植酸酶基因的定點(diǎn)突變及其在巴斯德畢赤酵母表面展示

余道兵，程學(xué)松，王群，史艷可，張昕*

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州311300；2.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州310058）

植酸（環(huán)己六醇-1，2，3，4，5，6-六磷酸酯）廣泛存在于植物種子中，其中谷物、油菜和豆類籽實(shí)中植酸磷占總磷的60%～80%[1]，而食物或植物性飼料中的鉀、鈣、鈉、鎂等礦物質(zhì)一般以植酸鉀鎂、植酸鈣鎂、植酸鈉鎂等復(fù)合鹽形式存在。單胃動(dòng)物體內(nèi)因?yàn)槿狈Ψ纸庵菜岬拿割怺2-5]，使得微量元素的營(yíng)養(yǎng)有效性大大降低[6]，因而必須在飼料中添加無(wú)機(jī)磷以滿足動(dòng)物對(duì)磷的需求，但這造成了磷源的浪費(fèi)，同時(shí)形成的高磷糞便也污染了環(huán)境[7-8]，造成水資源和土壤的嚴(yán)重污染。

植酸酶廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，不同來(lái)源的植酸酶具有顯著不同的分子特征和催化活性。植物中的植酸酶均屬于肌醇六磷酸-6-植酸酶，其最適pH范圍為5.0～7.5，不適合在單胃動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行催化[9]。反芻動(dòng)物瘤胃中的植酸酶含量少且活性低，不能有效地降解植酸[10]。產(chǎn)生自微生物的植酸酶（肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶）是目前商品化植酸酶最主要的來(lái)源。其中來(lái)源于絲狀真菌黑曲霉（Aspergillus niger）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）的植酸酶PHYA由于具有較好的耐熱性（最適溫度為55℃左右），并且在很寬的pH范圍內(nèi)（pH 2.0～6.0）仍能表現(xiàn)出較高的催化活性，被認(rèn)為是目前最具應(yīng)用前景的飼用植酸酶之一[11]。但是植酸酶在飼料加工過(guò)程中所經(jīng)受的短暫的60～90℃制粒過(guò)程，會(huì)導(dǎo)致植酸酶變性，因此，利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建基因工程菌，進(jìn)一步提高產(chǎn)酶水平及酶的穩(wěn)定性成為當(dāng)前全世界的研究熱點(diǎn)之一。HESAMPOUR等[12]報(bào)道了定點(diǎn)突變phyA后的T295S、Q296R和V43N的氫鍵總數(shù)比野生型有所增加，并且在80℃處理10 min后，其酶活殘留比野生型高出24%；王敏[13]研究發(fā)現(xiàn)，二硫鍵Cys196-Cys446的缺失能增大植酸酶對(duì)底物的親和力及催化效率，還可以提高酶分子的耐熱性；YANG等[14]通過(guò)對(duì)黑曲霉的脂肪酶進(jìn)行密碼子優(yōu)化后在畢赤酵母中異源表達(dá)，產(chǎn)生的酶活和蛋白表達(dá)水平分別提高了11.6倍和5.3倍。

展示酶技術(shù)是將外源靶蛋白基因與特定的錨定基因融合后導(dǎo)入酵母細(xì)胞，利用酵母細(xì)胞將該蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到膜表面，使靶蛋白固定化表達(dá)在酵母細(xì)胞表面的技術(shù)。同分泌型表達(dá)的酶相比，展示酶不僅省去了酶的分離純化過(guò)程，有助于降低酶制劑的生產(chǎn)成本，而且可以提高酶的催化活性和熱穩(wěn)定性[15-16]。在上述背景下，本研究對(duì)黑曲霉植酸酶的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，替換為畢赤酵母偏愛(ài)密碼子，并且定點(diǎn)突變了T295S、Q296R和V43N以引入氫鍵，還對(duì)二硫鍵Cys196-Cys446進(jìn)行缺失突變，并將改造的植酸酶展示在巴斯德畢赤酵母（Komagataella phaffii）GS115細(xì)胞表面。本研究借助定點(diǎn)突變和酵母表面展示的手段，旨在獲得具有良好的催化活性、熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性的展示植酸酶，為解決制粒過(guò)程中植酸酶變性失活問(wèn)題提供一定的參考，以使植酸酶廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料和食品加工行業(yè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存，巴斯德畢赤酵母（Komagataella phaffii）GS115由集美大學(xué)肖安風(fēng)教授饋贈(zèng)，DMT化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。pMD19T-phyA（攜帶有植酸酶全長(zhǎng)基因）為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαC購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.1.2 分子生物學(xué)與生化試劑

