超臨界CO2條件下二次酶解米糠的研究

王玉琦 王東華 李婷婷 王 旭 于殿宇

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030)(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院2，哈爾濱 150030)

米糠是稻米加工的副產(chǎn)物，它的利用價(jià)值非常高，含有的必需氨基酸平衡合理，生物效價(jià)高[1]。研究表明，米糠中富含多種營(yíng)養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì)，其中米糠多糖能降血壓、降血糖和抗腫瘤；米糠中植酸鈣有促進(jìn)人體新陳代謝和骨骼組織生長(zhǎng)發(fā)育的功能；米糠蛋白是目前世界公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)植物性蛋白，米糠中含有10%～20%的米糠蛋白[2]。米糠蛋白不含抗?fàn)I養(yǎng)因子，對(duì)人體具有低過(guò)敏性、抗癌活性和保健的功能[3-8]，米糠蛋白功效比為2.0～2.5，與牛奶中功效比為2.5的酪蛋白相近，消化率達(dá)90%以上，米糠蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可與動(dòng)物蛋白相媲美[9-10]。目前，從米糠中提取米糠油的研究比較深入，由于研究技術(shù)的限制，造成我國(guó)米糠資源的利用率仍然偏低，經(jīng)脫脂后的米糠中仍有多種水溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)沒(méi)被提取出來(lái)，如可溶性的米糠蛋白、米糠多糖、碳水化合物、植酸、維生素、礦物質(zhì)等。

米糠中的植酸鹽與蛋白質(zhì)和糖類(lèi)等物質(zhì)易結(jié)合形成難溶的復(fù)合物，同時(shí)米糠蛋白分子間又含較多二硫鍵，導(dǎo)致米糠蛋白的溶解性降低，從而使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)利用率下降[11-12]。已有研究用酶法改善米糠的溶解性，其反應(yīng)條件溫和，不產(chǎn)生有害物質(zhì)，且米糠粉得率較高[13-14]。白莉等[15]分別采用α-淀粉酶、纖維素酶和果膠酶對(duì)米糠提取蛋白，得到蛋白質(zhì)提取率分別為37.85%、43.93%、30.73%，其中纖維素酶的提取效果最佳。王雪飛等[16]比較了多種酶酶解回收蛋白質(zhì)，回收率達(dá)62.04%，但由于是單一酶作用，蛋白質(zhì)回收率低；李坤等[17]采用淀粉酶、纖維素酶和植酸酶復(fù)合酶法提取米糠蛋白，米糠蛋白提取率為80.06%。但在超臨界CO2狀態(tài)下利用植酸酶、淀粉酶和堿性蛋白酶的復(fù)合酶法生產(chǎn)米糠粉還鮮見(jiàn)報(bào)道。反應(yīng)物在超臨界流體中的溶解度增大，使酶與底物充分接觸，反應(yīng)時(shí)間短、效率高，且超臨界CO2具有無(wú)毒無(wú)味、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、來(lái)源廣泛、不會(huì)對(duì)熱敏性食品及其風(fēng)味產(chǎn)生影響等優(yōu)點(diǎn)[18-20]。

本實(shí)驗(yàn)利用植酸酶將難溶性的植酸鹽絡(luò)合物酶解后，把蛋白質(zhì)釋放出來(lái)，而不影響蛋白整體結(jié)構(gòu)，解除它們對(duì)蛋白質(zhì)和淀粉的干擾[21-22]；再選擇一定比例的堿性蛋白酶和α-淀粉酶消除淀粉與蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用，降低淀粉分子的分支化度，增加直鏈淀粉的比例，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行降解使其轉(zhuǎn)化為容易消化吸收的多肽，有利于蛋白質(zhì)和糖類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)成分的提取[23]，提高米糠蛋白的溶解性。

本研究主要考察超臨界CO2流體對(duì)酶的酶解效率影響，以及將淀粉酶解為可溶解的多糖和單糖的效率以及蛋白質(zhì)的提取效率，考察制得米糠粉的成分和得率，確定二次酶解對(duì)米糠粉特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂米糠：黑龍江省北大荒米業(yè)集團(tuán)有限公司；植酸酶(10 000 U/g，食品級(jí))、α-淀粉酶(10 000 U/g，食品級(jí))、堿性蛋白酶(60 000 U/g，食品級(jí))：上海萬(wàn)安科技有限責(zé)任公司；3,5-二硝基水楊酸、乙醇、鹽酸和燒堿等均為分析純。

RE-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京瑞成偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司；JMS-50膠體磨：廊坊利杰食品有限公司；150 mL超高壓反應(yīng)釜：實(shí)驗(yàn)室自制；LD4-2A低速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；B-290噴霧干燥機(jī)：瑞士BUCHI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脫脂米糠酶解的過(guò)程

