長鏈非編碼RNA Linc00152在泛癌中表達(dá)、預(yù)后及功能研究

鄭 偉 許守平 龐 達(dá)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率為22.9%，死亡率達(dá)13.7%[1]，乳腺癌嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和心理健康。因此，尋找與乳腺癌致病相關(guān)的基因十分迫切。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種轉(zhuǎn)錄本長度>200 nt，缺少開放性閱讀框，不能編碼蛋白質(zhì)的RNA[2]。Linc00152位于染色體2p11.2，長約828 bp。研究表明，高表達(dá)Linc00152的結(jié)直腸癌患者預(yù)后往往比較差，Linc00152在胃癌中高表達(dá)且與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期呈正相關(guān)[3]，舌鱗狀細(xì)胞癌和肺癌中Linc00152高表達(dá)提示患者預(yù)后較差[4-5]，然而，Linc00152在乳腺癌中的研究報(bào)道較少。本文主要研究Linc00152在乳腺癌中的表達(dá)及預(yù)后關(guān)系，并探討Linc00152對(duì)乳腺癌生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、胃癌細(xì)胞系SGC-7901、腎癌細(xì)胞系786-O(中科院上海細(xì)胞庫)；DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)；Ribo-Zero TM Gold試劑盒(Epicentre，Wisconsin，USA)；敲降Linc00152的慢病毒載體(上海吉?jiǎng)P基因公司)；Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室(上海Corning公司)；CCK-8試劑(上海碧云天公司)；Annexin-PE試劑盒(BD Biosciences，San Jose，CA)。

1.2 臨床樣本、RNA-seq和預(yù)后指標(biāo)

選取哈醫(yī)大附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科未治療患者組織樣本33例，進(jìn)行RNA測(cè)序(15例癌組織、18例正常乳腺組織)，后續(xù)采用50對(duì)癌組織和配對(duì)正常組織行qPCR驗(yàn)證。使用Ribo-Zero TM Gold試劑盒除去核糖體RNA，Illumina的NEBNext?UltraTM定向構(gòu)建RNA文庫，Illumina HiSeq 2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序原始結(jié)果已經(jīng)上傳至GEO(GSE71651)?？偵嫫?OS)為從手術(shù)后算起一直到死亡的時(shí)間。無事件生存期(EFS)是從手術(shù)到發(fā)生任何復(fù)發(fā)或死亡的時(shí)間。無轉(zhuǎn)移生存期(MFS)為從手術(shù)時(shí)間開始，直到發(fā)生遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的時(shí)間。

1.3 GEO和TCGA數(shù)據(jù)分析

從NCBI網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載GEO數(shù)據(jù)集。TCGA下載Linc00152表達(dá)譜數(shù)據(jù)(https：//tcga-data.nci.nih.gov/)。計(jì)算Linc00152的表達(dá)與所有基因間的Pearson相關(guān)性，僅保留r≥0.6顯著相關(guān)的基因(P<0.05)進(jìn)行分析。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231用含有10%胎牛血清和100單位/mL青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。胃癌細(xì)胞系SGC-7901和腎癌細(xì)胞系786-O在含有10%胎牛血清和100單位/mL青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，37℃、含有5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.5 Linc00152敲降和qRT-PCR

構(gòu)建Linc00152的shRNA序列，導(dǎo)入慢病毒載體沉默Linc00152。shRNA序列分別為shR_1：5′-TGTGGACTCTGAGGCCTCTGCATTT-3′和shR_2：5′-TCTATGTGTCTTAATCCCTTGTCC T-3′。嘌呤霉素篩選Linc00152 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，進(jìn)行qRT-PCR(用于檢測(cè)Linc00152的敲降效率)，Linc00152 PCR引物特異性序列為5′-CTGGATGGTCGCTGCTTTTT-3′(正向)和5′-GATCTGAAGACAGGCACGGG-3′(反向)；GAPDH為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′(正向)和5′-GGATCTCGCTCCTGGAAGATG-3′(反向)。GAPDH作為內(nèi)參，通過CT(2-ΔΔCT)方法分析Linc00152相對(duì)水平。

1.6 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：將2×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，于24 h、48 h和72 h評(píng)估細(xì)胞增殖情況。每孔加入20 μL WST-8試劑，孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處吸光度。細(xì)胞遷移能力測(cè)定：MDA-MB-231細(xì)胞接種到Transwell培養(yǎng)板的上室，含有20%FBS的L-15培養(yǎng)基置于下室。細(xì)胞侵襲能力測(cè)定：用基質(zhì)膠溶液涂布Transwell腔室，MDA-MB-231細(xì)胞接種到通孔上腔室，含有20%FBS(600 μL)的L-15培養(yǎng)基加入下腔室。孵育48 h，滲透至膜下表面的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，隨機(jī)選擇6個(gè)區(qū)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)以測(cè)定細(xì)胞遷移和侵襲性。以上所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)

