雙黃連口服液與顆粒劑微生物限度檢查方法的研究

張喬，張琦，李靜，姜德友，孟云閣

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150076)

微生物限度檢查是藥品安全性研究的重要組成部分[1-3]，由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，其中任何藥材成分的抑菌作用都可能影響到微生物限度檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證來(lái)確定所采用的微生物限度檢查方法的可行性和有效性是十分有必要的[4-6]。本課題研究雙黃連口服液與顆粒劑的微生物限度檢查方法，以雙黃連口服液和顆粒劑為研究對(duì)象分別進(jìn)行常規(guī)傾注平皿法、培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過(guò)濾法三種微生物限度檢查方法的比較，以期探究符合《中國(guó)藥典》頒布的微生物限度檢查的方法學(xué)驗(yàn)證來(lái)確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[7-9]。此外，進(jìn)行雙黃連口服液與顆粒劑的微生物限度檢查方法學(xué)適用性的研究，有助于對(duì)藥品工業(yè)生產(chǎn)和微生物限度檢查方法的檢驗(yàn)檢測(cè)以進(jìn)一步的驗(yàn)證和補(bǔ)充。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 供試品

雙黃連口服液(哈藥集團(tuán)三精制藥有限公司，批號(hào)16120913、16121113、17012513；黑龍江省珍寶島藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)B13170309217，黑龍江林寶藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)201704080；南陽(yáng)市新生制藥有限公司，批號(hào)20170562)。

雙黃連顆粒劑(哈藥集團(tuán)中藥二廠，批號(hào)160511、160171、160662；哈爾濱兒童制藥廠有限公司，批號(hào)150703)。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.3 培養(yǎng)基與試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限公司，批號(hào)20170102)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限公司，批號(hào)20170102)。pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液(磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、氯化鈉、蛋白胨等)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.4 儀器

FB522型高壓蒸汽滅菌器(連云港萬(wàn)云醫(yī)療器械股份有限公司)；BC102型臺(tái)式封閉電爐(天津市泰斯特儀器有限公司)；AC323型生物安全柜(山東新華器械醫(yī)療股份有限公司)；FC502型恒溫培養(yǎng)箱(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司)；FA102型一次性薄膜過(guò)濾器(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液的制備

將上述6個(gè)批次的黃連口服液分別抽取1 mL供試藥液放入無(wú)菌試管中，量取9 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液分別加入上述試管中，振蕩器震蕩，混勻，將試管依次編號(hào)，制成雙黃連口服液供試液，待用。

將上述4個(gè)批次的黃連顆粒劑分別稱取1.0 g供試品放入無(wú)菌試管中，量取9 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液分別加入上述試管中，振蕩器震蕩至完全溶解，制成1∶10的黃連顆粒劑供試液，將試管依次編號(hào)，待用。

2.2 菌液的制備

抽取10 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液加入到無(wú)菌試管中，制成多個(gè)平行試管緩沖液，依次排列并編號(hào)，斜面勾取第三代金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物于第一個(gè)試管中，在試管內(nèi)側(cè)壁碾碎溶解，振蕩器振蕩混勻制成最初的菌懸液，從第一個(gè)試管中吸取1 mL菌懸液加入第二個(gè)試管中，用移液管抽吸，混勻后，制成10-1稀釋級(jí)的菌懸液，以此方法稀釋，制成10-7稀釋級(jí)的菌懸液，使每l mL溶液中含菌數(shù)約為50～100 cfu的菌液備用。

