萊菔硫烷對酒精誘發(fā)肝臟脂肪代謝異常的 預(yù)防作用及機制研究

李寶龍，趙瑤潔，劉旭，李松濱，劉永武，姜波，單毓娟

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150090)

肝臟作為人體重要的代謝器官，是受酒精毒害的首要器官之一。據(jù)統(tǒng)計，全球3.8%的死因是由于攝入酒精所致[1]。酒精性肝損傷或酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是由于長期大量飲酒所致，酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver，AFL)為其初期表現(xiàn)，后期可進展成酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化。由于酒精攝入的特殊性，從藥食資源中尋找拮抗或者減弱酒精毒害的活性成分是防控酒精危害的重要策略。萊菔子在中國有著悠久的食用、藥用歷史，其活性成分萊菔硫烷(Sulforaphane，SFN)富含于十字花科植物中，具有代謝解毒、抗氧化、抑制炎癥、免疫調(diào)節(jié)等活性[2-4]，被認為是一種極具開發(fā)價值的食源性活性成分。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SFN可通過抗氧化和降低炎癥反應(yīng)來保護同型半胱氨酸引起的肝細胞損傷[5]，并對酒精導(dǎo)致肝損傷相關(guān)代謝酶的損傷具有效保護[6]；由于脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)也是酒精性肝損傷發(fā)生發(fā)展的病理學(xué)基礎(chǔ)，因此推測SFN可能通過脂代謝調(diào)控對酒精性肝損傷有保護作用。為驗證該假設(shè)，本研究對SFN是否在急性酒精性肝損傷中發(fā)揮保護作用進行了探討，并從脂肪代謝和抗氧化角度，對其可能的作用機制進行初步研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

萊菔硫烷購自LKT laboratories公司(英國);GSH和GST檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司(南京);Bradford 蛋白檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所(上海)；TG和CHOL檢測試劑盒購自中生北控生物科技公司(北京)；免疫組化一抗anti-Nrf2，anti-β-actin，anti-SREBP-1c購自Santa Cruz生物科技公司(美國)。

1.2 實驗動物及飼養(yǎng)

5周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK(京)2016-0011，在屏障環(huán)境內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)兩天之后進行正式分組及實驗。在實驗期間實驗動物自由飲水、攝食。SPF級小鼠維持飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，經(jīng)60Co輻照滅菌，合格證號SCXK(京)2014-0010。動物實驗在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心進行，許可證號SYXK(黑)2013-004，動物實驗室溫度22～24℃,相對濕度40%～60%、照明12 h/12 h晝夜交替進行。

1.3 實驗動物分組及處理

60只雄性C57BL/6小鼠，按體質(zhì)量隨機分為5組,每組12只,陰性對照組、酒精模型組、SFN處理組(低劑量組10 mg/kg、中劑量組20 mg/kg、高劑量組40 mg/kg)。實驗開始時，給處理組動物經(jīng)口灌胃不同劑量的SFN 10d(1次/d)。參照Carson和Pruett的方法構(gòu)建急性酒精性肝損傷模型，在末次灌胃SFN后，立即給予酒精模型組和SFN處理組動物酒精(5 g/kg)，每12 h 1次，共給予3次，末次給予酒精4 h后，眼球取血制備血清，頸椎脫臼處死動物。陰性對照組給予等熱量的葡萄糖。

1.4 肝勻漿制備及氧化還原指標(biāo)的測定

每只小鼠取肝左葉0.5 g于預(yù)冷生理鹽水(NS)中漂洗數(shù)次后濾紙吸干，加入4.5 mL預(yù)冷NS勻漿。用眼科剪盡快剪碎組織塊，并于玻璃器中制成10%肝組織混懸液，然后在4℃條件下以10 000 r/min離心20 min，取上清(肝勻漿)分裝于EP管中，置于-80℃冰箱中冷凍保存。用酶標(biāo)儀按照試劑盒說明測定谷胱甘肽(GSH)含量和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)的活性。

1.5 血清脂肪代謝指標(biāo)測定

血清中TG、CHOL和HDL水平的測定采用中生北控生物科技公司的試劑盒，用半自動生化分析儀進行測定。

1.6 免疫組化法檢測Nrf2蛋白的表達

用二甲苯對肝臟組織切片進行脫蠟，乙醇濃度遞減梯度進行復(fù)水并滅活內(nèi)源性過氧化物酶，然后用10%羊血清封閉非特異性信號。隨后在4℃下與anti-Nrf2特異性抗體雜交過夜，隨后與二抗孵育30 min。用DAB顯色2 min，蘇木精復(fù)染和封片。高倍鏡(1 000倍)下觀察五個視野共約2 000個細胞中的陽性細胞數(shù)，并進行拍照。

1.7 組織蛋白的提取及SREBP蛋白表達的測定

取-80℃保存的肝組織，放入研缽中，加入適量液氮研磨，按1%比例加0.1 mol/L PMSF和磷酸酶抑制劑，使均勻覆蓋細胞，4℃放置1 h(期間搖勻3～5次)，4℃ 13 000 r/min 離心20 min，上清即為組織總蛋白?？偟鞍缀繙y定采用Bradford方法，蛋白分離采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行，半干法轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)，后用特異性一抗和堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗進行雜交，室溫下顯色。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 萊菔硫烷對酒精引起的高血脂的改善作用

小鼠給予急性酒精刺激后，血清TG、CHOL水平明顯升高，相比于陰性對照組，TG升高了82%，CHOL升高了49%,而HDL未有明顯變化,見表1,與模型組相比，低、中、高劑量SFN預(yù)保護能使TG水平下降45%～56%，(表1，P<0.01)；中、高劑量的SFN使CHOL得水平下降28%～30%，并接近了陰性對照組的水平；SFN對HDL的影響不大。