DpnⅠ（美國(guó)NEB公司），PmeⅠ（美國(guó)Thermo Fisher公司），100 mg/mL Zeocin（美國(guó)Invitrogen公司），酵母基因組提取試劑盒（美國(guó)Omega公司），EcoRⅠ、XbaⅠ和PrimeSTARTMHS DNA聚合酶（大連Takara公司），無(wú)縫克隆試劑盒和細(xì)胞免疫熒光試劑（北京全式金生物技術(shù)有限公司），膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒（上海康潤(rùn)生物科技有限公司）。其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

低鹽LB培養(yǎng)基（low salt Luria-Bertani medium,LLB）、酵母蛋白胨葡萄糖山梨醇培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose sorbitol medium,YPDS）、緩沖甘油復(fù)合培養(yǎng)基（buffered glycerol-complex medium,BMGY）和緩沖甲醇復(fù)合培養(yǎng)基（buffered methanol-complex medium,BMMY）均按Invitrogen公司操作手冊(cè)推薦方法配制。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中公布的錨定基因fs序列（登錄號(hào) BK006935.2），設(shè)計(jì)引物 fs-FP和 fs-RP；以pMD19T-phyA為定點(diǎn)突變的對(duì)象，借助于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）引入突變位點(diǎn)。無(wú)縫克隆所需引物和黑曲霉植酸酶基因定點(diǎn)突變引物序列如表1所示。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物及其序列Table 1 Primer sequences used for PCR amplification

1.2.2 植酸酶基因的定點(diǎn)突變及其他相關(guān)片段的擴(kuò)增

以pMD19T-phyA為模板，以表1中所列引物1～16（共8對(duì)）為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得植酸酶基因的定點(diǎn)突變。反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性20 s，（tm－5）℃退火30 s，72 ℃延伸250 s，共17個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用甲基化酶DpnⅠ處理，消化待突變的質(zhì)粒模板，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，以獲得新的轉(zhuǎn)化子（其中：菌株A1為野生型；菌株A2包含的突變位點(diǎn)為R62、H63、G64、R66、P68、R146、H342和D343；菌株A3包含的突變位點(diǎn)為R62、H63、G64、R66、P68、R146、H342、D343、S295、R296和N43；菌株A4包含的突變位點(diǎn)為S295、R296和N43；菌株A5包含的突變位點(diǎn)為R62、H63、G64、R66、P68、R146、H342、D343和S446；菌株A6 包含的突變位點(diǎn)為 R62、H63、G64、R66、P68、R146、H342、D343、S295、R296、N43 和 S446；菌株A7包含的突變位點(diǎn)為S446；菌株A8包含的突變位點(diǎn)為S295、R296、N43和S446）。

以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisia）4717基因組為模板，以編號(hào)17和18序列為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得fs，再以此PCR產(chǎn)物為模板，以編號(hào)22和23序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到fs無(wú)縫克??；以pMD19T-phyA（或含有突變位點(diǎn)的質(zhì)粒）為模板，以編號(hào)19、20和21序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到phyA，再以此PCR產(chǎn)物為模板，以編號(hào)24、25和26序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到phyA無(wú)縫克隆。反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性20 s，（tm－5）℃退火30 s，72℃延伸4 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.3 表達(dá)載體pPICZαC-FS/phyA的構(gòu)建與鑒定

采用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ對(duì)載體pPICZαC進(jìn)行雙酶切和膠回收，然后進(jìn)行無(wú)縫克隆[反應(yīng)體系為：5 μL 2×裝配混合物（assembly mix），2.5 μL 線性化載體pPICZαC，1.4 μL fs無(wú)縫克隆，0.5 μL phyA 無(wú)縫克隆和0.6 μL ddH2O]，轉(zhuǎn)化DMT化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Zeocin（25 μg/mL）的LLB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑取合適的單菌落于37℃液體培養(yǎng)，以編號(hào)22、25和26序列為引物進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，若為陽(yáng)性，則提取質(zhì)粒送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 展示植酸酶的轉(zhuǎn)化表達(dá)

