浙江大豆核心親本蛋白質(zhì)和異黃酮含量的分析

郭丹丹 袁鳳杰 郁曉敏

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院作物與核技術(shù)利用研究所，杭州 310021)

大豆能為人類和動物提供優(yōu)質(zhì)蛋白和油脂，且含有多種生物活性物質(zhì)，如大豆異黃酮、大豆皂苷和大豆磷脂等。大豆異黃酮是一種多酚類的混合物，是在籽粒成熟過程中積累起來的次生代謝產(chǎn)物。大豆異黃酮在預防和治療癌癥、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥和婦女更年期綜合癥中起著重要的作用[1-2]。迄今為止，已在大豆籽粒及豆制品中分離出12種大豆異黃酮異構(gòu)體，包括黃豆苷類、染料木苷類和黃豆黃素苷類三大類，以游離型、葡萄糖苷型、乙?；咸烟擒招秃捅；咸烟擒招?種形式存在[3-4]。

不同大豆品種的蛋白質(zhì)和異黃酮含量存在顯著差異，而這種差異直接影響其生產(chǎn)的豆制品品質(zhì)。在豆制品加工市場中常以蛋白質(zhì)和異黃酮含量均高的大豆品種作為首選材料，因此同時改良蛋白質(zhì)和異黃酮含量能夠提升大豆品質(zhì)性狀，從而提高其經(jīng)濟價值。梁慧珍等[5]測定了F13代重組自交系群體(晉豆23號×灰布支)474個家系的蛋白質(zhì)和異黃酮含量，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與異黃酮含量呈顯著負相關(guān)(r=-0.342)。楊雪峰等[6]對生長在黑龍江省的150份野生大豆進行了研究，結(jié)果表明蛋白質(zhì)與異黃酮含量間同樣存在顯著負相關(guān)性(r=-0.367)。Chiari等[7]分析了IAC-100(高異黃酮和正常蛋白質(zhì)含量)和BARC-8(低異黃酮和高蛋白質(zhì)含量)雜交獲得的F2代，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)與異黃酮含量也具有負相關(guān)關(guān)系(r=-0.47)。然而，Charron等[4]分析了17個栽培大豆品種蛋白質(zhì)和異黃酮的含量，發(fā)現(xiàn)其中5個品種的蛋白質(zhì)與異黃酮含量具有顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.67～0.85)。

浙江省是我國高蛋白大豆的主產(chǎn)省份之一，而豆制品一直都是浙江人民推崇的傳統(tǒng)食品。然而，浙江省內(nèi)大豆主栽品種的異黃酮含量普遍偏低[8]。通過常規(guī)育種來改良大豆中蛋白質(zhì)和異黃酮的含量，能夠有效提高大豆產(chǎn)品的市場競爭力。因此，在大豆育種與遺傳改良中對不同大豆種質(zhì)的蛋白質(zhì)和異黃酮特性研究越來越多，但是在浙江省，這兩類物質(zhì)之間的關(guān)系卻少有研究。本研究利用在浙江省種植的196份大豆核心種質(zhì)，測定其蛋白質(zhì)和異黃酮的含量，分析了蛋白質(zhì)和異黃酮各成分以及異黃酮總含量之間的相關(guān)性，進而深入了解蛋白質(zhì)和異黃酮成分與大豆品質(zhì)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

以收集、保存的省內(nèi)外大豆種質(zhì)為基礎，利用SSR技術(shù)，杭州國家大豆改良分中心構(gòu)建了1個核心種質(zhì)庫，作為親本用于浙江及周邊地區(qū)的大豆科研與生產(chǎn)，本研究選取了196份核心親本作為研究對象，其中94份材料來自黃淮海地區(qū)，102份材料來自南方地區(qū)(表1)。所有材料于2010年夏種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學院實驗農(nóng)場，按小區(qū)(1×1.5 m)種植，成熟后收獲種子，風干，保存待分析。用近紅外分析儀測定蛋白質(zhì)含量[5]，用高效液相色譜(HPLC)法測定異黃酮含量[7-8]。

Foss Infratec 1241 Grain Analyzer近紅外分析儀：丹麥福斯公司；Agilent 1100高效液相色譜：美國安捷倫公司。

表1 參試材料基本信息表

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質(zhì)的測定

使用Foss Infratec 1241 Grain Analyzer近紅外分析儀測定蛋白質(zhì)含量(g/kg)，每份材料3次重復。

1.2.2 異黃酮的提取及測定

稱取約50 g籽粒樣品于50 ℃烘至恒重，使用手提式高速中藥粉碎機磨粉，過60目篩，保存于干燥器中備用。

稱取0.25 g大豆粉于離心管中，加入1.5 mL甲醇和0.1 mol/L鹽酸的混合液(體積比3:1)，200 r/min充分震蕩2 h，10 000 r/min離心5 min，取上清液過0.45 μm的濾膜至上樣瓶中，利用Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)分析異黃酮以及其組分的含量(mg/kg)。

