組蛋白賴(lài)氨酸轉(zhuǎn)移酶KAT6B基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定

靳俊杰 安 靜 曹滌非，3 宋愛(ài)利 趙麗麗 劉兆良

KAT6B/MORF基因是MYST家族的一員，是一種組蛋白修飾酶[1-3]，能特異地乙?；M蛋白H3的23位賴(lài)氨酸(H3K23)，而對(duì)14和16位的賴(lài)氨酸不起作用。有研究表明細(xì)胞內(nèi)H3K23的乙?；?H3K23ac)總體水平高度依賴(lài)于組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)活性，主要取決于KAT6B/MORF[1，3]基因。盡管組蛋白乙?；ǔＥc活性基因表達(dá)相關(guān)，但是H3K23ac的確切功能尚不清楚。H3K23ac在乳腺癌Ⅲ期患者中的表達(dá)水平明顯升高[4]，其表達(dá)水平高低和TNM分期之間存在線性趨勢(shì)。另外，H3K23ac表達(dá)水平高的乳腺癌患者的總生存期更短[4]。這一結(jié)果揭示了H3K23ac在乳腺癌中的重要作用。

KAT6B基因的突變與多種遺傳疾病相關(guān)，包括努南綜合癥(Noonan syndrome)、Say-Barber-Biesecker-Young-Simpson綜合癥[5]、髕骨綜合癥(Genitopatellar syndrome)和小臉裂綜合癥(Blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome)。這些疾病多與神經(jīng)和生殖系統(tǒng)的發(fā)育有關(guān)，說(shuō)明了KAT6B基因和H3K23ac在發(fā)育中的重要作用[6-9]。此外，KAT6B基因還與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。在急性髓細(xì)胞性白血病(Acute myelocytic leukemia，AML)中，KAT6B基因頻繁與其它基因發(fā)生重排，產(chǎn)生新的融合蛋白[1]。在基因組水平上的研究還表明KAT6B基因在包括前列腺癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺腺癌、結(jié)腸和直腸腺癌以及成神經(jīng)管細(xì)胞瘤在內(nèi)的多種實(shí)體瘤中頻繁發(fā)生擴(kuò)增[10-13]，與此同時(shí)，研究數(shù)據(jù)還表明KAT6B基因在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮著腫瘤抑制作用[1-2]。然而，KAT6B基因在不同腫瘤中作用尚不明確，作為一個(gè)H3K23位點(diǎn)特異的乙酰化轉(zhuǎn)移酶[14]，揭示KAT6B基因在腫瘤中的作用可以進(jìn)一步增加我們對(duì)H3K23ac在腫瘤中作用的了解。

本研究在乳腺癌細(xì)胞T47D中構(gòu)建了KAT6B基因沉默載體并對(duì)重組慢病毒載體的基因沉默效果進(jìn)行了鑒定。為進(jìn)一步確定KAT6B基因和H3K23ac在腫瘤中的作用，以及開(kāi)發(fā)以組蛋白乙?；癁榘悬c(diǎn)的抗腫瘤藥物打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DNA純化回收試劑盒(TIANGEN)、高保真Prime STAR酶、Premix Taq、限制性核酸內(nèi)切酶(TaKaRa公司)，慢病毒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒、載體質(zhì)粒pENTR/pSM2(CMV/GFP)和pLenti X1 Puro DEST(Addgene)，HEK293T細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞系T47D(上海細(xì)胞庫(kù))，質(zhì)粒DNA小提試劑盒(Axygen公司)，Gateway LR clonaseII(Invitrogen公司)，Clon Express MultiS(Vazyme公司)，牛胚胎血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、兔源的KAT6B一抗(Abcam公司)，兔源的Actin一抗(Gene Tex)，山羊抗兔二抗(博士德)，引物合成與測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；DNA電泳槽、穩(wěn)壓電泳儀、瓊脂糖凝膠成像分析儀(Thermo公司)，超微量分光光度計(jì)、冷凍高速離心機(jī)、PCR儀(BIO-RAD公司)。

1.2 基因沉默載體的構(gòu)建

1.2.1 KAT6B基因沉默載體shRNA的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]中的方法和文獻(xiàn)中KAT6B基因的shRNA序列，設(shè)計(jì)并合成2對(duì)單鏈的shRNA序列，以此為模板設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增引物。在上游引物引入XhoI酶切位點(diǎn)，下游引物引入EcoRI酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶液回收。shRNA及引物的序列見(jiàn)表1。

1.2.2 入門(mén)載體的構(gòu)建與鑒定 用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI與XhoI將入門(mén)載體pENTR/pSM2(CMV/GFP)酶切，從瓊脂糖凝膠回收。將該線性化載體與回收得到的shRNA序列通過(guò)一步法克隆進(jìn)行重組連接[16]。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。所得的單克隆菌落提取質(zhì)粒后首先用XhoI與EcoRI酶切鑒定，隨后測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.3 pLPG慢病毒沉默載體的構(gòu)建與鑒定

