1.8% 嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌(Rhizoctonia solani)的作用機制研究

司洪陽， 杜 紅， 郝學政， 趙秀香， 吳元華

(沈陽農業(yè)大學植物保護學院，遼寧沈陽 110161)

嘧肽·多抗水劑是由生物農藥嘧肽霉素[1]和多抗霉素復配而成的新型農用抗生素，已獲農藥臨時登記，其理化性質穩(wěn)定，能夠耐高溫、酸堿和陽光照射，且無毒無害，對大多數(shù)植物真菌病害均有一定的防治作用。煙草靶斑病是近幾年我國煙草上發(fā)現(xiàn)的一種新病害，主要由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起[2-3]。煙草靶斑病主要危害煙草葉片，在苗期至大田成熟期均可發(fā)生，一旦發(fā)生迅速蔓延，造成煙葉質量和產量降低[4]，已成為影響煙草產量和品質的重要病害之一。目前，尚未發(fā)現(xiàn)較好的抗病品種，藥劑防治依然是控制煙草靶斑病的主要手段[5]。本試驗研究1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌的抑菌方式和作用機制，以期為煙草靶斑病的田間防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試病原菌為煙草靶斑病病菌(RhizoctoniasolaniKühn)，由沈陽農業(yè)大學植物保護學院提供。

供試藥劑為1.8%嘧肽·多抗水劑，由沈陽紅旗林藥有限公司提供。

PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、18 g 瓊脂粉、1 L蒸餾水；PD培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、1 L蒸餾水。

供試試劑盒：真菌DNA提取試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲生長的抑制作用 采用含藥培養(yǎng)基法測定煙草靶斑病病菌的抑菌活性，將定量的PDA培養(yǎng)基加熱融化，冷卻至45 ℃左右，分別加入不同濃度的1.8%嘧肽·多抗水劑，使其終濃度分別為5.63、11.25、22.50、45.00、90.00 mg/L，并以不加藥劑作為對照，充分混勻，倒入培養(yǎng)皿中，制成含藥培養(yǎng)基。

用打孔器制取直徑為6 mm的菌餅，將菌絲面朝下接種在PDA平板中間位置，每組設置3個重復，將培養(yǎng)皿放入 28 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng)，直至菌絲長滿培養(yǎng)皿后，用十字交叉法測量菌落直徑，并用下列公式計算出菌絲生長抑制率：

1.2.2 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲形態(tài)的影響 制備煙草靶斑病病菌的菌絲懸浮液，移入含定量PD培養(yǎng)基的三角瓶中，置于28 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，然后加入一定量嘧肽·多抗水劑使其終濃度為90.00 mg/L，并于藥劑處理4、8、12、16、24 h后進行取樣，在顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)變化。

1.2.3 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲細胞膜滲透性的影響 將制備好的菌懸液倒入定量的PD培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h，分別加入1.8%嘧肽·多抗水劑，使其終濃度為11.25、45.00、90.00 mg/L，每個處理3次重復，并以不加藥劑的處理作為對照。加入藥劑后，立即取出5 mL培養(yǎng)液，用電導率儀測定其電導率，剩下的菌懸液繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別于4、8、12、20、24 h后取出培養(yǎng)液，離心處理后留上清液測其電導率[6]。

1.2.4 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲麥角甾醇含量的影響 參考單慰曾等的方法[7]，制備菌絲懸浮液后倒入PD培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)48 h后分別加入嘧肽·多抗藥劑，使其終濃度分別為1.25、22.50、45.00、90.00 mg/L，每個處理3次重復，并以不加藥劑的處理作為對照。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用紗布過濾，磷酸緩沖液清洗各處理菌絲3次，取出后放入離心管中，6 000 r/min離心收集菌絲體。各處理分別取2.5 g濕菌絲，加入甲醇和三氯甲烷(體積比為2 ∶1)混合液，研磨至勻漿后室溫靜置1 h，依次加入水、三氯甲烷和磷酸緩沖液各5 mL，待分層后取三氯甲烷相，水浴蒸干。加入甲醇和乙醇(體積比為4 ∶1)混合液，60 ℃皂化1 h，加入水和石油醚各4 mL，取石油醚層蒸干，用乙醇溶液溶解干物質，定容至 3 mL，用分光光度計在282 nm處測定其吸光度(D282 nm)，由吸光度可求出菌絲麥角甾醇含量的變化(x)，公式如下：

1.2.5 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲脂質過氧化的影響 收集菌絲體的方法同“1.2.4”節(jié)，PD液體培養(yǎng)基留存待用。稱取2.0 g濕菌絲體，加液氮研磨至粉末狀，加入 4 mL 巴比妥酸和三氯乙酸混合液(1.5 g 2-硫代巴比妥酸溶于30 mL三氯乙酸，蒸餾水定容至150 mL)，溶解菌絲體內產生的丙二醛，12 000 r/min離心，取上清液轉移到試管中，沸水處理使丙二醛與巴比妥酸產生顯色反應。冰浴冷卻后 12 000 r/min 再次離心，取上清液待測。同時，將液體培養(yǎng)基與巴比妥酸和三氯乙酸的混合液按體積比5 ∶2混合，分別測定各處理樣品在450、532、600 nm處的吸光度[8]，并按以下公式計算丙二醛(MDA)的濃度(CMDA)：

CMDA=6.45(D532 nm-D600 nm)-0.56D450 nm。

1.2.6 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲DNA合成的影響 取各濃度嘧肽·多抗藥劑處理后的菌絲，用濾紙吸干菌絲表面的水分，然后放入烘箱中，溫度設置為40～50 ℃，每5 min觀察1次，當菌絲水分蒸干即可取出；加入液氮研磨，磨碎成粉末后，倒入離心管中，使菌絲量在離心管0.5 mL刻度處。菌絲準備完畢后，采用真菌DNA提取試劑盒提取DNA，按照試劑盒具體步驟進行操作，最后將提取到的DNA收集到離心管中，測定DNA含量。