按上述菌液制備的方法同法制備枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的菌懸液。

2.3 回收率的測(cè)定

2.3.1 培養(yǎng)基平皿傾注常規(guī)法

用無(wú)菌移液管移取1 mL供試液和1 mL金黃色葡萄球菌的菌懸液注入無(wú)菌培養(yǎng)皿后，傾注15 mL胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基于平皿中，分別做成10個(gè)平行樣本的平皿；同法吸取1 mL枯草芽孢桿菌菌懸液和1 mL供試液加入無(wú)菌培養(yǎng)皿后，注入同一胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基于平皿中，緩慢混勻培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基和溶液，待培養(yǎng)液凝固后，倒置放入以上兩組平皿，放入培養(yǎng)箱中，35℃ 48 h培養(yǎng)，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù),取平均值。上述同法制備白色念珠菌菌液與供試液，混合，注入后，并傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基于平皿中，在25℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)72 h，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù),取平均值。

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法

用無(wú)菌移液管吸取1 mL供試液，分別置于5個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿當(dāng)中，每一個(gè)培養(yǎng)皿0.2 mL，然后在每一個(gè)平皿中注入金黃色葡萄球菌的菌懸液1 mL，而后傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基于平皿中；同法操作枯草芽孢桿菌，用無(wú)菌移液管吸取供試液1 mL平均置于5個(gè)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)皿中，做法同上述培養(yǎng)液，每個(gè)平皿中注入移液管吸取的枯草芽孢菌懸液1 mL，混勻凝固后倒置放入35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，取平均值。移液管吸取1 mL供試液平均分至于5個(gè)沙式葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的平皿中，每個(gè)平皿中注入白色念珠菌菌懸液1 mL，做法同上述供試液，在25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，逐日點(diǎn)計(jì)菌數(shù)，取平均值。

2.3.3 薄膜過(guò)濾法

首先將濾膜進(jìn)行沖洗潤(rùn)濕，抽取50 mL左右pH 7.0的無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，通過(guò)一次性薄膜過(guò)濾器。用無(wú)菌注射器抽取1 mL供試液和1 mL枯草芽孢桿菌菌懸液，注入到一次性薄膜過(guò)濾器當(dāng)中，加入100 mL pH 7.0的無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液邊進(jìn)行抽濾，待薄膜過(guò)濾器中無(wú)液體后，取出薄膜，將薄膜菌面向上放置于事先制備好的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿中央，置于35℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；同法做法操作薄膜放置于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿中，置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，取平均值。

對(duì)照組：按試驗(yàn)組的方法，不加菌懸液，只測(cè)定供試液的菌落總數(shù)。

菌液組：按上述方法測(cè)定加入的試驗(yàn)菌的菌落總數(shù)，不加入供試液。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)分別計(jì)算平均值和回收率，見表1～3。

回收率(%)=(試驗(yàn)組菌數(shù)-對(duì)照組菌數(shù))/菌液組菌數(shù)×100%

表1 雙黃連口服液與顆粒劑常規(guī)法檢測(cè)結(jié)果

表1中雙黃連口服液常規(guī)法金黃色葡萄球菌回收率為22.95%，枯草芽孢桿菌回收率為10.35%，白色念珠菌回收率為28.96%；雙黃連顆粒劑金黃色葡萄球菌回收率為22.63%，枯草芽孢桿菌為28.22%，白色念珠菌為33.86%。由常規(guī)法實(shí)驗(yàn)可知，雙黃連口服液和雙黃連顆粒劑均對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及白色念珠菌具有較強(qiáng)的抑制作用，由此可見，具有抑菌作用的中藥復(fù)方的微生物限度檢查，其抑菌作用將干擾到微生物限度檢查的結(jié)果，常規(guī)法檢查不能反映出藥品被微生物污染的真實(shí)情況，須先去除樣品中的抑菌活性，所以須進(jìn)行培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定各菌群的驗(yàn)證試驗(yàn)[10-11]。