在常壓狀態(tài)下，稱(chēng)取低溫脫脂米糠10 g，加入80 mL體積的水分，浸泡處理后經(jīng)膠體磨磨漿，得到米糠漿液，添加到150 mL超高壓反應(yīng)釜內(nèi)，參照王雪飛[24]的實(shí)驗(yàn)條件并略有改動(dòng)，植酸酶的添加量為1.0%，pH為5.5，酶解溫度50 ℃，將其加入反應(yīng)釜內(nèi)，酶解一定時(shí)間后，終止反應(yīng)，滅酶鈍化后，將底物經(jīng)離心分離、蒸發(fā)濃縮和噴霧干燥后稱(chēng)重，得到一次酶解產(chǎn)物。同樣方法，將底物添加到150 mL超高壓反應(yīng)釜內(nèi)，充入8 MPa CO2，使酶解反應(yīng)在超臨界CO2狀態(tài)下進(jìn)行。

得到一次酶解產(chǎn)物后，在常壓狀態(tài)下，調(diào)節(jié)超高壓反應(yīng)釜內(nèi)溫度和pH以適應(yīng)堿性蛋白酶與α-淀粉酶的反應(yīng)條件，再加入適量堿性蛋白酶與α-淀粉酶，酶解一定時(shí)間后，終止反應(yīng)，得到的產(chǎn)物經(jīng)滅酶鈍化處理后，得到二次酶解產(chǎn)物。將底物冷卻至室溫，在3 000 r/min條件下離心分離5 min，得到濾渣和濾液。將濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，通過(guò)真空噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度185 ℃，出風(fēng)溫度90 ℃，離心噴霧轉(zhuǎn)速2 000 r/min，得到米糠粉并稱(chēng)重。同樣方法，得到一次酶解產(chǎn)物后，將酶添加到150 mL超高壓反應(yīng)釜內(nèi)，充入8 MPa CO2，調(diào)節(jié)超高壓反應(yīng)釜內(nèi)溫度和pH，使酶解反應(yīng)在超臨界CO2狀態(tài)下進(jìn)行，滅酶鈍化后得到二次酶解產(chǎn)物，再經(jīng)離心分離和噴霧干燥后，得到米糠粉并稱(chēng)重。

1.2.2 產(chǎn)品得率的測(cè)定

米糠粉是脫脂米糠經(jīng)過(guò)復(fù)合酶水解法等處理后得到的富含多種營(yíng)養(yǎng)元素的固態(tài)粉末，根據(jù)米糠粉得率來(lái)反映脫脂米糠酶解的效果：

得到二次酶解產(chǎn)物后，加上一次酶解產(chǎn)物的質(zhì)量比上脫脂米糠的質(zhì)量為二次酶解后的得率。

1.3 原料組分測(cè)定

水分含量：GB/T 5497—1985《糧食、油料檢驗(yàn) 水分測(cè)定方法》；灰分：GB/T 5505—2008《糧油檢驗(yàn) 灰分測(cè)定法》；粗脂肪含量：GB/T5512—2008《糧食、油料檢驗(yàn) 粗脂肪測(cè)定法》；淀粉含量：GB/T 5009.9—2003《食品中淀粉的測(cè)定方法》；膳食纖維含量：GB/T 5009.88—2008《食品中膳食纖維的測(cè)定》；還原糖含量：GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測(cè)定方法》；蛋白質(zhì)含量、氮溶指數(shù)(NSI)：GB/T 5009.5—1985《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；可溶性糖含量(以蔗糖計(jì))的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[25]。

1.4 速溶性分析

參照劉曉毅[26]的方法測(cè)定米糠粉的速溶性，用45 g溫度為80 ℃的蒸餾水，溶解5 g酶解后脫脂米糠粉，啟動(dòng)攪拌器低速攪拌，記錄粉末完全溶解的時(shí)間為t，根據(jù)QB/T 4067《食品工業(yè)用速溶茶行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》，全部溶解的時(shí)間在5 s內(nèi)即為速溶。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次，利用正交設(shè)計(jì)助手對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并做方差分析，用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 一次酶解脫脂米糠的效果

在常壓下酶解時(shí)間為70 min時(shí)，米糠粉得率最高為42.3%，在超臨界酶解脫脂米糠，當(dāng)酶解時(shí)間為60 min時(shí)，米糠粉得率最高為48.2%，可以看出在超臨界CO2條件下酶解脫脂米糠后，因其在超臨界流體中的溶解度增大，酶與底物充分接觸，使反應(yīng)時(shí)間縮短、酶解效率高。如圖1所示，超臨界CO2狀態(tài)下米糠粉得率較常規(guī)酶解高出14.0%左右，酶解時(shí)間縮短了10 min。

