拉曼光譜在癌癥組織學(xué)診斷中的研究進(jìn)展

趙倩妤 綜述 孫軼華 審校

癌癥是人類(lèi)健康的殺手，其早期臨床表現(xiàn)并不是十分特異，因此患者就診時(shí)往往已處于中晚期，而早期診斷和及時(shí)有效的治療又與患者的生存率和生存質(zhì)量密切相關(guān)。為了尋求一種敏感、準(zhǔn)確且無(wú)損的癌癥早期檢測(cè)工具，近年來(lái)，拉曼光譜已經(jīng)成為生物化學(xué)、藥學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文基于拉曼光譜在癌癥組織學(xué)方面的研究做一綜述。

1 拉曼光譜的原理及特點(diǎn)

拉曼光譜是一種強(qiáng)大的分析技術(shù)，既可以測(cè)量復(fù)雜生物樣品的化學(xué)成分，又能夠提供有關(guān)化學(xué)成分的定量信息，具有在分子水平上檢測(cè)生物化學(xué)變化的潛在能力。拉曼光譜利用光的非彈性散射，能夠提供細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的光譜特征，例如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)，從而反應(yīng)癌癥早期所引起體內(nèi)的物質(zhì)變化[1]。因此，拉曼光譜可用于癌癥的診斷，預(yù)后的判斷或作為評(píng)估療效的新型工具。

拉曼光譜具有高度的化學(xué)特異性，不需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染色或標(biāo)記即可獲得豐富的分子信息。目前，癌癥的診斷主要依賴(lài)于X射線(xiàn)、CT檢查、B超、MRI檢查以及腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)等，而病變組織活檢仍然是癌癥確診的金標(biāo)準(zhǔn)。常規(guī)的影像學(xué)檢測(cè)結(jié)果雖然可以為臨床的診斷提供一定的依據(jù)，但是對(duì)于微小病灶的發(fā)現(xiàn)仍缺乏敏感性，且花費(fèi)較多，同時(shí)組織活檢又給患者帶來(lái)了極大的痛苦，并且存在一定的主觀(guān)性。腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)雖然應(yīng)用廣泛，但其診斷效能并不理想，F(xiàn)eng等[2]采用四項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物(CEA、CA19-9、AFP和CA125)聯(lián)合的方式對(duì)胃癌進(jìn)行診斷，其陽(yáng)性率僅為10.4%，而李曉舟等[3]利用激光誘導(dǎo)拉曼光譜技術(shù)對(duì)萎縮性胃炎患者、胃癌患者血清進(jìn)行分析，其判別胃癌和萎縮性胃炎的準(zhǔn)確率可達(dá)92%。拉曼光譜作為一種非侵入性的，富含高生化信息含量的檢測(cè)手段，可以直接對(duì)生物樣本(組織、血漿、唾液等)進(jìn)行檢驗(yàn)[4-6]，極大的減輕了患者的痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

2 拉曼光譜在癌癥中的應(yīng)用

2.1 胃癌

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一。2012年，全球約有925 000人被診斷為胃癌，占新發(fā)癌癥的6.8%[7]。與其它癌癥相比，早期胃癌的生存率較高且預(yù)后較好，因此，尋求一種胃癌早期診斷的新模式對(duì)于改善胃癌患者的死亡率有著重要的意義。

