滇牡丹3-酮酯酰-CoA合酶基因克隆與功能分析

朱金鑫， 孫金金， 原曉龍， 王 娟， 楊宇明， 王 毅

(1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明 650224； 2.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南昆明 650201； 3.國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室/云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室/云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650201)

牡丹屬芍藥屬牡丹組，具有很高的觀賞和藥用價(jià)值[1-2]，牡丹籽油作為中藥丹皮(牡丹根皮)生產(chǎn)中的副產(chǎn)品，其食用藥用價(jià)值逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，并不斷加強(qiáng)重視。研究人員發(fā)現(xiàn)，牡丹籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸，具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力[3]。滇牡丹(Paeoniadelavayi)主要分布在云南省中部至西北部、西藏自治區(qū)東南部和四川省西南部海拔 1 900～3 600 m的部分區(qū)域，是中國(guó)西南地區(qū)特有的珍稀種質(zhì)資源，1992年中國(guó)植物紅皮書將滇牡丹列為漸危種，1996年中國(guó)野生植物保護(hù)條例將滇牡丹定為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物[4-7]。滇牡丹雖然自然分布狹窄，但其栽培范圍廣[4]，因此具有極大的引種馴化和育種空間，應(yīng)用價(jià)值高。

超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸(very long chain monounsaturated fatty acid，簡(jiǎn)稱VLCMFA)是指主鏈上碳原子數(shù)≥18，有且僅有1個(gè)雙鍵的脂肪酸[8]。VLCMFA在生物體內(nèi)參與生物膜膜脂、鞘脂的合成，是角質(zhì)層蠟質(zhì)生物合成的前體物質(zhì)[9]，VLCMFA不僅在生物體內(nèi)具有廣泛的重要作用，而且具有獨(dú)特的醫(yī)療保健、化工用途，高單不飽和脂肪酸食用油具有降血脂、保護(hù)心腦血管、促進(jìn)嬰幼兒大腦發(fā)育等優(yōu)點(diǎn)[10-11]，在工業(yè)上可以制備人造纖維、表面樹脂、油漆干性劑等重要化工原料[12-13]。VLCMFA在生物體內(nèi)主要以油酸等單不飽和脂肪酸為底物，在脂肪酰-CoA延長(zhǎng)酶復(fù)合體的催化下合成，其中脂肪酰-CoA延長(zhǎng)酶復(fù)合體包括4個(gè)酶：3-酮酯酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoA synthase，簡(jiǎn)稱KCS)、3-酮酯酰-CoA還原酶(3-ketoacyl- CoA reductase，簡(jiǎn)稱KCR)、3-羥酯酰-CoA脫水酶(3-hydroxyacyl-CoA dehydrase，簡(jiǎn)稱HCD)、羥酯酰-CoA還原酶(enoyl-CoA reductase，簡(jiǎn)稱ECR)[14-15]，其中KCS催化步驟是其中的關(guān)鍵步驟[16]，因此被認(rèn)為是VLCMFA生物合成途徑中的限速酶而得到廣泛研究。目前KCS已經(jīng)在油菜[17-18]、大豆[19-20]、油桐[21]、油茶[22]等傳統(tǒng)油料作物中被廣泛研究，2011年中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部將牡丹籽油列入新資源食品后[23]，油用牡丹迅速成為研究熱點(diǎn)。本研究從滇牡丹中克隆得到KCS基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)制及獲得含高VLCMFA油用品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

