外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫蘇幼苗生長的影響

李 愛， 孫汪亮， 李 林， 孫 鋒

(天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384)

紫蘇(PerillafrutescensL.Britt)為唇形科紫蘇屬一年生草本植物，是我國衛(wèi)生部門最早批準(zhǔn)的藥食同源植物之一。紫蘇的經(jīng)濟(jì)價(jià)值非常高，發(fā)展前景也十分廣闊[1-2]。目前對(duì)紫蘇的研究大多集中在營養(yǎng)成分提取、藥理作用評(píng)定等方面，而對(duì)紫蘇的生產(chǎn)和逆境生理方面的研究相對(duì)較少[3-5]。水分是植物生長乃至一切生命活動(dòng)所必需具備的重要環(huán)境因子之一。在自然環(huán)境下，植物生長發(fā)育的過程經(jīng)常會(huì)遭受干旱或澇害的脅迫[6]。特別是在苗期，干旱脅迫往往會(huì)給植物中后期的生長帶來較大的負(fù)面影響[7]。干旱使細(xì)胞失水萎蔫，細(xì)胞膜受損、透性加大，植物生理代謝紊亂，呼吸作用異常，光合功能下降，干物質(zhì)的積累和分配受到影響，最終導(dǎo)致植株產(chǎn)量和品質(zhì)下降[8-13]。

植物生長調(diào)節(jié)劑普遍被用來調(diào)節(jié)植物生長和提高植物的抗逆能力，因此探究潛在的植物生長調(diào)節(jié)劑及其作用機(jī)制對(duì)增強(qiáng)作物抵抗干旱的能力具有重要意義[14]。1995年，在高等植物中首次發(fā)現(xiàn)褪黑素[15]，作為一種抗氧化劑和植物保護(hù)劑，褪黑素在抵御氧化脅迫和環(huán)境傷害方面發(fā)揮著較大的作用[16]。在逆境條件下，植物體內(nèi)的褪黑素積累量會(huì)出現(xiàn)增多的現(xiàn)象。其次，外源褪黑素也具有廣譜的清除自由基作用，能減輕逆境脅迫下植物受到的過氧化損傷[17]。葉君等對(duì)小麥的研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，褪黑素能夠改善小麥的光合特性，使小麥幼苗抵抗干旱和恢復(fù)的能力得到了提高[14]。鹽脅迫顯著抑制了海棠幼苗的正常生長，而外施褪黑素緩解了鹽脅迫的抑制作用[18]。在高溫脅迫下，外施褪黑素后，黃瓜的超氧自由基產(chǎn)生速率和H2O2含量顯著降低，并且褪黑素能夠有效清除黃瓜體內(nèi)過多的活性氧，抑制細(xì)胞膜透性和丙二醛含量的增大，提高黃瓜植株葉片的抗氧化系統(tǒng)酶活性和可溶性蛋白質(zhì)的含量，對(duì)黃瓜抵抗高溫的能力有顯著增強(qiáng)作用[19-21]。對(duì)野生葉用芥菜施加低濃度的外源褪黑素(0.1 mmol/L)后，促進(jìn)了芥菜的根長生長，然而在施加高濃度的褪黑素(100 mmol/L)后，幼苗生長受到了抑制[22]。

本試驗(yàn)以紫蘇為材料，利用聚乙二醇-6000(polyethylene glycol，簡稱PEG-6000)模擬干旱環(huán)境，探究不同濃度的外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫蘇幼苗生長和生理指標(biāo)的影響，從而加強(qiáng)人們對(duì)褪黑素提高紫蘇抗旱性作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為更好地利用外源褪黑素指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫蘇種子由河北省安國中藥材推廣站提供，播種后選取長勢(shì)一致的幼苗用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 幼苗培養(yǎng)及處理 選取大小均勻、籽粒飽滿的紫蘇種子，溫水浸種10 min，蒸餾水浸種24 h，然后將種子放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)催芽3 d，最后播種于混有草炭、蛭石、珍珠巖的基質(zhì)中(V草炭∶V蛭石∶V珍珠巖=1 ∶1 ∶1)，3 d 后胚芽破土，10 d后選取長勢(shì)一致的幼苗移栽到育苗穴盤中。移栽后的紫蘇幼苗分為6個(gè)處理組：CK1、CK2、M50、M100、M300、M500。每個(gè)處理24株幼苗，重復(fù)3次。待幼苗長至4葉1心時(shí)，每隔1 d給幼苗澆1次1/2 Hogland’s營養(yǎng)液。開始處理時(shí)，連續(xù)3 d根外施加外源褪黑素后，再用10% PEG-6000溶液連續(xù)脅迫處理3 d，各處理施加的試劑及濃度如表1所示，處理結(jié)束2 d后同時(shí)間取樣，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。部分樣品保存于-80 ℃冰箱中備用。