采用Annexin-PE試劑盒進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。常規(guī)消化細(xì)胞，冷PBS洗兩次，緩沖液吹勻。將100 μL細(xì)胞溶液(1×105個(gè)細(xì)胞)轉(zhuǎn)移到5 mL的培養(yǎng)管中，加入5 μL的V-PE和5 μL的7-AAD。充分混勻，25℃恒溫箱中孵育15 min。每管加入400 μL的緩沖液，F(xiàn)ACScan儀器行細(xì)胞凋亡分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)分析和方差分析，多重比較使用LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析使用Pearson相關(guān)性分析，生存資料利用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Linc00152在乳腺癌組織中表達(dá)情況

通過對(duì)33例乳腺樣本(癌組織15例、正常乳腺組織18例)進(jìn)行RNA-Seq分析，結(jié)果表明Linc00152在癌組織中表達(dá)高于正常組織(圖1A)。為證實(shí)本研究結(jié)果，對(duì)TCGA(n=837)和GEO(n=1215)(GSE20685，GSE12763，GSE21422，GSE10810，GSE7904，GSE29431，GSE42568，GSE10780，GSE48390和GSE21653)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在乳腺癌組織中Linc00152的表達(dá)較正常乳腺要高(圖1B)。后續(xù)通過對(duì)50例配對(duì)乳腺癌組織和正常組織進(jìn)行qPCR再次驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Linc00152在癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織(P<0.001)(圖1C)。

圖1 Linc00152在乳腺癌中表達(dá)情況Figure 1 Expression of Linc00152 in breast cancer tissues and adjacent tissuesNote：(A)Hierarchical clustering of differentially expressed genes in breast cancer relative to normal tissues(N=33)；(B)Hierarchical clustering of differentially expressed genes in breast cancer relative to normal tissue in the TCGA cohort；(C)The expression of Linc00152 in 50 paired breast cancer and non-cancer tissues.The red columns indicate the high level of linc00152 expression in cancer tissues.*** P<0.001，when compared to the normal tissues.

2.2 Linc00152與腫瘤惡性程度的相關(guān)性

分析TCGA數(shù)據(jù)，Linc00152在HER2型患者中表達(dá)顯著高于其他類型乳腺癌(P<0.0001)(圖2A)。通過亞層分析，Linc00152高表達(dá)于ER陰性患者、PR陰性患者和HER2陽性患者(圖2B，2C和2D)。通過可視化分析，Linc00152在Luminal A型表達(dá)較低，而在其他亞型中表達(dá)較高(圖2E)。分析CCLE乳腺癌細(xì)胞系數(shù)據(jù)，三陰性和HER2型細(xì)胞系Linc00152的表達(dá)高于Luminal型細(xì)胞系(圖2F)。分析TCGA泛癌數(shù)據(jù)顯示，膀胱癌、宮頸鱗狀細(xì)胞癌、子宮頸腺癌、結(jié)腸腺癌、腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、胃腺癌、甲狀腺癌和子宮內(nèi)膜癌中Linc00152的表達(dá)水平均高于癌旁組織(圖2G)。膀胱癌和腎透明細(xì)胞癌患者中，組織分級(jí)和TNM分期越高，Linc00152表達(dá)也越高(圖2H和2I)。

2.3 Linc00152對(duì)患者的OS、EFS、MFS的影響

分析TCGA和GEO數(shù)據(jù)，右腎透明細(xì)胞癌、肺腺癌和低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者中，Linc00152高表達(dá)者的OS差(P<0.001；P=0.033；P<0.001)(圖3A，3B和3C)。通過GEO數(shù)據(jù)分析，乳腺癌患者中Linc00152表達(dá)越高，EFS和MFS越差(P<0.001；P<0.01)(圖3D，3E)。對(duì)19個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行Meta分析，Linc00152高表達(dá)患者EFS和MFS也越差(P<0.001，HR=1.28；P<0.001，HR=1.35)(圖3F和3G)。

2.4 不同腫瘤細(xì)胞系中Linc00152的敲降效率

對(duì)慢病毒載體穩(wěn)轉(zhuǎn)后的乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231)、胃癌細(xì)胞系(SGC-7901)和腎癌細(xì)胞系(786-O)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，與親本細(xì)胞相比，Linc00152的表達(dá)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中明顯降低(P<0.05)。

2.5 Linc00152能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及能抑制細(xì)胞凋亡

用敲降后的乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231)、胃癌細(xì)胞系(SGC-7901)和腎癌細(xì)胞系(786-O)進(jìn)行相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)研究。CCK-8測(cè)定和克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，敲降Linc00152后，三種癌細(xì)胞的增殖和克隆形成降低(P<0.05)(圖5A和5B)。通過流式細(xì)胞技術(shù)分析，敲降Linc00152后，三種癌細(xì)胞凋亡增加(P<0.05)(圖5C)。在MDA-MB-231細(xì)胞系中敲低Linc00152，遷移和侵襲都降低(P<0.05)(圖5D)。

圖2 Linc00152與腫瘤惡性程度密切相關(guān)Figure 2 The correlation of linc00152 with progressive characteristics of breast cancerNote：(A)The expression of linc00152 in different molecular subtypes of breast cancer in TCGA；(B)The expression of linc00152 in ER-positive and -negative breast cancer in TCGA；(C)The expression of linc00152 in PR-positive and-negative breast cancer in TCGA；(D)The expression of linc00152 in HER2-positive and -negative breast cancer in TCGA；(E)The visualization of linc00152 in 33 samples with different subtypes by RNA-Seq data；(F)The expression of linc00152 in different breast cancer cell lines in CCLE；(G)The expression of linc00152 in different types of cancer in TCGA；(H)The expression of linc00152 in different grades of cancer in TCGA；(I)The expression of linc00152 in different TNM stages of cancer in TCGA.The level of linc00152 expression was measured by log2 FPKM.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，when compared to the corresponding group.