用限制性內(nèi)切酶PmeⅠ對(duì)表達(dá)載體pPICZαCFS/phyA進(jìn)行線性化處理，采用氯化鋰轉(zhuǎn)化K.phaffii GS115感受態(tài)細(xì)胞。取150 μL轉(zhuǎn)化液涂布于YPDS（含100 μg/mL Zeocin）平板，30 ℃靜置培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)，提取轉(zhuǎn)化子的基因組作為模板，以目的片段phyA對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，鑒定無(wú)誤后將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于BMGY培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)至D（600 nm）=2.0，離心收集菌體，再轉(zhuǎn)接于BMMY培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)，每隔24 h取樣并補(bǔ)充新鮮甲醇至1%進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)周期為120 h。

1.2.5 植酸酶表面展示的鑒定

誘導(dǎo)結(jié)束后，參考KOBORI等[17]的方法進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色。加入50 μL一抗抗八肽DYKDDDDK的小鼠單克隆抗體（稀釋比例為1∶200，用1%BSA稀釋），4℃過(guò)夜，次日用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS）漂洗后，再加入50 μL熒光二抗山羊抗小鼠的AF488結(jié)合的IgG（H+L）（稀釋比例為1∶200，用1%BSA稀釋），室溫下孵育1 h后進(jìn)行漂洗，再用0.01 mol/L PBS進(jìn)行重懸，使用Olympus BX51熒光顯微鏡觀察拍照。

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，然后用0.01 mol/L PBS將菌液稀釋至單細(xì)胞菌懸液濃度約為106mL－1，采用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson公司），選擇488 nm氬離子藍(lán)色激光器進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 展示植酸酶活性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[18]的方法對(duì)所取菌液進(jìn)行各個(gè)展示植酸酶活性的測(cè)定，并繪制酶活隨時(shí)間的變化曲線。

1.2.7 展示植酸酶最適溫度及熱穩(wěn)定性的測(cè)定

在pH 5.5的CH3COONa/CH3COOH緩沖液體系中，測(cè)定各展示酶分別在30、40、50、60、70、80、90℃下的植酸酶活性，以確定酶促反應(yīng)的最適溫度。在測(cè)定展示酶的熱穩(wěn)定性時(shí)，各展示酶先在70～90℃的條件下預(yù)孵育5～120 min，然后再測(cè)定酶活。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。以溫度為橫坐標(biāo)，展示酶的相對(duì)活性為縱坐標(biāo)，繪制酶活變化曲線。

1.2.8 展示植酸酶最適pH及酸堿耐受性的測(cè)定

配置不同pH、濃度為100 mmol/L的緩沖液：pH分別為1.6、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0的Gly-HCl緩沖液；pH 分 別 為 4.5、5.0、5.5、6.0 的 CH3COONa/CH3COOH緩沖液；pH分別為7.0、8.0的Tris-HCl緩沖液。用上述緩沖液分別配置5.0 mmol/L的植酸鈉溶液，在37℃條件下測(cè)定各展示酶活性，以確定酶促反應(yīng)的最適pH。在測(cè)定展示酶的酸堿耐受性時(shí)，各展示酶先在pH 1.0～6.0、25℃條件下預(yù)孵育6 h，然后再測(cè)定酶活。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)。以pH為橫坐標(biāo)，展示酶的相對(duì)活性為縱坐標(biāo)，繪制酶活變化曲線。

2 結(jié)果與分析

圖2 表達(dá)載體ZαC-phyA示意圖Fig.2 Schematic of expression vector ZαC-phyA

2.1 突變位點(diǎn)的引入

因突變位點(diǎn)較多，以突變位點(diǎn)R62H63為例解釋突變位點(diǎn)的引入過(guò)程（圖1）。圖1A為以編號(hào)1和2序列為引物所對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物（含有突變位點(diǎn)R62H63的質(zhì)粒），大小約為4.1 kb，與預(yù)期大小相符。圖1B為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌液提取的質(zhì)粒條帶。