滇牡丹種子于2014年6—9月采集于云南省昆明市林業(yè)科學(xué)院樹木園苗圃，樣本經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待用。總RNA小量提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司，pESY-T3克隆試劑盒與感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，LA-Taq酶、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1PdKCS基因的克隆 通過轉(zhuǎn)錄組分析獲得1個(gè)只含有部分滇牡丹KCS基因的序列片段，根據(jù)該基因片段序列設(shè)計(jì)特異性引物5′-RACE引物(本試驗(yàn)所用引物見表1)對(duì) 5′-基因片段進(jìn)行克隆。按照總RNA小量提取試劑盒操作步驟提取總RNA，檢測(cè)總RNA濃度及完整性后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。按照試劑盒操作步驟擴(kuò)增獲得PdKCS基因5′端序列片段，利用ATGC序列拼接軟件將5′-RACE獲得的基因片段和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得的基因片段進(jìn)行拼接后獲得PdKCS全長(zhǎng)基因序列。以PdKCS基因全長(zhǎng)序列為模板，設(shè)計(jì)含有起始密碼子和終止密碼子的特異性引物PdKCSF、PdKCSR，以滇牡丹種子cDNA為模板，PdKCSF和PdKCSR為引物擴(kuò)增PdKCS基因cDNA開放閱讀框全長(zhǎng)序列，PCR反應(yīng)體系參考PrimeScriptTMKit。擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 延伸7 min。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入pESY-T3載體中送測(cè)序公司檢測(cè)并驗(yàn)證。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam)在線工具分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；應(yīng)用ProtScale(http：//web.expasy.org/protscale/)在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)親疏水性預(yù)測(cè)分析；應(yīng)用Tmpred(http：//www.ch.embnet.org/soft-ware/TMPRED_form.html)在線工具分析蛋白質(zhì)序列跨膜結(jié)構(gòu)域；應(yīng)用Cell-PLoc(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位；應(yīng)用NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blast和DNAMAN生物學(xué)軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)分析；利用軟件MEGA 5.0以鄰位連接法構(gòu)建氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹；數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism v5.0進(jìn)行分析制圖。

表1 引物序列

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)PdKCS組織表達(dá)分析 以獲得的PdKCS基因序列為模板設(shè)計(jì)特異性引物PdKCSFt和PdKCSRt；分別采集滇牡丹授粉后30、50、70、90 d的種子，采集后立即放入液氮中。用RNA小量提取試劑盒提取滇牡丹不同發(fā)育時(shí)期的種子總RNA，電泳檢測(cè)后-80 ℃保存；參照反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV試劑盒合成cDNA，保存于 -20 ℃；RT-PCR反應(yīng)用熒光染料SYBR Green Ⅰ，GAPDH為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 25 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃單點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后，60 ℃連續(xù)檢測(cè)信號(hào)產(chǎn)生溶解曲線。用Opticon monitor 3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的記錄和分析。每個(gè)樣品3次重復(fù)，滅菌水為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PdKCS基因的克隆與序列分析

通過分析滇牡丹種子轉(zhuǎn)錄組獲得的KCS基因片段，依據(jù)獲得的基因片段設(shè)計(jì)5′-RACE基因擴(kuò)增特異性引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增5′-RACE獲得基因片段，利用ATGC序列拼接軟件，最終獲得全長(zhǎng)cDNA序列1 527 bp，命名為PdKCS，序列提交GenBank(登錄號(hào)KX524949)。利用NCBI ORF Finder軟件對(duì)拼接數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示PdKCS基因片段包含完整的cDNA開放閱讀框，編碼502個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，起始密碼子為ATG，終止密碼子TAA，并根據(jù)獲得的PdKCS基因全長(zhǎng)設(shè)計(jì)含有起始密碼子和終止密碼子的特異性引物，以cDNA為模板擴(kuò)增獲得PdKCS基因開放閱讀框，并將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到克隆載體中，進(jìn)行永久保存。

2.2 PdKCS蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，PdKCS分子式為C2 534H4 008N688O709S23，相對(duì)分子質(zhì)量為56 193.2，理論等電點(diǎn)為9.36，脂肪酸系數(shù)為96.1，親水性平均系數(shù)為-0.026，不穩(wěn)定指數(shù)為40.61，該蛋白為堿性親水不穩(wěn)定蛋白(圖1)。

PdKCS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖2所示，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示PdKCS定位于質(zhì)體膜。