將上述含有目的片段、測(cè)序完全正確的入門(mén)質(zhì)粒與pLenti X1 Puro DEST質(zhì)粒進(jìn)行LR克隆反應(yīng)。轉(zhuǎn)化后得到的陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序正確的目的質(zhì)粒用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。因?yàn)槿腴T(mén)載體為pENTR/pSM2(CMV/GFP)，目的載體為pLenti X1 Puro DEST，最終獲得的載體縮寫(xiě)為pLPG。

1.4 病毒包裝及細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)

將2×106個(gè)HEK293T細(xì)胞接種至含有10%牛胚胎血清的高糖DMEM培養(yǎng)基的25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%融合時(shí)，將目的載體質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒(pMD2和pPAX2)用Lipo-2000(pPAX2，目的載體質(zhì)粒，和pMD2比例分別為10∶10∶1)共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。轉(zhuǎn)染18 h后換為完全培養(yǎng)基并觀察熒光。換液后分別在48 h和72 h收取病毒上清并用0.45 μM濾器過(guò)濾。將過(guò)濾后的病毒上清與病毒濃縮液Lenti-X concentrator按3∶1比例混合，4℃過(guò)夜。次日，將混合物于1500 xg，4℃離心45 min。棄上清，用 120 μL的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸病毒。將前一天接種好的T47D細(xì)胞(6孔板，4×105/孔)用1.2 mL含有polybrene(終濃度為8 μg/mL)的無(wú)血清RPMI-1640換液，將重懸的病毒120 μL加入6孔板中，32℃，2000 rpm離心2 h。在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h后，補(bǔ)入1 mL完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察熒光，收蛋白。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Kaplan-Meier法分析總體生存率和中位生存時(shí)間，采用Log-rank檢驗(yàn)比較兩組生存曲線，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 構(gòu)建慢病毒載體的shRNA序列

Note：The underlined sequences are sequences of the Scramble shRNAs and corresponding shRNAs.The italic sequences represent the restriction sites used for cloning.The boldfaced sequences are the primers sequences used for amplifying the shRNAs and scrambe shRNAs.

2 結(jié)果

2.1 KAT6B基因與乳腺癌的關(guān)系

為了研究KAT6B基因在乳腺癌中的作用，本研究利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)(www.kmplot.com)分析了KAT6B基因的表達(dá)水平對(duì)乳腺癌患者生存期的影響。該數(shù)據(jù)庫(kù)包含3 554個(gè)乳腺癌樣本，隨訪時(shí)間從1994年—2014年。分析發(fā)現(xiàn)KAT6B基因高表達(dá)的乳腺癌患者具有較長(zhǎng)的生存期。反之，KAT6B基因低表達(dá)的患者具有較短的生存期(HR=0.83，95%CI：0.74～0.93，P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，本研究認(rèn)為KAT6B基因在乳腺癌中是一個(gè)潛在的抑癌基因(圖1)。

2.2 pLPG慢病毒基因沉默載體的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

為了研究KAT6B基因在乳腺癌中的作用，本研究構(gòu)建了pLPG慢病毒基因沉默載體。首先，以Scrambled 5，shRNA5，Scrambled 8和shRNA8的單鏈序列為模板，用miR-30 PCRXhoIF和miR-30 PCREcoRIR為引物，擴(kuò)增大小約100 bp的PCR產(chǎn)物(圖2A)。入門(mén)載體pENTR/pSM2(CMV/GFP)用XhoI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物大小約3 850 bp(圖2B)。將回收后的PCR產(chǎn)物與線性化載體用一步法重組連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定與實(shí)際質(zhì)粒大小相符，測(cè)序鑒定顯示基因序列完全正確，無(wú)突變與缺失(圖2D，圖2E)。

圖1 KAT6B基因在3554位乳腺癌患者中總生存期的分析Figure 1 Survival analysis of KAT6B expression in 3554 patients with breast cancer

將所得的正確質(zhì)粒與目的載體pLenti X1 Puro DEST進(jìn)行LR克隆反應(yīng)。重組質(zhì)粒分別用EcoRI和XhoI單酶切(圖3)，酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，表明KAT6B基因沉默載體構(gòu)建成功。

2.3 KAT6B基因沉默載體效果檢測(cè)

將KAT6B慢病毒基因沉默載體與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48 h、72 h后，分別收取病毒上清。將濃縮后的病毒加入T47D細(xì)胞中，48 h后觀察熒光(圖4A)。收取蛋白，Western blot結(jié)果如圖4B所示，與對(duì)照組Scramble5、Scramble8相比，shRNA5、shRNA8轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組KAT6B基因的蛋白表達(dá)水平明顯降低。說(shuō)明構(gòu)建的pLPG-shRNA載體在乳腺癌細(xì)胞系中能夠?qū)AT6B基因起到沉默作用。

圖3 KAT6B基因沉默載體的鑒定Figure 3 Identification of KAT6B gene silencing vectorNote：Recombinant plasmids were digested with EcoRI or XhoI，respectively，and subjected to agarose gel electrophoresis(Lanes 1，3，5 and 7 were digested by EcoRI；lanes 2，4，6 and 8 were digested by XhoI).