表1 SFN對小鼠血清中TG、CHOL和HDL水平的影響

注：與陰性對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2 萊菔硫烷對GSH水平和GST活性的影響

由表2可知，急性酒精刺激能使肝組織中抗氧化物GSH含量下降約34%(P<0.05)，表明肝臟的抗氧化能力下降；GST活性降低34%，表明肝臟的解毒功能下降，提示急性酒精刺激損害了肝臟的正常功能。而在SFN預(yù)保護各組中，GSH的含量均明顯增加，約提高57%～79%，SFN各劑量組之間GSH水平無顯著性差異；SFN各作用組可使GST活性提高43%～80%(P<0.01)；SFN對GST能完全逆轉(zhuǎn)急性酒精對GST活性的抑制作用，SFN預(yù)保護各組GST的活性仍保持在陰性對照組水平。

表2 SFN對小鼠肝組織中GSH和GST的影響

注：與陰性對照組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 SFN對小鼠肝組織Nrf2蛋白表達的影響

圖1 SFN對肝組織中Nrf2表達的影響(×1 000) 注：A：陰性對照組;B：模型組;C：低劑量組;D：中劑量組;E：高劑量組

由圖1可見Nrf2被染成棕色顆粒，陰性對照組小鼠僅在肝細胞胞漿有Nrf2的弱陽性表達，呈淺棕色，此時細胞核藍染，無可見的棕色顆粒，提示細胞核中午Nrf2表達。急性酒精刺激后，肝細胞漿中可見少量Nrf2的表達，細胞核中亦有少量表達。SFN預(yù)保護后，可見相應(yīng)組織中Nrf2表達明顯增強，特別是核內(nèi)Nrf2的表達明顯增強，細胞漿和細胞核內(nèi)均可見大量、深染的棕色顆粒。

2.4 小鼠肝組織中轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)因子合成蛋白的表達

如圖2所示，急性酒精刺激后，肝組織中的固醇調(diào)節(jié)元件合成蛋白(SREBP-1c)表達增加；SFN預(yù)保護各組，SREBP-1c的表達與酒精模型組相比，有明顯降低，特別是中、高劑量的SFN的抑制作用較明顯。

圖2 SFN對小鼠肝組織中SREBP-1c蛋白的表達

3 討論

萊菔硫烷是十字花科植物蘿卜成熟的種子中的一種有效成分?！侗静菥V目》記載萊菔子可 “消食，除脹，利大小便，止氣痛”；著名醫(yī)家張錫純認為，萊菔子具有“順氣開郁，消脹除滿”的功效?？捎糜陔涓姑洕M，氣滯腹痛的治療。酒精性肝損傷患者可出現(xiàn)上腹部脹痛、惡心、嘔吐、納差等癥狀，可歸屬為中醫(yī)疾病之腹痛。萊菔子的提取物萊菔硫烷消食除脹痛的作用機制可能與抑制膽固醇及甘油三酯合成有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，SFN能夠保護酒精對肝臟脂肪代謝的損傷作用，其作用機制與激活Nrf2的表達以及其下游GSH和GST升高有關(guān)；此外SFN可通過抑制膽固醇合成的轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c表達，而抑制膽固醇和甘油三酯的合成。

SFN主要是以Nrf2依賴方式誘導(dǎo)抗氧化酶和II相解毒酶的表達。通常情況下Nrf2位于胞漿中，與其抑制劑Keap1相結(jié)合而鉚釘在胞漿骨架蛋白上。當(dāng)酒精攝入后，肝臟代謝產(chǎn)生的氧自由基會促使Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，隨后Nrf2通過核穿梭機制在胞核中聚集，并與Maf蛋白等形成異二聚體后，與ARE結(jié)合介導(dǎo)Ⅱ相代謝解毒酶/抗氧化物酶的轉(zhuǎn)錄表達[7]。作者認為，酒精模型組動物在攝入酒精后，由于機體代謝產(chǎn)生的活性氧自由基，會促發(fā)Nrf2在小范圍內(nèi)表達增加和核轉(zhuǎn)移，這是機體的一種保護性應(yīng)激反應(yīng)，而當(dāng)大量的活性氧自由基生成后，如果沒有其他清除機制激活，將導(dǎo)致肝臟的損傷[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，SFN預(yù)保護后，由于激活了Nrf2的表達和核轉(zhuǎn)位，使其調(diào)控的Ⅱ相解毒酶GST活性增加，同時SFN還通過直接增加GSH的含量[9]，達到更強的抗氧化能力。

SREBP-1是一種核轉(zhuǎn)錄因子，直接參與脂肪酸、甘油三酯合成和葡萄糖代謝相關(guān)基因的表達，屬于固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)中的一種[10-11]。本研究中，急性酒精刺激引起了SREBP-1c的表達，后者將激活其下游的相關(guān)靶基因如乙酰CoA羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、甘油-3磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶(GPAT)等的表達和激活，從而導(dǎo)致脂肪酸合成增多[12]，肝臟脂質(zhì)代謝障礙甚至酒精性脂肪肝的發(fā)生，這是肝臟病理學(xué)表現(xiàn)以及血清中TG和CHOL升高的內(nèi)在原因。SFN通過抑制SREBP-1c的表達，阻止了上述病理過程的激活，因而達到了保護肝臟損傷的效果。

綜上，SFN通過激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2增強了抗氧化作用，同時通過抑制轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c，改善了酒精所致的肝臟脂肪代謝的異常，二者綜合作用最終對急性酒精性肝損傷發(fā)揮了保護作用。

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