圖1 酶解時(shí)間和質(zhì)量比對(duì)米糠粉得率的影響

2.2 堿性蛋白酶與α-淀粉酶最佳配比的選擇

在1.2.1所述條件下進(jìn)行，堿性蛋白酶與α-淀粉酶的酶添加量4.0%，酶解時(shí)間60 min，pH為8.0，酶解溫度55 ℃時(shí)，按照不同的比例進(jìn)行酶解，結(jié)果如圖1所示。最終確定堿性蛋白酶與α-淀粉酶質(zhì)量比為1:1時(shí)，米糠粉得率最高。沒(méi)有選擇在常壓的條件下進(jìn)行，由于在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)超臨界CO2的條件下只影響酶的酶解效率和米糠粉的得率，不影響其酶的比例，故此常壓條件下實(shí)驗(yàn)并未體現(xiàn)。

2.3 二次酶解脫脂米糠的效果

2.3.1 酶解時(shí)間對(duì)米糠粉得率的影響

調(diào)節(jié)pH 8.0，酶添加量4.0%，溫度55 ℃，在磁力攪拌條件下分別進(jìn)行超臨界和常壓酶解反應(yīng)，考察堿性蛋白酶和α-淀粉酶酶解時(shí)間對(duì)米糠粉得率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，脫脂米糠在超臨界CO2體系酶解反應(yīng)中，在開(kāi)始的一段時(shí)間里，隨著酶解時(shí)間的增加，米糠粉得率逐漸提高，這是由于此時(shí)底物濃度較高，酶解時(shí)間較短，反應(yīng)還未飽和。酶解時(shí)間為60 min時(shí)，米糠粉得率達(dá)到最高，之后趨于穩(wěn)定，這是由于反應(yīng)趨于飽和狀態(tài)，隨著產(chǎn)物濃度的增加，對(duì)底物產(chǎn)生了抑制作用，且酶的活性逐漸降低，因此米糠粉得率幾乎不再增加，所以選擇最適酶解時(shí)間為60 min，而常規(guī)酶法酶解最適時(shí)間70 min。原因可能是在超臨界CO2狀態(tài)下激發(fā)了酶的活性中心，同時(shí)進(jìn)行二次酶解新鮮米糠蛋白，使酶在各自的反應(yīng)體系內(nèi)更好地發(fā)揮了效率，使酶解的時(shí)間縮短，所以在超臨界CO2體系下生產(chǎn)米糠粉的酶解反應(yīng)時(shí)間相比于常規(guī)酶法大大縮短了，提高了酶解效率的同時(shí)提高了米糠粉得率。

2.3.2 酶添加量對(duì)米糠粉得率的影響

按照1.2.1方法進(jìn)行，調(diào)節(jié)pH 8.0，溫度55 ℃，加入不同量的酶，在磁力攪拌條件下分別進(jìn)行超臨界和常壓酶解反應(yīng)，酶解時(shí)間為60 min，考察酶添加量對(duì)米糠粉得率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶解溫度、pH及酶添加量對(duì)米糠粉得率的影響

由圖2可知，開(kāi)始時(shí)隨著酶添加量的增加，米糠粉得率逐漸增加，當(dāng)酶添加量超過(guò)4.0%時(shí)，酶解反應(yīng)中米糠粉得率的增加趨于平緩。是由于隨著酶添加量的增加，酶分子與底物結(jié)合位點(diǎn)增多，反應(yīng)速度加快，當(dāng)酶量趨于飽和時(shí)，繼續(xù)增加對(duì)米糠粉得率影響不大，結(jié)合成本考慮，選擇最適添加量為4.0%。而且從圖2中可以看出超臨界CO2條件下米糠粉得率高于常規(guī)酶法酶解米糠粉的得率。

2.3.3 酶解液pH對(duì)米糠粉得率的影響

在溫度55 ℃，酶添加量4.0%，pH不同的情況下，在磁力攪拌條件下分別進(jìn)行超臨界和常壓酶解反應(yīng)，酶解時(shí)間為60 min，分別考察2個(gè)酶解反應(yīng)中pH對(duì)米糠粉得率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，米糠粉得率隨pH的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)酶解pH為8.0時(shí)，米糠粉得率最高。這是由于pH一般影響酶活性部位可影響基團(tuán)、復(fù)合物及底物的離解，且酶在一定的pH范圍內(nèi)才有活性，超過(guò)一定的pH后，酶的空間結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，以致使酶失活。只有在最適pH條件下活性最高，從而將底物最大程度的轉(zhuǎn)變?yōu)槊附猱a(chǎn)物，米糠粉得率最高，所以選擇酶解最適pH為8.0。且在超臨界CO2條件下米糠粉得率較高。