Luo等[8]應(yīng)用近紅外拉曼光譜技術(shù)對(duì)胃癌組織、癌前病變組織(腺瘤性息肉)及正常胃黏膜組織的拉曼光譜進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在853(脯氨酸的C-C伸縮模式)、936(蛋白α-螺旋構(gòu)象中的C-C伸縮)、1032(苯丙氨酸的C-H伸縮)、1174(酪氨酸的C-H彎曲)和1208 cm-1(苯丙氨酸和色氨酸的C-C6H5拉伸模式)附近的拉曼峰的強(qiáng)度從正常到癌組織逐漸降低，當(dāng)正常組織逐漸向腺瘤性息肉和腺癌組織轉(zhuǎn)化時(shí)，位于1323，1335，1450和1655 cm-1(表征蛋白質(zhì)和核酸)處的拉曼峰逐漸增強(qiáng)(圖1)。另一方面，相對(duì)于正常組織，腺瘤性息肉和胃癌組織在1640～1675 cm-1的光譜范圍內(nèi)出現(xiàn)了明顯的紅移。采用PCA-NBC、留一法及交叉驗(yàn)證法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判別分析，靈敏度分別為96.3%，96.9%和96.9%，特異度分別為93%，100%和95.2%，可見(jiàn)，與多變量統(tǒng)計(jì)算法相結(jié)合的近紅外拉曼光譜技術(shù)可以在分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌及癌前病變的早期診斷。Zhou等[9]在高波數(shù)區(qū)(2800～3000 cm-1)和低波數(shù)區(qū)(800～1800 cm-1)分析了38例正常組織和37例胃癌組織的拉曼光譜特征，并分別對(duì)兩個(gè)區(qū)域診斷的特異度和靈敏度進(jìn)行了評(píng)估，初步得到以下結(jié)論：(1)胃癌組織1157 cm-1的類(lèi)胡蘿卜素信號(hào)、1319 cm-1和1338 cm-1的蛋白質(zhì)和核酸信號(hào)強(qiáng)于正常組織，而在853 cm-1的膠原信號(hào)低于正常組織；胃癌組織位于2932 cm-1的蛋白信號(hào)顯著低于正常組織；(2)在低波數(shù)區(qū)診斷胃癌的靈敏度和特異度高于高波數(shù)區(qū)，但是高波數(shù)區(qū)域包含不在低波數(shù)區(qū)域中顯示的條帶(脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和水有關(guān)的信息)，因此利用高波數(shù)和低波數(shù)區(qū)域的互補(bǔ)性質(zhì)能使得胃癌的光學(xué)診斷更加完善。

圖1 正常胃黏膜、腺瘤性息肉、胃腺癌組織的平均光譜圖Figure 1 Comparison of average standardized Raman spectra with distinct Raman peaks of the normal，adenomatous polyp，and adenocarcinoma gastric tissue

2.2 口腔鱗狀細(xì)胞癌

口腔鱗狀細(xì)胞癌約占口腔癌的90%～95%[10]，是人類(lèi)十種最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，吸煙和飲酒是引起口腔鱗狀細(xì)胞癌的重要危險(xiǎn)因素。

Christian等[11]應(yīng)用便攜式移頻激發(fā)差分拉曼光譜(SERDS)研究了12例離體口腔鱗狀細(xì)胞癌組織，發(fā)現(xiàn)歸屬于脂質(zhì)(1745，1440，1330 cm-1)的光譜特征在癌組織中明顯減弱，而歸屬于蛋白質(zhì)及核酸(1550 cm-1)的其他光譜特征有增強(qiáng)的趨勢(shì)。薛麗麗等[12]應(yīng)用配備光纖探頭的便式拉曼光譜儀采集了新鮮的口腔黏膜鱗狀細(xì)胞癌、上皮重度異常增生及正常黏膜組織的拉曼光譜，研究發(fā)現(xiàn)，正常黏膜組織、上皮重度異常增生以及口腔鱗狀細(xì)胞癌組織間的拉曼光譜存在顯著的差別：上皮重度異常增生和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織拉曼光譜中歸屬于核酸(746，825，893 cm-1)、蛋白質(zhì)(640，664，853，1002，1445及1653 cm-1)及脂質(zhì)物質(zhì)(957，1306 cm-1)的譜峰明顯高于正常黏膜上皮組織，結(jié)合PCA-DFA建立的分類(lèi)診斷模型可以很好的表現(xiàn)出3類(lèi)不同組織的拉曼光譜間的差異。

2.3 宮頸癌

宮頸癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤。2013年，全世界有新發(fā)病例485 000名，其中死亡病例236 000名[13]。雖然近年來(lái)宮頸癌的發(fā)病率有所下降，但其年輕化的趨勢(shì)愈加突顯，因此，對(duì)于宮頸癌的早期篩查與及時(shí)診斷仍十分重要。