2.3 PdKCS氨基酸序列比對(duì)分析

將克隆出來的PdKCS基因編碼的氨基酸蛋白序列與已報(bào)道的KCS的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。結(jié)果顯示，該蛋白與已報(bào)道的PdKCS含有KCS家族的高度保守區(qū)“PTPSLSAM”“FGNTSSSS”“GSGFKCNSAVW”和催化區(qū)域“GMGCSA”(圖3)，表明該蛋白屬于KCS家族蛋白。PdKCS的氨基酸序列與花生(Arachishypogaea)氨基酸序列(登錄號(hào)：ACZ51240.1)相似性達(dá)65.45%，與油茶(Camelliaoleifera)氨基酸序列(登錄號(hào)：ACQ41892.1)相似性達(dá)84.46%，與可可(Theobromacacao)氨基酸序列(登錄號(hào)：XP_007042184.1)相似性達(dá)85.46%，與樹棉(Gossypiumarboreum)氨基酸序列(登錄號(hào)：ALJ55536.1)相似性達(dá)81.3%。

2.4 PdKCS基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建基于PdKCS氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果表明，PdKCS與可可KCS(XP_007042184.1)聚為一類，親緣關(guān)系最近，與雙子葉植物聚為同一分支，與單子葉植物聚為不同分支，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。由基因系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，雙子葉植物的KCS已經(jīng)形成與單子葉植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的、相對(duì)獨(dú)立的家族，這與目前的研究結(jié)果相吻合。

2.5 熒光定量PCR檢測(cè)PdKCS

利用RT-PCR方法和PdKCS的基因特異性引物檢測(cè)其在授粉后30、50、70、90 d后種子中的表達(dá)情況(圖5)。使用GraphPad Prism v5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 結(jié)果顯示PdKCS的表達(dá)為雙峰型，在授粉后30 d時(shí)PdKCS的表達(dá)量達(dá)到第1個(gè)高峰，此后表達(dá)水平降低，在50 d后表達(dá)水平再次升高，在授粉后70 dPdKCS表達(dá)水平最高，而在種子發(fā)育后期，即授粉后70～90 d內(nèi)，PdKCS表達(dá)水平降低，不飽和脂肪酸合成量降低，以積累飽和脂肪酸等物質(zhì)以備萌發(fā)所需。

3 結(jié)論與討論

KCS是植物體內(nèi)催化以油酸等單不飽和脂肪酸延長(zhǎng)碳鏈產(chǎn)生超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸生物合成途徑的的關(guān)鍵。本研究將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析后克隆得到的滇牡丹KCS基因序列， 命名為PdKCS，GenBank登錄號(hào)為KX524949，包含完整的cDNA開放閱讀框，其開放閱讀框全長(zhǎng)1 527 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼含502個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，PdKCS含有KCS蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域，且與已報(bào)道的KCS具有高度一致性，表明該蛋白屬于KCS家族蛋白。蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，PdKCS分子式為C2 534H4 008N688O709S23，相對(duì)分子質(zhì)量為 56 193.2，理論等電點(diǎn)為9.36，脂肪酸系數(shù)96.1，親水性平均系數(shù)為 -0.026，不穩(wěn)定指數(shù)為40.61，該蛋白為堿性親水不穩(wěn)定蛋白，蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示該蛋白為跨膜蛋白，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示PdKCS定位于質(zhì)體膜。

滇牡丹具有生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)、栽培范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，因此滇牡丹具有極大的引種馴化和育種空間，牡丹籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸，具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力，因此選育出高單不飽和脂肪酸含量的油用滇牡丹品種并推廣種植，有利于促進(jìn)地區(qū)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。VLCMFA在生物體內(nèi)主要以油酸等單不飽和脂肪酸為底物，在脂肪酰-CoA延長(zhǎng)酶復(fù)合體的催化下合成，而脂肪酰-CoA延長(zhǎng)酶復(fù)合體中的KCS被認(rèn)為是VLCMFA生物合成途徑中的限速酶，對(duì)其深入研究有助于進(jìn)一步了解VLCMFA的合成過程及調(diào)控機(jī)制。因此，PdKCS基因可作為未來滇牡丹油脂高產(chǎn)型新品種培育的調(diào)控研究重點(diǎn)。本研究從滇牡丹中克隆得到KCS基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究它的調(diào)控機(jī)制及獲得種子單不飽和脂肪酸含量高的油用滇牡丹品種，促進(jìn)地區(qū)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值奠定理論基礎(chǔ)。

[1]潘開玉. 芍藥科分布格局及其形成的分析[J]. 植物分類學(xué)報(bào)，1995，33(4)：340-349.