2 結果與分析

2.1 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲生長的抑制作用

由圖1可知，1.8%嘧肽·多抗水劑處理過的培養(yǎng)基中，隨著藥劑濃度的增大，病原菌菌落直徑不斷減小，菌絲生長也較為稀疏。經22.50～90.00 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑處理后，煙草靶斑病病菌菌絲不能正常生長，抑制率可達100%，經11.25、5.63 mg/L嘧肽·多抗處理后，煙草靶斑病病菌菌絲略有生長，但菌落顏色較淺，5.63 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑對菌絲生長的抑制率達40%。結果表明，1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲表現(xiàn)出較強的抑制作用。

2.2 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲形態(tài)的影響

經90.00 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑處理4 h后，菌絲開始發(fā)生變化，部分菌絲原生質凝聚并收縮(圖2-a)，8 h后菌絲出現(xiàn)畸形，原生質大量外滲，菌絲分枝不明顯，菌絲斷裂情況加重；而對照菌絲生長旺盛，未見原生質外滲，伸展力強，菌絲分隔明顯(圖2-b)。結果表明，1.8%嘧肽·多抗水劑可以通過破壞煙草靶斑病病菌的菌絲而達到抑制菌絲生長的作用。

2.3 1.8%嘧肽·多抗對煙草靶斑病病菌菌絲細胞膜滲透性的影響

電導率是病原菌菌絲細胞膜破壞程度的指標，電導率數(shù)值越大，說明細胞膜透性越大，細胞膜的破壞程度越嚴重。由圖3可知，在一定范圍內，隨著處理時間的延長和1.8%嘧肽·多抗水劑濃度的增加均會使電導率變大。加入藥劑后立即取出培養(yǎng)液進行測定，不同濃度的1.8%嘧肽·多抗水劑藥劑處理的菌絲與對照菌絲差異不明顯，電導率在1.41～1.45 μS/cm 之間；隨著處理時間的延長，各濃度處理的電導率均明顯增加，高濃度處理的電導率明顯比低濃度處理的電導率高，電導率增加的幅度從20 h后變化不明顯，由此推測，此時病原真菌菌絲細胞膜已被完全破壞。

2.4 1.8%嘧肽·多抗對煙草靶斑病病菌菌絲麥角甾醇含量的影響

麥角甾醇是真菌細胞膜的重要組分，它在確保膜結構的完整性、膜結合酶的活性、膜的流動性、細胞活力及物質運輸?shù)确矫嫫鹬匾饔?。試驗結果表明，在對照培養(yǎng)液中生長的煙草靶斑病病菌菌絲麥角甾醇含量與加入不同濃度1.8%嘧肽·多抗藥劑的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的菌絲麥角甾醇含量差別不大，由此可知，1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲中麥角甾醇的含量無明顯影響。

2.5 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲脂質過氧化的影響

丙二醛是膜質過氧化的產物，可表示脂質過氧化的程度，反映出膜損壞的程度。由表1可知，在對照處理中，丙二醛的總濃度為0.088 7 μmol/L，經過濃度為11.25 mg/L的1.8%嘧肽·多抗水劑處理后丙二醛的總濃度為 0.132 5 μmol/L，且隨著1.8%嘧肽·多抗水劑濃度的增加，煙草靶斑病病菌菌絲體內丙二醛的含量逐漸升高，即細胞膜脂質過氧化的程度加劇。

表1 不同濃度1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病 病菌菌絲丙二醛(MDA)的影響

2.6 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲DNA合成的影響

由表2可知，經45.00、22.50、11.25 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑處理的煙草靶斑病病菌菌絲DNA的含量有明顯變化。在45.00 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑處理的情況下，DNA合成抑制率為54.20%；在22.50 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑處理的情況下，DNA合成抑制率為46.35%；在 11.25 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑處理的情況下，DNA合成抑制率為34.12%。由此可知，1.8%嘧肽·多抗水劑可以在DNA水平上抑制菌絲生長。

表2 不同濃度1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病 病菌菌絲DNA含量的影響

3 結論與討論

本研究的結果表明，1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌具有良好的抑制作用，45.00 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑能夠有效抑制煙草靶斑病病菌菌絲生長，抑制率達到100%；5.63 mg/L 1.8%嘧肽·多抗對菌絲生長的抑制率也可達40%；同時，煙草靶斑病病菌經過1.8%嘧肽·多抗處理后，菌絲出現(xiàn)畸形，原生質大量外滲，菌絲分枝不明顯，菌絲斷裂。1.8%嘧肽·多抗能夠使煙草靶斑病病菌菌絲體電解質外滲，影響細胞膜透性的變化，且對煙草靶斑病病菌菌絲在相同處理時間內，隨著1.8%嘧肽·多抗水劑濃度的增加，電導率逐漸升高；在同一處理濃度下，在一定范圍內處理時間越長，電導率越大，對細胞膜的破壞程度越嚴重。1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲細胞膜麥角甾醇含量無明顯影響，但能夠使細胞膜脂質過氧化，釋放出丙二醛，且1.8%嘧肽·多抗水劑的濃度越大，丙二醛的含量越高。1.8%嘧肽·多抗水劑能夠抑制煙草靶斑病病菌菌絲DNA的合成，45.00 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲DNA合成的抑制率為54.20%，11.25 mg/L 1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病菌菌絲DNA合成的抑制率為34.12%。

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