色譜柱為Agilent SB-C18柱，其中流動相A為0.1%三氟乙酸水溶液，B為0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流動體系為(A%/B%)：0 min(100/0)，30 min(50/50)，35 min(100/0)；流速為1 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為37 ℃，進樣品量為5 μL。

大豆異黃酮12種組分標準樣品為黃豆苷、黃豆黃素苷、染料木苷、丙二酰黃豆苷、丙二酰黃豆黃素苷、乙酰黃豆苷、乙酰黃豆黃素苷、丙二酰染料木苷、黃豆苷元、乙酰染料木苷、黃豆黃素苷元和染料木苷元。

根據(jù)異黃酮組分標樣的保留時間對樣品進行定性，根據(jù)標準峰峰面積分別確定樣品中異黃酮12個組分的含量，每份材料3次重復，樣品異黃酮總含量為各組分含量之和。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS(Version 17.0)對蛋白質(zhì)和異黃酮數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)含量分析

196份核心親本蛋白質(zhì)含量的范圍為352～501 g/kg，集中分布在430～475 g/kg之間(圖1)。所有參試材料的蛋白質(zhì)含量平均值為448 g/kg，顯著高于以往的報道[9-11]。在196份材料中，羊眼豆(ZDD17457)和羊頭十月青(ZDD17203)的蛋白質(zhì)含量最高，分別為501、492 g/kg；而含量最低的為醬黃豆(ZDD10812)，為352 g/kg。在本研究中，檢測到的蛋白質(zhì)含量最高水平與以往的研究結(jié)果[10-11]基本類似，但是這些材料蛋白質(zhì)含量的差異顯著，變異豐富，通過大規(guī)模篩選可以獲得高蛋白大豆種質(zhì)，為蛋白改良提供優(yōu)質(zhì)親本資源。

圖1 參試材料蛋白質(zhì)含量分布

針對參試材料的原產(chǎn)地做進一步的歸類與分析，結(jié)果表明南方地區(qū)102份種質(zhì)的蛋白質(zhì)平均含量(456 g/kg)顯著高于黃淮海地區(qū)94份種質(zhì)(439 g/kg)(表2)。此外，蛋白質(zhì)含量最高的2個參試品種，羊眼豆(ZDD17457,云南)和羊頭十月青(ZDD17203,廣西)均源于我國南方地區(qū)。以上研究表明，與我國黃淮海地區(qū)相比，南方地區(qū)更能夠生產(chǎn)出高蛋白大豆。

表2 2個生態(tài)區(qū)域大豆蛋白質(zhì)和異黃酮組分含量的比較

注：不同小寫字母表示同一行之間的顯著性差異(P<0.05)。

2.2 異黃酮成分分析

利用HPLC法對參試材料進行異黃酮成分分析，發(fā)現(xiàn)12種組分均存在較大差異(表2)。其中，丙二酰染料木苷、丙二酰黃豆苷、黃豆苷和染料木苷這4種異黃酮成分的含量最高，平均含量分別為966.4、667.2、206.0、229.3 mg/kg，其含量最高的4個品種分別為響水黑豆(ZDD17256)、74-424(ZDD11588)、中豆31(ZDD24842)和邯豆3號(ZDD23957)。與此相反，196份大豆材料游離型苷元(黃豆黃素苷元，黃豆苷元和染料木苷元)平均含量均低于10 mg/kg。染料木苷元和黃豆黃素苷元含量相對較低，但這兩類異黃酮組分具有多種藥理作用，如提高免疫系統(tǒng)和預防慢性疾病等[12-13]。在所有參試材料中，響水黑豆(ZDD17256)的染料木苷元含量和黑豆(ZDD25140)的黃豆黃素苷元含量最高，分別可達98.5、28.3 mg/kg。

通過對參試材料的原產(chǎn)地做進一步分析，我國南方地區(qū)102份大豆種質(zhì)黃豆苷和染料木苷的平均含量均顯著低于黃淮海地區(qū)94份種質(zhì)，而2個地區(qū)的丙二酰染料木苷和丙二酰黃豆苷平均含量則無顯著差異。此外，南方地區(qū)大豆種質(zhì)的黃豆黃素苷元平均含量也顯著低于黃淮海地區(qū)。這些結(jié)果與以前的研究報道基本一致[8,14]。并且，南方地區(qū)黃豆黃素苷、乙酰黃豆苷和乙酰黃豆黃素苷的平均含量均顯著低于黃淮海地區(qū)。以上結(jié)果表明，我國黃淮海地區(qū)大豆異黃酮主要成分的含量均高于南方地區(qū)。