圖1 PCR介導(dǎo)的R62H63瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 PCR-mediated agarose gel electrophoresis for R62H63

將提取的質(zhì)粒送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序，篩選成功的突變子。以包含所有突變位點(diǎn)的突變株A6為例，其各突變位點(diǎn)的位置（下劃線處標(biāo)注）見(jiàn)附圖1（http://www.zjujournals.com/agr/CN/article/showSupportInfo.do?id=10540）。

2.2 表達(dá)載體pPICZαC-FS/phyA的構(gòu)建

2.2.1 表達(dá)載體pPICZαC-FS/phyA示意圖

表達(dá)載體pPICZαC-FS/phyA是在空載體pPICZαC的酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和XbaⅠ之間插入錨定片段FS和攜帶標(biāo)簽Flag的目的片段phyA。通過(guò)DNAMAN 8.0軟件繪制的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。

2.2.2 fs無(wú)縫克隆和phyA無(wú)縫克隆的擴(kuò)增

圖3A～B分別為fs無(wú)縫克隆和phyA無(wú)縫克隆（以A1為例）的擴(kuò)增條帶，片段大小均符合預(yù)期要求（fs為3.3 kb，phyA約為1.3 kb）。

圖3 fs無(wú)縫克隆(A)和phyA無(wú)縫克隆(B)的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis for fs-seamless(A)and phyA-seamless(B)

2.2.3 載體pPICZαC雙酶切線性化

載體pPICZαC經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切3 h后的瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖4。泳道1為線性化后的載體，片段大小約為3.6 kb，與實(shí)際相符。

2.2.4 表達(dá)載體pPICZαC-FS/phyA的測(cè)序鑒定

圖4 載體pPICZαC雙酶切線性化瓊脂糖凝膠電泳Fig.4 Agarose gel electrophoresis for pPICZαC digested and linearized by EcoRⅠ and XbaⅠ

以phyA對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。以pPICZαC-FS/phyA1為例，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)附圖2（http://www.zjujournals.com/agr/CN/article/showSupportInfo.do?id=10540）：下劃線部分為fs的堿基序列，其余部分為phyA1的堿基序列，插入片段總長(zhǎng)為4 668 bp。

2.3 K.phaffii GS115的氯化鋰轉(zhuǎn)化

2.3.1 表達(dá)載體pPICZαC-FS/phyA線性化

以表達(dá)載體pPICZαC-FS/phyA1為例，圖5中泳道1為經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶PmeⅠ線性化處理的載體，泳道2為未經(jīng)PmeⅠ線性化處理的載體。由于不經(jīng)過(guò)線性化處理的載體呈現(xiàn)超螺旋結(jié)構(gòu)，故其泳動(dòng)的速度較線性化處理的載體快，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)載體pPICZαC-FS/phyA1線性化徹底。

2.3.2 PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子

提取相應(yīng)的轉(zhuǎn)化子基因組DNA作為模板，以目的片段phyA對(duì)應(yīng)的引物為實(shí)驗(yàn)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖6所示。各泳道獲得的基因片段大小均符合預(yù)期目標(biāo)。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，選擇重組子 ZαC、A11、A25、A31、A44、A51、A61、A71、A84為后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)酵菌株，于20%甘油管保藏。

2.4 免疫熒光檢測(cè)

圖5 載體pPICZαC-FS/phyA1線性化瓊脂糖凝膠電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis for pPICZαC-FS/phyA1 linearization

圖6 PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Detection result of screening positive transformants via PCR

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果（圖7）表明，經(jīng)過(guò)96 h的誘導(dǎo)，除對(duì)照Z(yǔ)αC以外，重組酵母菌株A11、A25、A31、A44、A51、A61、A71、A84均可以檢測(cè)到熒光。根據(jù)該結(jié)果，可以推論出目的基因phyA已經(jīng)在K.phaffii GS115細(xì)胞表面成功展示，達(dá)到表面展示的目的。