圖3 Linc00152影響腫瘤患者預(yù)后Figure 3 High expression of linc00152 leads to a worse prognosis in pan-cancer patientsNote：(A-C)The high expression of linc00152 was correlated with a worse overall prognosis in patients with renal clear cell carcinoma(A)or lung adenocarcinoma(B)or lower grade glioma(C)in TCGA；D-E，The high expression of linc00152 was correlated with a worse any event-free survival(D)and metastasis-free survival(E)in 12 datasets with 5802 breast patients in GEO；G-H，Meta-analyses for the relationship between the expression of linc00152 in breast cancer patients and any event-free survival(F，N=1830)or metastasis-free survival(G，N=1130)in GEO.

圖4 不同惡性腫瘤細(xì)胞中Linc00152的敲降效率Figure 4 Linc00152 shRNA significantly decreased the expression of linc00152 in MDA-MB-231，SGC-7901 and 786-O cellsNote：**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，when compared to the parent group.

3 討論

本研究通過檢測(cè)乳腺癌組織、癌旁組織、正常組織樣本中Linc00152的表達(dá)，首次證明Linc00152在癌組織和預(yù)后較差的亞型中高表達(dá)。通過TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫分析，同樣證實(shí)乳腺癌組織中Linc00152表達(dá)較高，通過亞層分析，發(fā)現(xiàn)在ER陰性、PR陰性、HER2陽性及三陰性患者中其表達(dá)高，且與不良預(yù)后相關(guān)。除此之外，本研究進(jìn)一步分析其它惡性腫瘤(胃癌、腎透明細(xì)胞癌、肺癌等)中Linc00152的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，同樣證實(shí)在癌組織中Linc00152表達(dá)較正常組織高，與不良預(yù)后相關(guān)。所有結(jié)果均表明癌組織中高表達(dá)Linc00152，提示它可能是一個(gè)促癌基因。后續(xù)進(jìn)行CCK-8增殖、Transwell遷移侵襲及流式凋亡實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲降Linc00152后，腫瘤細(xì)胞的增殖減少、凋亡增加，遷移和侵襲能力也降低。因此，Linc00152可能具有致癌作用。

相關(guān)研究表明，Linc00152可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，影響細(xì)胞有絲分裂[6-7]，與本研究結(jié)果一致。Linc00152在不同惡性腫瘤中可能以不同分子機(jī)制發(fā)揮作用，通過原位雜交實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Linc00152在結(jié)直腸癌中定位于細(xì)胞質(zhì)。因此，它可能通過與蛋白質(zhì)編碼基因mRNA結(jié)合從而干擾蛋白質(zhì)的合成，引發(fā)細(xì)胞生物學(xué)功能改變，導(dǎo)致細(xì)胞癌變[8]；在腎癌中，Linc00152通過干擾miR-205來發(fā)揮作用[9]；在膽囊癌中，它通過Linc00152/miR-138/HIF-1α信號(hào)通路軸促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和EMT[10]；在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，Linc00152/miR-103a-3p/FEZF1/CDC25A軸影響癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[6]；同樣，其他研究表明，Linc00152可能通過沉默p15和p21的基因表達(dá)或激活PI3K途徑來促進(jìn)胃癌進(jìn)展[11]；在結(jié)直腸癌中，低氧/miR-367c-3p/Linc00152軸調(diào)控Bcl-2、bax分子的表達(dá)，進(jìn)而影響癌細(xì)胞增殖和凋亡[12]。

圖5 Linc00152促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡Figure 5 Linc00152 promoted cell proliferation，migration and invasion，and increased cell apoptosis in cancer cellsNote：(A)The CCK-8 assay showed that the knockdown Linc00152 could inhibit the proliferation of MDA-MB-231，SGC7901 and 786-O cells；(B)The clonogenic assay showed that the knockdown Linc00152 inhibited the clone formation of MDA-MB-231，SGC7901，and 786-O cancer cells；(C)Knockdown Linc00152 increased the apoptosis of MDA-MB-231，SGC7901，and 786-O cells by flow cytometry；(D)Knockdown Linc00152 decreased migration and invasion in MDA-MB-231 cells.Each assay was performed in triplicate.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，when compared to the Scr group.

綜上所述，本研究證實(shí)Linc00152在惡性腫瘤中具有致癌作用，且與患者不良預(yù)后有關(guān)。Linc00152在不同的腫瘤中借助不同的通路來發(fā)揮作用，然而，在乳腺癌中的具體作用機(jī)制仍然不清楚。那么，它是否也通過相關(guān)的microRNA發(fā)揮作用，這一科學(xué)問題尚需更進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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