圖4 KAT6B慢病毒基因沉默載體效果檢測(cè)Figure 4 Effects of KAT6B gene silencing vectors on T47 cellsNote：A.GFP expression after lentiviral infection in T47D cells(200×)；B.After shRNA5 and shRNA8 lentiviral infection，the expression of KAT6B protein was determined in T47D cells by Western blot.

3 討論

RNAi是細(xì)胞生物學(xué)研究中的一個(gè)重要工具[17-18]，是由大約20個(gè)堿基構(gòu)成的siRNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄后沉默。RNA干擾有2種方式，一種方法是可以直接轉(zhuǎn)染小干擾RNA，另一種方法是以質(zhì)?；虿《咀鳛檩d體來(lái)表達(dá)短發(fā)夾RNA。直接轉(zhuǎn)染的方法受到細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率的限制，應(yīng)用性受到局限。利用病毒載體表達(dá)shRNA則具有轉(zhuǎn)染效率高的優(yōu)點(diǎn)，大大減少了轉(zhuǎn)染效率低而帶來(lái)的不便[19]。其中慢病毒載體由于轉(zhuǎn)導(dǎo)效率穩(wěn)定，得到了廣泛地應(yīng)用。慢病毒載體包裝系統(tǒng)是在HIV-I病毒的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造的病毒載體包裝系統(tǒng)，可以高效率地將目的基因片段導(dǎo)入到人和動(dòng)物的原代細(xì)胞或細(xì)胞系中，將目的基因片段整合到宿主細(xì)胞基因組中。慢病毒可以有效的感染并整合進(jìn)入非分裂細(xì)胞，具有高效率、高穩(wěn)定性，而且很少誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。因此，慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi已經(jīng)成為多數(shù)研究者的首選。

本研究應(yīng)用慢病毒載體包裝系統(tǒng)將KAT6B基因沉默載體轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞T47D中，檢測(cè)KAT6B基因在蛋白水平的表達(dá)變化。首先設(shè)計(jì)了2對(duì)基因沉默靶序列，經(jīng)PCR擴(kuò)增后與酶切后的入門(mén)載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后提取質(zhì)粒，經(jīng)基因測(cè)序證明插入片段的序列大小、方向均與設(shè)計(jì)的序列一致，然后將得到的測(cè)序正確的入門(mén)載體與目的載體經(jīng)LR克隆發(fā)生重組，得到所需的慢病毒基因沉默載體，該載體經(jīng)EcoR I和Xho I單酶切驗(yàn)證，證明入門(mén)載體與目的載體發(fā)生重組，表明該慢病毒基因沉默載體構(gòu)建成功。經(jīng)慢病毒載體包裝系統(tǒng)包裝后，轉(zhuǎn)導(dǎo)T47D細(xì)胞。Western blot檢測(cè)KAT6B基因蛋白水平的表達(dá)量，證明設(shè)計(jì)的shRNA對(duì)KAT6B基因有一定的沉默效果。在乳腺癌患者中H3K23ac表達(dá)水平與TNM分期呈線性關(guān)系，H3K23ac表達(dá)水平高的患者的生存期短。說(shuō)明H3K23ac水平高低與乳腺癌患者生存期長(zhǎng)短有關(guān)[4]。又有研究發(fā)現(xiàn)KAT6B基因的突變可能與多種遺傳疾病有關(guān)，還可能與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與預(yù)后有著密切關(guān)系。因?yàn)镵AT6B基因是一種組蛋白修飾酶，能特異地乙?；疕3K23。而H3K23ac表達(dá)水平又依賴(lài)于HAT活性，取決于KAT6B基因。所以KAT6B基因作為一個(gè)H3K23位點(diǎn)特異性乙?；D(zhuǎn)移酶與腫瘤之間的關(guān)系可能是通過(guò)H3K23ac來(lái)完成。有研究顯示KAT6B基因作為一個(gè)腫瘤抑制基因，可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，通過(guò)與生長(zhǎng)抑制因子5(ING5)共同作用發(fā)揮腫瘤抑制作用[20]。因此揭示KAT6B基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，也可以進(jìn)一步增加了我們對(duì)H3K23ac在腫瘤作用的了解。這一結(jié)果為今后進(jìn)一步研究KAT6B基因在乳腺癌中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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