2.3 異黃酮總含量分析

196份參試材料異黃酮總含量呈正態(tài)分布(圖2)，其含量變化范圍為254.1～6 068.9 mg/kg，平均含量為2 463.3 mg/kg，集中分布在1 700～3 100 mg/kg。本研究中觀測到異黃酮總含量的平均含量與梁慧珍等[5]和劉廣陽等[15]的報道接近，但是低于Zhang等[16]的報道。其中響水黑豆(ZDD17256)、刺猬子黃豆(ZDD11697)、74-424(ZDD11588)和中豆31(ZDD24842)4個品種的異黃酮總含量最高，分別為6 068.9、5 248.9、5 142.6、5 087.2 mg/kg。異黃酮總含量最低的5個品種為石芽黃(ZDD17227)、遲黃豆(ZDD12023)、曙光黃豆(ZDD11703)、小花豆(ZDD11467)和大粒黃皮(ZDD21232)，其含量分別只有254.1、429.7、673.0、771.8、978.8 mg/kg。這些異黃酮總含量不同的大豆種質(zhì)，可以作為新材料用于大豆育種與遺傳改良研究。

此前袁鳳杰等[8]的報道顯示，我國黃淮海地區(qū)大豆異黃酮總含量顯著高于南方地區(qū)(P<0.05)。在本研究中，2個地區(qū)大豆種質(zhì)異黃酮中的一些組分含量存在顯著差異，但是總含量并沒有表現(xiàn)出明顯差異(表2)。因此，外界環(huán)境(溫度、光照、濕度等因素)對于大豆異黃酮的積累具有重要的影響。

圖2 參試材料異黃酮總含量分布

2.4 相關(guān)分析

對大豆異黃酮各成分及其總含量相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)異黃酮各組分與異黃酮總量之間存在正相關(guān)(表3)。異黃酮總含量與乙酰黃豆黃素苷和染料木苷元的相關(guān)系數(shù)最高，分別為0.874和0.843。異黃酮中的2個主要成分丙二酰染料木苷和黃豆苷，與異黃酮總含量均呈極顯著正相關(guān)(r=0.841，r=0.814)，這些結(jié)果與以前的報告是一致的[8]。但是，異黃酮總含量與黃豆黃素苷、乙酰黃豆苷、乙酰染料木苷和丙二酰黃豆苷之間的相關(guān)性均在50%以下。因此，對于這些異黃酮組分含量的選擇，不能僅憑異黃酮總含量的高低來判斷。此外，染料木苷和乙酰黃豆黃素苷以及染料木苷和黃豆苷之間都存在著顯著正相關(guān)的關(guān)系(r=0.886，r=0.852)，其表明染料木苷、黃豆苷和乙酰黃豆黃素苷在大豆籽粒生長中同步積累。

表3 蛋白質(zhì)與異黃酮以及各組分間相關(guān)性分析

注：*表示差異達顯著水平(P<0.01)，**表示差異達極顯著水平(P<0.05)。

對蛋白質(zhì)和異黃酮之間做進一步的相關(guān)性分析，蛋白質(zhì)與染料木苷和黃豆黃素苷元之間均具有顯著負相關(guān)關(guān)系(r=-0.322，r=-0.322)。以往的研究表明，大豆蛋白質(zhì)含量與異黃酮總含量之間存在弱負相關(guān)性(r=-0.342，r=-0.416)[5,15]。因此，選育高蛋白和高異黃酮大豆是存在可能的。本研究中，廣西地方品種響水黑豆(ZDD17256)蛋白質(zhì)含量和異黃酮總含量分別為473 g/kg和6 068.9 mg/kg，湖北地方品種72-424(ZDD11588)蛋白質(zhì)含量和異黃酮總含量分別為475 g/kg和5 142.6 mg/kg。這2份高蛋白、高異黃酮種質(zhì)可以作為特異材料用于今后的大豆育種和遺傳改良研究。

3 結(jié)論

不同大豆品種具有不同的加工用途，大豆籽粒中蛋白質(zhì)和異黃酮的含量直接影響豆制品品質(zhì)。本研究中，196份參試材料的蛋白質(zhì)和異黃酮含量均存在明顯差異。我國南方地區(qū)大豆種質(zhì)的蛋白質(zhì)含量明顯高于黃淮海地區(qū)，而2個地區(qū)異黃酮總含量則無顯著差異。然而，這2個地區(qū)異黃酮主要成分之間仍表現(xiàn)出顯著差異。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)與染料木苷和黃豆黃素苷元之間均存在負相關(guān)的關(guān)系，但是蛋白質(zhì)與總異黃酮僅存在弱負相關(guān)關(guān)系。因此，大豆籽粒的蛋白質(zhì)與異黃酮性狀能夠同時進行改良，通過篩選和育種改良大豆品質(zhì)，可以獲得高蛋白、高異黃酮大豆。

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