圖7 熒光顯微鏡觀察結(jié)果Fig.7 Observation result by fluorescence microscope

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

每一輪獲取1×105個(gè)事件，通過(guò)BD CellQuest Pro軟件（美國(guó)Becton Dickinson公司）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，生成檢測(cè)結(jié)果（圖8），圖中不同顏色的曲線分別對(duì)應(yīng)不同的重組菌株。當(dāng)FL1-H為102時(shí)，對(duì)照Z(yǔ)αC（A3-1.011）所對(duì)應(yīng)的曲線（綠色）比其他曲線低，A51對(duì)應(yīng)的曲線（黃色）是所有轉(zhuǎn)化子中最高的，這一結(jié)果與熒光顯微鏡觀察結(jié)果一致，再次證實(shí)植酸酶在K.phaffii GS115細(xì)胞表面成功展示。

圖8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Fig.8 Flow cytometry result of yeast cells

2.6 展示植酸酶活性的誘導(dǎo)曲線

各重組菌株在BMMY培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，每隔24 h添加1%的甲醇連續(xù)誘導(dǎo)120 h，并及時(shí)取樣測(cè)定其酶活。由圖9可以看出，各重組菌株的酶活隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延伸而增強(qiáng)，96 h后達(dá)到峰值，隨后呈下滑趨勢(shì)，該結(jié)果與LI等[18]較為一致。96 h后重組菌株A31、A61、A84的酶活相較于其他重組菌株較為突出，均超過(guò)7 000 U/g，其中A61的酶活最大（7 924 U/g），其次為A84（7 649 U/g），再次為A31（7 360 U/g）。故選取重組菌株A31、A61、A84作為后續(xù)研究對(duì)象。

圖9 展示植酸酶活性的誘導(dǎo)曲線Fig.9 Curve of phytase activity after induction

2.7 溫度對(duì)展示植酸酶活性的影響

由圖10A可知，不同溫度對(duì)3株重組菌株酶活的影響不同。菌株A31和A84在50℃時(shí)的酶活達(dá)到峰值，而菌株A61的酶活極大值出現(xiàn)在60℃，當(dāng)超過(guò)最適溫度時(shí)，所有菌株的酶活均呈下降趨勢(shì)，并于90℃時(shí)聚于一點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在37℃時(shí)3株重組菌株的酶活均占最高酶活的40%左右。由于溫血?jiǎng)游锏捏w溫大多在37℃，因此，在該溫度下的酶活性具有重要意義。

植酸酶的熱穩(wěn)定性一直是制約其推廣應(yīng)用的關(guān)鍵因素，本研究將重組菌株A31、A61、A84分別于70、80、90 ℃水浴處理15、60、90、120 min后測(cè)定其殘余酶活。結(jié)果（圖10B～D）發(fā)現(xiàn)，菌株的植酸酶活性與高溫呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。各重組菌株在70℃時(shí)，其酶活隨時(shí)間的喪失幅度均較80和90℃小。相比而言，菌株A61在90℃水浴處理90 min以內(nèi)，其酶活的下降幅度比其余菌株更為緩慢，水浴處理1 h后，酶活殘留18%，這一特性能夠符合制粒過(guò)程中（60～90℃）不影響植酸酶活的技術(shù)要求。

圖10 溫度對(duì)展示植酸酶活性的影響Fig.10 Effect of temperature on the activity of yeast cell-surface phytase

2.8 pH對(duì)展示植酸酶活性的影響

pH是影響植酸酶活性的另一個(gè)重要因子。在本研究中，重組菌株A31、A61和A84酶活最高時(shí)的pH值分別為3.0、2.5和4.0（圖11A），高峰之后，隨著pH值的不斷升高，各菌株酶活均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并于pH 8.0時(shí)趨近于一點(diǎn)。

胃腸道pH是影響動(dòng)物體消化系統(tǒng)發(fā)揮正常生理功能的重要因素之一，在動(dòng)物消化、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[19]。本研究將各重組菌株分別在pH為1.6～6.0的緩沖液中預(yù)孵育6 h，然后再測(cè)定其殘余酶活。結(jié)果（圖11B）表明，在pH 1.6～6.0的范圍內(nèi)，重組菌株A31、A61、A84的殘余酶活均保持在40%以上。菌株A31的殘余酶活在pH 2.0～4.5的范圍內(nèi)保持在80%以上；菌株A61的殘余酶活在pH 1.6～4.0的范圍內(nèi)均保持在80%以上；而菌株A84的殘余酶活則在pH 3.5～5.5的范圍內(nèi)均在80%以上。因?yàn)閯?dòng)物消化道在正常情況下為偏酸性（pH小于7.0）環(huán)境，故本研究的展示植酸酶能夠在動(dòng)物胃液中發(fā)揮有效的催化活性，可以滿足動(dòng)物飼料用酶的要求。