[2]王蓮英. 中國(guó)牡丹品種圖志[M]. 北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1997：2-7.

[3]周海梅，馬錦琦，苗春雨，等. 牡丹籽油的理化指標(biāo)和脂肪酸成分分析[J]. 中國(guó)油脂，2009，34(7)：72-74.

[4]李 奎. 滇牡丹保護(hù)生物學(xué)與遺傳多樣性研究[D]. 北京：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，2013：1.

[5]龔 洵，潘躍芝，楊志云. 滇牡丹的多樣性和現(xiàn)狀評(píng)估[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2003，23(2)：218-223.

[6]中華人民共和國(guó)野生植物保護(hù)條例[J]. 河南省人民政府公報(bào)，1996(12)：14-16.

[7]于永福. 中國(guó)野生植物保護(hù)工作的里程碑——《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄(第一批)》出臺(tái)[J]. 植物雜志，1999(5)：3-11.

[8]Murphy D J，Mukherjee K D. Biosynthesis of triacylglycerols containing very long chain acyl moieties in seeds[M]// Biological Role of Plant Lipids，1989：143-146.

[9]倪 郁，郭彥軍. 植物超長(zhǎng)鏈脂肪酸及角質(zhì)層蠟質(zhì)生物合成相關(guān)酶基因研究現(xiàn)狀[J]. 遺傳，2008，30(5)：561-567.

[10]Okamoto T，Chimi K，Maruyama T，et al. Nutritional studies of hardened fish oil. Ⅰ：comparisons of the effects of hardened fish oil on fatty acid profiles of tissue lipids with those of soybean oil and hardened soybean oil in rats[J]. Journal of Japan Oil Chemists Society，1988，37：177-184.

[11]王性炎，王姝清. 神經(jīng)酸研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J]. 中國(guó)油脂，2010，35(3)：1-5.

[12]田德雨，王士安，王立昊，等. 超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸的生物合成和代謝工程[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2015，31(12)：42-49.

[13]周萬平，郎春秀，熊鮮艷，等. 油菜籽芥酸含量遺傳調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，24(3)：537-541.

[14]Kunst L，Clemens S. Plant long chain fatty acid biosynthetic enzyme：US，US 6815579 B1[P]. 2004(9)：12-26.

[15]淮東欣. 調(diào)控超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成關(guān)鍵基因?qū)χ参锓N子中脂肪酸組成的影響[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015：7-12.

[16]Qi Q，Rose P A，Abrams G D，et al. (+)-Abscisic acid metabolism，3-ketoacyl-coenzyme A synthase gene expression，and very-long-chain monounsaturated fatty acid biosynthesis in brassica napus embryos[J]. Plant Physiology，1998，117(3)：979-987.

[17]Guo Y，Mietkiewska E，F(xiàn)rancis T，et al. Increase in nervonic acid content in transformed yeast and transgenic plants by introduction of aLunariaannuaL. 3- ketoacyl-CoA synthase(KCS) gene[J]. Plant Molecular Biology，2009，69(5)：565-575.

[18]王 會(huì)，劉 佳，付 麗，等. 基因工程技術(shù)在油菜油脂中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013(24)：131-137.

[19]Cahoon E B，Marillia E F，Stecca K L，et al. Production of fatty acid components of meadowfoam oil in somatic soybean embryos[J]. Plant Physiology，2000，124(1)：243-51.

[20]趙 艷，翟 瑩，邱增成，等. 大豆KCS基因的克隆及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[J]. 分子植物育種，2013，11(1)：72-76.

[21]周俊琴，譚曉風(fēng)，劉美蘭，等. 油桐β-酮脂酰-CoA合成酶(KCS)基因的克隆與序列分析[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，2013，31(4)：52-57.

[22]李 魏. 油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的全長(zhǎng)cDNA克隆[D]. 北京：中南林業(yè)科技大學(xué)，2009：1-12.

[23]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部公告2011年第9號(hào)[J]. 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部公報(bào)，2011(2)：264.