表1 紫蘇幼苗的不同處理

1.2.2 幼苗葉長、葉寬及長寬比的測(cè)定 每個(gè)處理取12株幼苗，選取第1對(duì)真葉測(cè)量葉片的長度(L)和寬度(W)，重復(fù)3次。長寬比=L/W。

1.2.3 幼苗干鮮質(zhì)量的測(cè)定及相對(duì)含水量 采取稱質(zhì)量法測(cè)定紫蘇幼苗的相對(duì)含水量。將育苗穴盤中正常生長的幼苗表面的水分擦干，并將根部殘留的基質(zhì)土去掉，稱質(zhì)量，記錄幼苗鮮質(zhì)量(fresh weight，簡稱FW)。將樣品放置在105 ℃條件下殺青15 min，再于80 ℃恒溫條件下烘干至恒質(zhì)量，稱其質(zhì)量，記錄幼苗干質(zhì)量(dry weight，簡稱DW)，重復(fù)3次。根據(jù)公式計(jì)算相對(duì)含水量：相對(duì)含水量=(FW-DW)/FW×100%。

1.2.4 相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定 丙二醛(malonic dialdehyde，簡稱MDA)含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid，簡稱TBA)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱SOD)活性采用SOD抑制氮藍(lán)四唑(nitro-blue tetrazolium，簡稱NBT)光化還原法測(cè)定；過氧化物酶(peroxidase，簡稱POD)活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚顯色法；可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0軟件在0.05水平上對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)作單因素方差分析，以Duncan’s新復(fù)極差法比較不同處理間的差異顯著性，并采用Excel繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下紫蘇幼苗葉片的影響

由圖1-a可知，與對(duì)照組1(CK1)相比，不管是否外施褪黑素，干旱脅迫均使幼苗的葉長顯著下降，其中CK2比CK1的葉長顯著下降15.50%。在干旱脅迫下，外施褪黑素的濃度為100 μmol/L時(shí)，幼苗葉長達(dá)到最大值，為2.33 cm，與CK1相比，幼苗葉長顯著下降9.69%，與CK2相比，葉長增長 6.88%，但差異不顯著。由圖1-b可知，與CK1相比，CK2葉寬下降4.97%。在干旱脅迫下當(dāng)褪黑素的濃度為 100 μmol/L 時(shí)，幼苗葉寬達(dá)到最大值，為1.55 cm；與CK1相比，M100處理的幼苗葉寬下降3.73%，與CK2相比，M100處理的幼苗葉寬增長1.31%，但差異不顯著。

由圖1-c可知，對(duì)照組1(CK1)葉片長寬比為1.60，而CK2的長寬比為1.42，顯著下降11.25%，說明干旱脅迫能使紫蘇幼苗葉片長寬比顯著下降。與CK2相比，通過外施褪黑素能增加幼苗葉片長寬比，且隨著褪黑素濃度的增加，葉片長寬比呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)，但均低于CK1。當(dāng)褪黑素濃度達(dá)到300 μmol/L時(shí)，長寬比達(dá)到最大值，為1.55，與CK2相比，長寬比提高9.15%。結(jié)果表明，在用10% PEG-6 000溶液脅迫處理紫蘇幼苗時(shí)，外施褪黑素能提高葉片的長寬比，起到緩解干旱脅迫的作用。