張海鵬等[14]對(duì)新鮮宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)組織及正常宮頸組織的拉曼光譜進(jìn)行探測(cè)，在正常的宮頸組織中，以817，1127，1176，1450，1769 cm(歸屬于脂類(lèi))譜帶處的拉曼峰為主導(dǎo)，而發(fā)生病變的宮頸組織以755，1003，1372，1542，1577 cm-1(歸屬于蛋白質(zhì))為主。其中宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)組織的拉曼峰集中在853和1546 cm-1(歸屬于蛋白質(zhì))處，并且在1515 cm-1處出現(xiàn)了在正常組織中含量甚微的類(lèi)胡蘿卜素的拉曼譜帶。而宮頸癌組織則含有明顯的核酸特征峰(784，1094，1345 cm-1)。Amuthachelvi等[15]應(yīng)用偏振拉曼光譜和常規(guī)拉曼光譜對(duì)同一位點(diǎn)的正常宮頸組織及宮頸癌組織進(jìn)行了探測(cè)，并比較了兩種光譜的靈敏度和特異度：偏振拉曼光譜除了能夠提供來(lái)自常規(guī)拉曼光譜的一般化學(xué)信息之外，還能給出關(guān)于振動(dòng)的取向和對(duì)稱(chēng)性的大量信息，常規(guī)光譜法產(chǎn)生的靈敏度為92.0%，特異度為75%，精確度為82.0%，而偏振拉曼光譜法測(cè)得的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度均高于常規(guī)拉曼光譜法?？梢?jiàn)，偏振拉曼光譜可以提供有利于疾病診斷的更為豐富的信息。

2.4 鼻咽癌

過(guò)去10年的流行病學(xué)趨勢(shì)表明，即使在高發(fā)地區(qū)，鼻咽癌的發(fā)病率和死亡率均有下降的趨勢(shì)[16]，發(fā)病率大于1/105，然而它是華南(包括香港)地區(qū)高發(fā)的惡性腫瘤，發(fā)病率大于20/105[17]，因其解剖位置較復(fù)雜，故診斷較為困難。

Qiu等[18]應(yīng)用顯微拉曼光譜對(duì)30例早期和46例晚期的離體鼻咽癌組織進(jìn)行了測(cè)定，二者在853，937，1004，1032，1094，1209，1268，1304，1340，1450，1527和1660 cm-1處具有明顯差異。相對(duì)于晚期鼻咽癌組織，位于1032和1209 cm-1的拉曼光譜強(qiáng)度明顯高于早期鼻咽癌組織，而位于853，937，1004，1094，1268，1304，1340，1450，1527和1660 cm-1峰的強(qiáng)度在晚期鼻咽癌組織中顯著降低。這些強(qiáng)度差異表明，在不同階段的鼻咽癌組織中，有某些特定的生物分子顯著增加或減少。利用PCA-LDA算法計(jì)算診斷的靈敏度為70%(21/30)，特異度為78%(36/46)，說(shuō)明顯微拉曼光譜聯(lián)合多元統(tǒng)計(jì)算法具有區(qū)分早期和晚期鼻咽癌組織的潛能。Li等[19]測(cè)定了鼻咽癌組織和正常鼻咽組織的拉曼光譜，鼻咽癌組織歸屬于苯丙氨酸(1001 cm-1)、核酸(1207、1340 cm-1)和脂質(zhì)(1658 cm-1)的拉曼信號(hào)強(qiáng)度較正常組織更為突出，而正常組織中的脯氨酸(848 cm-1)、纈氨酸(936 cm-1)、磷脂和膠原(1446 cm-1)的拉曼峰明顯強(qiáng)于鼻咽癌組織(表1)。在癌癥和正常對(duì)照組之間觀(guān)察到特異的光譜特征和相對(duì)強(qiáng)度差異，反映了與惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的分子和細(xì)胞變化。結(jié)果表明，拉曼光譜具有巨大的潛力，能夠及時(shí)分析和診斷鼻咽癌，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)內(nèi)鏡拉曼儀器的臨床應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

表1 鼻咽癌組織主要拉曼光譜峰的歸屬

2.5 乳腺癌

乳腺癌是我國(guó)女性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，但因篩查體系不健全、預(yù)防意識(shí)不足、診療資源不均衡等原因，導(dǎo)致晚期病人居多[20]，嚴(yán)重影響了患者的生存率。