圖11 pH對(duì)展示植酸酶活性的影響Fig.11 Effect of pH on the activity of yeast cell-surface phytase

3 討論

植酸酶能分解植物體內(nèi)的植酸，大大提高飼料中微量礦物質(zhì)元素的營(yíng)養(yǎng)利用率。然而，當(dāng)前商品化植酸酶經(jīng)短暫的60～90℃制粒加工過(guò)程會(huì)導(dǎo)致植酸酶變性失活。為解決該問(wèn)題，一些學(xué)者從突變phyA基因位點(diǎn)、缺失Cys196-Cys446二硫鍵等技術(shù)入手進(jìn)行了一系列基因改良并構(gòu)建了相關(guān)的工程菌株。然而考慮到分泌型蛋白提取及純化的繁瑣工藝和高昂成本，本研究試圖將改造的植酸酶基因直接展示在畢赤酵母（Komagataella phaffii）GS115細(xì)胞表面，以使植酸酶能更便捷地被加以利用。

畢赤酵母具有細(xì)胞生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)、遺傳操作簡(jiǎn)單、可高密度發(fā)酵等特點(diǎn)，在工業(yè)上具有很好的應(yīng)用前景。然而，植酸酶基因phyA編碼467個(gè)氨基酸，并且N端還有19個(gè)氨基酸信號(hào)肽[20]，外源蛋白自身攜帶的介導(dǎo)蛋白分泌的信號(hào)肽有可能不被畢赤酵母所識(shí)別[21]，因此本研究在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)除去了植酸酶中的信號(hào)肽。此外，為改良植酸酶基因，本研究采取了關(guān)鍵位點(diǎn)突變和密碼子優(yōu)化、引入氫鍵、二硫鍵缺失等一系列措施，并首次實(shí)現(xiàn)將絮凝素Flo1p（FS）與黑曲霉植酸酶的N端進(jìn)行錨定，最終成功將改良的植酸酶在畢赤酵母細(xì)胞表面展示。

對(duì)獲得的重組菌株的植酸酶活性進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，重組菌株A31、A61、A84的酶活均超過(guò)7 000 U/g，且以菌株A61的酶活最大（7 924 U/g）。CHEN等[22]曾報(bào)道利用酵母的α-凝集素蛋白的C半末端作為錨定蛋白，將植酸酶展示在釀酒酵母表面，獲得的最大酶活為6.4 U/g；LI等[18]在畢赤酵母表面展示的來(lái)源于無(wú)丙二酸檸檬酸桿菌（Citrobacter amalonaticus）的植酸酶最大酶活為6 413.5 U/g。相比之下，本研究中A31、A61、A84的酶活是CHEN等[22]結(jié)果的1 000倍，比LI等[18]的結(jié)果提高了1 000 U/g左右。由此可見(jiàn)，新構(gòu)建的植酸酶展示酵母菌株有更優(yōu)越的酶活特性。

溫度對(duì)植酸酶活性有一定的影響，不同菌株對(duì)溫度的響應(yīng)也不盡相同。黃靜等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母表面展示的來(lái)源于黑曲霉的野生型植酸酶的最適反應(yīng)溫度為55℃；彭遠(yuǎn)義等[24]研究發(fā)現(xiàn)，分泌型黑曲霉N14植酸酶在畢赤酵母中異源表達(dá)后的最適反應(yīng)溫度為55℃；而楊平平等[25]利用60Co γ射線誘變黑曲霉，篩選到1株植酸酶高產(chǎn)菌株，其最適酶活溫度卻為40℃。在本研究中，菌株A31和A84在50℃時(shí)的酶活達(dá)到峰值，而菌株A61的酶活最大值則出現(xiàn)在60℃。綜上表明，對(duì)野生型植酸酶加以改造，而后進(jìn)行分泌表達(dá)或者表面展示，植酸酶最適溫度為50～60℃。