2.2 褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下紫蘇幼苗相對(duì)含水量的影響

由圖2可知，對(duì)照組1(CK1)紫蘇幼苗的相對(duì)含水量為89.01%，干旱脅迫處理后，CK2的相對(duì)含水量為85.35%，比CK1顯著下降4.11%。干旱脅迫下外施不同濃度的褪黑素處理紫蘇幼苗，隨著褪黑素濃度的增加，紫蘇幼苗相對(duì)含水量呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)褪黑素濃度為100 μmol/L時(shí)，相對(duì)含水量達(dá)到最大值，為89.25%，與CK1的相對(duì)含水量相當(dāng)。當(dāng)褪黑素的濃度為500 μmol/L時(shí)，紫蘇幼苗相對(duì)含水量為83.75%，與CK1相比，相對(duì)含水量顯著下降5.91%，與CK2相比，紫蘇幼苗相對(duì)含水量下降1.87%，但差異不顯著。結(jié)果表明，干旱脅迫處理紫蘇幼苗時(shí)，低濃度的褪黑素能夠提高幼苗的抗旱能力，增加幼苗相對(duì)含水量。而當(dāng)褪黑素的濃度超過一定范圍時(shí)，其作用效果逐漸降低，甚至不能起到增加幼苗相對(duì)含水量的作用。

2.3 褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下紫蘇幼苗膜脂過氧化程度的影響

干旱脅迫處理可以導(dǎo)致植物體內(nèi)的活性氧大量積聚，這樣就給植物體造成了膜脂過氧化傷害，而MDA就是膜脂過氧化的產(chǎn)物，MDA的積累可作為膜脂過氧化程度的指標(biāo)之一。由圖3可知，CK2處理下MDA含量較CK1有大幅度提升，比CK1顯著提高67.19%。而經(jīng)過褪黑素處理后，MDA含量隨著褪黑素濃度的增加而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，當(dāng)褪黑素濃度為500 μmol/L時(shí)，MDA含量達(dá)到最低值，與CK1相比，MDA含量下降6.25%，與CK2相比，MDA含量顯著下降 43.93%。這表明在干旱脅迫下外施褪黑素，能減輕紫蘇幼苗膜脂過氧化作用，在一定程度上很好地緩解干旱脅迫下幼苗所受到的氧化損傷。

2.4 褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下紫蘇幼苗SOD、POD活性的影響

由圖4-a可知，紫蘇幼苗的POD活性在干旱脅迫處理下(CK2)比對(duì)照組(CK1)顯著下降18.84%。在干旱脅迫下外施褪黑素，POD活性隨著褪黑素濃度的增加呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，且當(dāng)外施褪黑素濃度為500 μmol/L時(shí)，達(dá)到最佳的處理效果，與CK2相比，POD活性顯著提高26.79%。由圖 4-b可知，SOD活性在干旱脅迫處理下(CK2)比CK1下降 8.74%。干旱脅迫下使用不同濃度的褪黑素處理紫蘇幼苗，其SOD活性未呈現(xiàn)明顯的變化趨勢(shì)，當(dāng)外施褪黑素濃度為100 μmol/L時(shí)，SOD活性達(dá)到最高值，與CK2相比提高 8.51%，但差異不顯著。結(jié)果表明，外施一定濃度的褪黑素可以提高干旱脅迫下紫蘇幼苗的抗氧化酶活性，緩解干旱脅迫造成的傷害。

2.5 褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下紫蘇幼苗可溶性蛋白含量的影響

植物體內(nèi)的可溶性蛋白參與植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞滲透勢(shì)以及水分平衡。由圖5可知，干旱脅迫時(shí)，CK2的可溶性蛋白含量比CK1顯著提高15.24%。而在干旱脅迫下使用褪黑素處理紫蘇幼苗，其可溶性蛋白含量與CK2相比均表現(xiàn)出下降，但使用不同濃度的褪黑素處理時(shí)，各處理間差異不顯著。當(dāng)外施褪黑素的濃度為500 μmol/L時(shí)，可溶性蛋白含量達(dá)到最低值，比CK2顯著下降8.51%，比CK1增加 5.43%。這說明在干旱脅迫下用褪黑素處理紫蘇幼苗，在一定程度上可以有效降低幼苗所遭受干旱脅迫的程度。