Bing等[21]分別測(cè)定了正常乳腺組織、非典型性導(dǎo)管增生組織、原位導(dǎo)管癌組織和浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織的拉曼光譜。當(dāng)乳腺組織向惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)均會(huì)發(fā)生改變，具體表現(xiàn)如下：(1)正常乳腺組織的拉曼譜帶主要?dú)w屬于脂質(zhì)(1265，1300，1441和1743 cm-1)，相對(duì)于正常組織，非典型性導(dǎo)管增生組織的蛋白質(zhì)的振動(dòng)模式(1267，1301和1447 cm-1)較為突出，并且在1660 cm-1譜帶處出現(xiàn)了藍(lán)移；(2)在惡性組織的1600～1800 cm-1區(qū)域，與其對(duì)應(yīng)的脂肪鏈、磷脂、蛋白質(zhì)和核酸的濃度隨著組織惡性程度的增加而增加。Depciuch等[22]對(duì)2例三陰性乳腺癌病人的正常乳腺組織，化療前的乳腺癌組織，化療后的乳腺癌組織以及在癌性乳腺區(qū)域周?chē)姆前┬匀橄俳M織進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在正常乳腺組織中，特征峰主要位于酪氨酸(849 cm-1)和苯丙氨酸(1004 cm-1)的區(qū)域，此外，源自于類(lèi)胡蘿卜素的C=O健的譜帶(1158和1518 cm-1)也較為突出；化療前的乳腺癌組織的拉曼峰主要?dú)w屬于脯氨酸(588，1098 cm-1)，叔酰胺的CN鍵(1269 cm-1)以及衍生自脂肪的CH健；558 cm-1處的譜帶在乳腺癌組織、化療后的乳腺癌組織以及癌性乳腺區(qū)域周?chē)姆前┬匀橄俳M織中均較為突出；在化療后的組織中，苯丙氨酸的譜帶(1004 cm-1)消失，而脂質(zhì)的量顯著增加(2888，2926 cm-1)。這一事實(shí)證明，拉曼光譜有利于乳腺癌的病因?qū)W研究，同時(shí)也具有成為乳腺癌化療監(jiān)測(cè)的一種有效手段。

2.6 結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌的發(fā)病與飲食、肥胖、缺乏身體活動(dòng)、吸煙和中度到重度酒精使用均相關(guān)[23]。

羅舒文等[24]采用近紅外拉曼光譜技術(shù)對(duì)離體的正常結(jié)腸組織、腺瘤性息肉和腺癌組織的拉曼光譜進(jìn)行了比對(duì)分析，這三類(lèi)組織的光譜強(qiáng)度有著顯著的差異：從正常組織逐漸向腺瘤性息肉和腺癌發(fā)展的過(guò)程中，830，855，1032，1210 cm-1附近的拉曼信號(hào)強(qiáng)度呈遞減的趨勢(shì)，表明某些特定物質(zhì)的含量有所減低，例如脯氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等。另外，在上述病變的發(fā)展過(guò)程中，位于1323，1335，1655 cm-1附近的拉曼信號(hào)強(qiáng)度呈遞增趨勢(shì)，表明某些特定物質(zhì)的含量有所增加，例如蛋白質(zhì)和核酸等。Li等[25]采用近紅外拉曼光譜和特征選擇技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌，主要變化發(fā)生在800～860 cm-1，940～1030 cm-1，1210～1400 cm-1和1580～1660 cm-1的光譜范圍內(nèi)，其分別包含與蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)相關(guān)的信號(hào)。在800～860 cm-1和1580～1660 cm-1范圍內(nèi)正常組織的拉曼信號(hào)明顯強(qiáng)于癌組織，而在1210～1400 cm-1范內(nèi)的拉曼信號(hào)強(qiáng)度則相反。尤其是癌組織中歸屬于核酸的拉曼譜帶1323 cm-1(蛋白質(zhì)和核酸的CH3=CH2扭轉(zhuǎn))與正常組織相比變寬并且變強(qiáng)，揭示出與正常組織相比，腫瘤組織中的核酸含量明顯增多。這些變化表明在與腫瘤轉(zhuǎn)化相關(guān)的結(jié)直腸組織中存在一些類(lèi)型的生物分子的相對(duì)變化。

3 小結(jié)與展望

拉曼光譜作為一種新型的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)方法，可以反映正常組織到癌變的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的生化組成和結(jié)構(gòu)的改變，不但可以避免組織活檢給病人帶來(lái)的痛苦與負(fù)擔(dān)，而且可以彌補(bǔ)常規(guī)檢測(cè)方式中存在的不足。但該項(xiàng)技術(shù)仍處于初步研究階段，其用于癌癥篩查和診斷的標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一，且拉曼散射強(qiáng)度易受到背景熒光的干擾。隨著拉曼光譜技術(shù)的不斷完善，以及科研人員的不斷創(chuàng)新，拉曼光譜有望成為臨床癌癥早期診斷的新模式。

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