植酸酶的熱穩(wěn)定性是制約其推廣應(yīng)用的關(guān)鍵因素。黃靜等[23]在釀酒酵母表面展示的野生型植酸酶在70℃處理1 h后，酶活為5%，在80℃處理1 h后幾乎完全失活；LI等[18]在畢赤酵母表面獲得的展示植酸酶在70℃處理1 h后，其酶活為62%，在80℃處理1 h后幾乎完全失活。本研究中除了重組菌株A31在80℃處理1 h后幾乎完全失活外，菌株A61和A84在80℃處理1 h后，其酶活分別還可以保留28%和30%，其中菌株A61在90℃水浴處理1 h后仍有18%的酶活。結(jié)合突變類型推測(cè)，菌株A61和A84中二硫鍵Cys196-Cys446的缺失可能提高了植酸酶的耐熱能力。

pH通過(guò)影響植酸酶的活性進(jìn)而影響植酸酶發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)效力。黃靜等[23]在釀酒酵母表面展示的植酸酶的最適pH為5.0；楊平平等[24]利用60Co γ射線誘變篩選的植酸酶最適pH為5.6；馮慧玲等[26]引入易錯(cuò)PCR技術(shù)獲得的植酸酶最適pH為4.6。相比之下，本研究獲得的各重組菌株的反應(yīng)最適pH均比上述報(bào)道中的結(jié)果偏低，這可能是因?yàn)橹菜崦敢霘滏I和缺失二硫鍵后會(huì)造成酶促反應(yīng)的最適pH發(fā)生改變。值得一提的是，3個(gè)重組菌株在動(dòng)物正常的胃液pH范圍內(nèi)均能保持較高的酶活（80%以上），其中菌株A61在pH 1.6～6.0的范圍內(nèi)，其殘余酶活保持在40%以上，故能夠滿足動(dòng)物飼料用酶的需求。

密碼子優(yōu)化作為提高酶的異源表達(dá)水平的有效手段，畢赤酵母和黑曲霉在密碼子的選擇上明顯不同。將獲得的重組菌株A25關(guān)鍵位點(diǎn)的密碼子替換為畢赤酵母所偏好的，發(fā)現(xiàn)其催化活性較野生型菌株A11有所降低，與YANG等[14]的結(jié)果存在差別，這可能與未對(duì)植酸酶基因的開(kāi)放閱讀框（open reading frame,ORF）進(jìn)行全面優(yōu)化有關(guān)。

借助于展示酶技術(shù)，展示植酸酶A11的酶活接近3 000 U/g，明顯高出野生型黑曲霉A3214所產(chǎn)植酸酶活性（720 U/g）[27]。通過(guò)引入氫鍵，重組菌株A44的酶活相比野生型A11提高了2 000 U/g，該發(fā)現(xiàn)同HESAMPOUR等[12]的研究結(jié)果一致。類似的，二硫鍵Cys196-Cys446的缺失增強(qiáng)了重組菌株A71的活性，與王敏[13]的研究結(jié)果相符。

重組菌株A61在催化活性、酸堿耐受性和熱穩(wěn)定性方面均表現(xiàn)最佳，同時(shí)引入氫鍵和缺失二硫鍵，能夠很好地提高展示植酸酶的催化性能，增強(qiáng)其對(duì)酸堿和高溫的耐受性。

綜上所述，對(duì)植酸酶進(jìn)行基因改造并展示于畢赤酵母細(xì)胞表面，新獲得的植酸酶展示型菌株具有較高的酶活性以及熱和酸堿耐受性，能夠滿足制粒過(guò)程（60～90℃）的溫度要求及動(dòng)物腸道內(nèi)環(huán)境的pH催化活性要求，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本文對(duì)來(lái)源于黑曲霉的植酸酶進(jìn)行密碼子優(yōu)化、氫鍵引入以及二硫鍵Cys196-Cys446的缺失突變，改變其熱穩(wěn)定性和催化活性。將改造的植酸酶展示于畢赤酵母的細(xì)胞表面，相比于分泌型植酸酶省去了酶的分離、純化等步驟，降低了生產(chǎn)成本。獲得的展示酶菌株A61不僅可以規(guī)避制粒過(guò)程中酶活的大量損失，而且還可以在動(dòng)物胃腸道中發(fā)揮較好的催化作用。

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