2.3.4 酶解溫度對(duì)米糠粉得率的影響

調(diào)節(jié)pH 8.0，酶添加量4.0%，在不同溫度條件下，在磁力攪拌條件下分別進(jìn)行超臨界和常壓酶解反應(yīng)，酶解時(shí)間60 min，考察酶解溫度對(duì)米糠粉得率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，米糠粉得率隨著溫度的升高而逐漸增加，當(dāng)酶解溫度55 ℃，米糠粉得率達(dá)到最高，隨后又逐漸下降。原因是在未達(dá)到最適溫度之前，溫度升高，酶分子與底物分子之間有效碰撞頻繁，致使酶分子與底物之間的結(jié)合速度加快，促進(jìn)酶解反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)溫度達(dá)到了酶的最適溫度時(shí)，最利于酶解反應(yīng)；超過(guò)了酶系的最適溫度，會(huì)使得維持酶自身結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵解體，酶的活性受到抑制甚至失活。所以選擇在超臨界CO2條件下酶解的最適溫度為55 ℃。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，已經(jīng)得出在超臨界CO2條件下米糠酶解時(shí)間短，酶解效率高，米糠粉得率高，所以在此只做超臨界CO2條件下以酶解時(shí)間、酶添加量、pH、酶解溫度作為考察因子，以米糠粉得率作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，采用L16(45)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)。

由方差結(jié)果可知，影響米糠粉得率的4個(gè)因素的主次順序?yàn)椋好柑砑恿?酶解溫度>pH>酶解時(shí)間，酶解溫度和酶添加量對(duì)速溶米糠粉得率有顯著影響。最佳組合為A2B2C3D2，即酶解最佳工藝參數(shù)為酶解時(shí)間60 min，酶添加量4.0%，pH為8.0，酶解溫度55 ℃，在此條件下米糠粉得率為79.0%，比常規(guī)酶法生產(chǎn)米糠粉得率約提高了14.0%。

2.5 原料及米糠粉組分分析

原料及米糠粉組分分析結(jié)果如表3所示，所得米糠粉中主要營(yíng)養(yǎng)成分為60.54%的可溶性總糖和15.28%的蛋白質(zhì)，脫脂米糠經(jīng)二次酶解反應(yīng)后有84.23%的蛋白質(zhì)被提取出來(lái)。經(jīng)超臨界CO2條件下復(fù)合酶解的米糠粉中NSI為93.28%，比原料脫脂米糠的NSI提高了51.53%。在80 ℃條件下，脫脂米糠粉僅有極少部分可以溶解，而經(jīng)過(guò)酶解處理后的米糠粉在4.26 s內(nèi)完全溶解，達(dá)到了速溶的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步證明米糠粉的溶解性得到了明顯改善[27]。米糠經(jīng)復(fù)合酶解后，大分子物質(zhì)被降解成小分子物質(zhì)，有利于其在水中分散，其可溶性糖和可溶性多肽氨基酸等的含量得以增加，易為人體消化吸收[28]，使得其溶解性增加，從而也改善了粉體的沖調(diào)性。

表3 原料及米糠粉組成成分及相關(guān)指標(biāo)分析

3 結(jié)論

以低溫脫脂米糠為原料，先用植酸酶酶解低溫脫脂米糠，將難溶性的植酸鹽絡(luò)合物酶解后，把蛋白質(zhì)釋放出來(lái)，再利用堿性蛋白酶和α-淀粉酶酶解一次酶解后的脫脂米糠，使酶能夠在各自的最佳條件下酶解底物，同時(shí)由于超臨界流體的存在激發(fā)了酶的活性中心，使蛋白質(zhì)和淀粉更容易酶解成小分子物質(zhì)，所得米糠粉中主要營(yíng)養(yǎng)成分為60.54%的可溶性總糖和15.28%的蛋白質(zhì)，酶解反應(yīng)時(shí)間較常規(guī)酶解反應(yīng)時(shí)間縮短了約10 min，酶的效率提高增加了米糠粉的得率，在酶添加量4.0%，酶解時(shí)間60 min，pH為8.0，酶解溫度55 ℃時(shí)，米糠粉得率為79.0%，脫脂米糠中84.23%的蛋白質(zhì)被提取出來(lái)，米糠粉中NSI值為93.28%，米糠粉溶解性增大，為生產(chǎn)高質(zhì)量的米糠蛋白提供借鑒，提高了米糠綜合利用的價(jià)值。

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