表2 雙黃連口服液與顆粒劑培養(yǎng)基稀釋法檢測(cè)結(jié)果

表2中雙黃連口服液培養(yǎng)基稀釋法金黃色葡萄球菌回收率為83.91%，枯草芽孢桿菌回收率為73.37%，白色念珠菌回收率為57.50%；雙黃連顆粒劑金黃色葡萄球菌回收率為78.57%，枯草芽孢桿菌回收率為57.21%，白色念珠菌回收率為68.55%。由培養(yǎng)基稀釋法實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，雙黃連口服液的供試液通過(guò)培養(yǎng)基稀釋后，對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用可基本消除，使其回收率達(dá)到70%以上；但是不能消除對(duì)白色念珠菌的抑制性，回收率仍低于70%；雙黃連顆粒劑除對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用被消除外白色念珠菌和枯草芽孢桿菌的回收率都低于70%，不符合微生物限度檢查的方法學(xué)驗(yàn)證要求。

表3 雙黃連口服液與顆粒劑薄膜過(guò)濾法檢測(cè)結(jié)果

表3中雙黃連口服液薄膜過(guò)濾法金黃色葡萄球菌回收率為87.09%，枯草芽孢桿菌回收率為81.73%，白色念珠菌回收率為85.86%；雙黃連顆粒劑金黃色葡萄球菌回收率為88.71%，枯草芽孢桿菌回收率為84.03%，白色念珠菌回收率為92.19%。由薄膜過(guò)濾法實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，使用薄膜過(guò)濾法時(shí)，上述回收率均符合微生物限度檢查的方法學(xué)驗(yàn)證，雙黃連口服液和雙黃連顆粒劑的抑菌活性均可被有效消除，各個(gè)試驗(yàn)菌株的回收率均達(dá)到70%以上，并且高于培養(yǎng)基稀釋法的試驗(yàn)菌株回收率。

3 討論

由表1～3可知,雙黃連口服液符合2015年版《中國(guó)藥典》中口服液體制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，需氧菌總數(shù)不大于100 cfu/mL、霉菌總數(shù)不大于10 cfu/mL的要求，雙黃連顆粒劑符合口服固體制劑、不含藥材原粉的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，需氧菌總數(shù)不大于1 000 cfu/mL、霉菌總數(shù)不大于100 cfu/mL的要求[12]。

2015年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定，中成藥制劑的微生物限度檢查時(shí)，對(duì)于可能含有抑菌成分的供試品，必須采用相應(yīng)檢測(cè)方法消除其抑菌活性后，再進(jìn)行相關(guān)的微生物限度檢查。雙黃連口服液和雙黃連顆粒劑中含有黃芩、連翹、金銀花等中藥材，均具有較強(qiáng)的抑菌活性[13-14]。本次實(shí)驗(yàn)中平皿傾注常規(guī)法驗(yàn)證結(jié)果顯示，其回收率均低于70%，表明本品使用常規(guī)法進(jìn)行細(xì)菌和霉菌的微生物限度檢查，受到供試品本身抑菌性的影響不能準(zhǔn)確檢測(cè)出供試品中所含的細(xì)菌數(shù)，影響到其檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確，需先去除該藥品供試液的抑菌活性。運(yùn)用培養(yǎng)基稀釋法的回收率實(shí)驗(yàn)中，雖回收率有所升高但卻不能完全達(dá)到方法學(xué)驗(yàn)證回收率為70%的要求，說(shuō)明培養(yǎng)基稀釋法仍不能完全消除供試液本身抑菌活性。

3種方法中只有采用薄膜過(guò)濾法處理后的供試液，其抑菌活性顯示可能已被消除，CMCC系列菌株正常生長(zhǎng)，菌株的回收率均超過(guò)70%，并且高于培養(yǎng)基稀釋法和常規(guī)平皿傾注法。試驗(yàn)結(jié)果表明，薄膜過(guò)濾法消除供試品的抑菌活性效果最好，不影響實(shí)驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)，消除了供試品自身的抑菌活性，適合本藥品微生物限度檢查的檢測(cè)要求，符合2015年版《中國(guó)藥典》中的微生物限度檢查方法學(xué)適用性實(shí)驗(yàn)的相關(guān)規(guī)定。

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