3 結(jié)論與討論

干旱環(huán)境對(duì)植物體生長以及生物量的形成具有較大影響，在自然條件下，植物生長發(fā)育的過程中經(jīng)常會(huì)遭遇水分不足等情況。大量研究表明，植物在苗期，易遭遇干旱脅迫而使幼苗的生長勢(shì)變?nèi)酰?duì)幼苗中后期的生長帶來一些不可逆轉(zhuǎn)的不利影響，最終導(dǎo)致作物產(chǎn)量下降。本試驗(yàn)利用10% PEG-6000溶液模擬干旱環(huán)境，栽培紫蘇幼苗。與正常條件下生長的紫蘇幼苗相比，干旱脅迫使幼苗葉片的長寬比、相對(duì)含水量以及過氧化酶活性顯著下降，同時(shí)顯著提高M(jìn)DA和可溶性蛋白的含量。這充分說明10% PEG-6000溶液模擬干旱環(huán)境對(duì)紫蘇幼苗的生長和生理造成了嚴(yán)重的抑制作用。

含水量是植物體內(nèi)水分狀況的一個(gè)重要度量指標(biāo)，植物組織含水量可直接影響植物的生長、氣孔狀況、光合功能甚至植物產(chǎn)量。結(jié)果表明，在干旱脅迫下，外施適宜濃度褪黑素能夠提高紫蘇幼苗的相對(duì)含水量，說明褪黑素處理能有效改善紫蘇幼苗的水分狀況，減弱干旱脅迫所造成的傷害。

干旱脅迫時(shí)，植物體光合作用會(huì)受到一定程度的抑制，光合速率下降，出現(xiàn)光能過剩現(xiàn)象，從而造成植物體內(nèi)活性氧的積累。活性氧的過量累積會(huì)導(dǎo)致膜脂過氧化傷害，而MDA就是膜脂過氧化傷害的最終產(chǎn)物，MDA含量的高低反映細(xì)胞膜遭受破壞的程度[23]。本試驗(yàn)中，紫蘇幼苗在干旱脅迫下MDA含量比對(duì)照組1(CK1)顯著提高67.19%，而使用褪黑素處理后紫蘇幼苗體內(nèi)MDA含量較CK2顯著下降，且隨著外施褪黑素濃度的增加，MDA含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，使MDA含量維持在較低水平。當(dāng)褪黑素濃度為500 μmol/L時(shí)，MDA含量達(dá)到最低值，比CK2顯著下降43.93%。同時(shí)，使用褪黑素處理后的紫蘇幼苗SOD和POD的活性也有所提高，有效地分解過量的活性氧。這與Tan等報(bào)道的在植物體內(nèi)，褪黑素具有抗氧化的作用，可提高過抗氧化酶的活性這一研究結(jié)果[24]一致。結(jié)果表明，在干旱脅迫下使用褪黑素處理紫蘇幼苗，提高了紫蘇幼苗的抗氧化能力，在一定程度上有效緩解干旱脅迫所造成的氧化損傷，維持光合系統(tǒng)的穩(wěn)定，進(jìn)而大大改善葉片的光合性能。

植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)有利于增強(qiáng)植物的抗逆性，增強(qiáng)植物對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力[25]。大多數(shù)植物遭受環(huán)境脅迫時(shí)，會(huì)在體內(nèi)積累大量可溶性物質(zhì)，例如可溶性蛋白?？扇苄缘鞍鬃鳛橹参锏臐B透調(diào)節(jié)劑，能夠調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的滲透勢(shì)，這種作用主要體現(xiàn)在保護(hù)植物細(xì)胞的滲透平衡[26]。本試驗(yàn)中，在干旱脅迫下紫蘇幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量急劇上升，外施褪黑素后，可溶性蛋白質(zhì)含量有所下降，這說明褪黑素處理后的紫蘇幼苗具備一定的抵抗干旱脅迫的能力。

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