代謝有所增強(qiáng)，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致大腦內(nèi)5-HT的代謝及神經(jīng)活性相應(yīng)增強(qiáng)，打破了5-HT/NE的動(dòng)態(tài)平衡，而5-HT在機(jī)體中以抑制興奮為主要效應(yīng)，其指標(biāo)的異常升高，會(huì)引起情緒低沉、抑郁寡歡，這也是5-HT能夠引起神經(jīng)功能低下導(dǎo)致抑郁癥的病理生理基礎(chǔ)之一。

綜上所述，肉蓯蓉多糖能通過(guò)增強(qiáng)HPOA功能實(shí)現(xiàn)腎上腺素與皮質(zhì)激素的調(diào)節(jié)，F(xiàn)SH、LH指標(biāo)的下調(diào)和E2含量的回升提示肉蓯蓉多糖能顯著改善機(jī)體的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制，糾正下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)紊亂狀態(tài)，改善植物神經(jīng)功能，穩(wěn)定機(jī)體內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)內(nèi)分泌功能的改善，并加速新陳代謝，發(fā)揮改善更年期癥狀的作用。

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