成年果蠅大腦解剖及熒光染色方法的研究

王瓜秀

(湖南大學(xué) 生物學(xué)院， 長(zhǎng)沙 410082)

果蠅作為模式生物用于各方面研究有著其他生物無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，果蠅大腦已廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)的研究，特別是研究行為神經(jīng)環(huán)路的基礎(chǔ)[1]。果蠅基因組小，神經(jīng)元數(shù)量少，神經(jīng)系統(tǒng)相對(duì)簡(jiǎn)單，便于研究；另一方面，果蠅表現(xiàn)出復(fù)雜多樣的行為，如學(xué)習(xí)記憶[2]、節(jié)律睡眠[3-4]、社會(huì)交往[5]及情緒[6-9]等。另外它強(qiáng)大的遺傳操作，使得果蠅不僅在正常的功能研究中很重要，而且在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中也起巨大的作用，在果蠅大腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)的很多關(guān)鍵突觸分子也被發(fā)現(xiàn)在哺乳類大腦中，比如中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮突觸[10-11]。在發(fā)育生物學(xué)中，果蠅大腦中的神經(jīng)元對(duì)于基因功能分析越來(lái)越常見(jiàn),比如神經(jīng)元極化、軸突和樹突的增長(zhǎng)，以及軸突和樹突之間建立聯(lián)系[12-14]等。用Gal4/UAS增強(qiáng)子[15]可以標(biāo)記果蠅大腦內(nèi)的神經(jīng)元從而高分辨率分析野生型或者轉(zhuǎn)基因果蠅內(nèi)的基因[16]。Gal4/UAS都來(lái)源于酵母，Gal4是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子可以識(shí)別UAS (upstream activating sequence)序列并激活UAS后面基因的表達(dá)。它們被引入果蠅組成一個(gè)二位系統(tǒng)，即實(shí)驗(yàn)時(shí)需要把兩種果蠅雜交在一塊，一種攜帶有組織特異性表達(dá)的Gal4，而另一種果蠅中則將感興趣基因X置于UAS的下游(圖1)。這樣一個(gè)二位系統(tǒng)的最大好處就在于，當(dāng)需要在不同的組織中表達(dá)時(shí)，只需將同一個(gè)UAS轉(zhuǎn)基因果蠅與不同的Gal4品系雜交即可。比如一個(gè)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)被用來(lái)檢驗(yàn)這一套誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的有效性，雜交后的子代中，在果蠅的腦中便顯現(xiàn)強(qiáng)烈的綠色熒光[17]。

圖1 果蠅GAL4/UAS表達(dá)系統(tǒng)

果蠅腦科學(xué)已成為全球腦科學(xué)研究領(lǐng)域的重中之重，但是對(duì)于成年果蠅大腦解剖的很少，對(duì)果蠅幼蟲大腦解剖較多。果蠅幼蟲大腦主要應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)，但是成年果蠅大腦對(duì)于遺傳和成像都會(huì)日漸重要[19]。果蠅的大腦很合適做免疫熒光技術(shù)，此種技術(shù)需要特定的一抗來(lái)與大腦中特定的蛋白質(zhì)結(jié)合，然后熒光標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，再進(jìn)行熒光掃描。相比其他技術(shù)如免疫過(guò)氧化物酶染色來(lái)說(shuō)，免疫熒光的優(yōu)勢(shì)是熒光染色法允許高分辨率共焦或多光子成像獲取果蠅大腦深層結(jié)構(gòu)。這給出了具體的成年果蠅大腦的解剖及熒光染色的方法，之后給出的例子是果蠅嗅覺(jué)學(xué)習(xí)系統(tǒng)中的蘑菇體及神經(jīng)系統(tǒng)中的膠質(zhì)細(xì)胞。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

野生型果蠅w1118 (isoCJ1)，簡(jiǎn)稱wt，白眼；GAL4驅(qū)動(dòng)子：MB247，repo Gal4；UAS品系：UAS-GFP-RpL-10A ，UAS-CD8::GFP;MB247-dsred。以上果蠅品系均來(lái)自Bloomington Drosophila Stock Center。

1.2 實(shí)驗(yàn)耗材

精細(xì)鑷子2把、普通鑷子一把、解剖盤1個(gè)、載玻片1個(gè)、體視顯微鏡1臺(tái)，共聚焦顯微鏡1臺(tái)。

1.3 試劑

PBS緩沖液(0.01 mol/L)： 2.7 mmol/L KCl (0.2 g)+4.3 mmol/L Na2HPO4(1.42 g)+1.8 mmol/L KH2PO4(0.27 g)+137 mmol/L NaCl(8 g)，加800 mL去離子水充分?jǐn)嚢枞芙?，調(diào)pH 7.4，加去離子水定容到1 L。

固定液: 4%多聚甲醛溶于PBS，用0.01 mmol/L的PBS配制，100 mL PBS加4 g多聚甲醛，磁力攪拌器加熱攪拌，溫度控制在60℃以下，用細(xì)粉末的多聚甲醛，不溶滴加NaOH，最后調(diào)pH 7.4左右。

Penetration/Blocking buffer：PBST 0.2%+NGS(山羊血清)10%+SA(NaN3)0.02%；PBST緩沖液：0.2%的Triton X-100+PBS；一抗： mouse anti-nc82；Rabbit anti-GFP；mouse-anti-repo；二抗：goat anti-mouse Alexa Fluor488； goat anti-rabbit AlexaFluor488。 DAPI，即用型。

2 方法

2.1 果蠅的飼養(yǎng)

1)將所需要的果蠅保種和傳代。

2)挑選處女蠅。一般是挑UAS品系的處女蠅(哪種作為雌蠅并不影響結(jié)果)，每種品系的果蠅挑選5只處女蠅即可。

3)果蠅雜交。將挑選好的UAS處女蠅與GAL4雄蠅放入一個(gè)食物瓶雜交，做好標(biāo)記，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。每瓶最好5雄5雌(多一點(diǎn)更好)。在培養(yǎng)過(guò)程中要經(jīng)常觀察，是否親本雌雄都充足，是否污染，是否有產(chǎn)卵、孵化等。

2.2 果蠅的解剖

1)果蠅的準(zhǔn)備。選取所需年齡、基因型的果蠅2～4只，放置到通有持續(xù)性CO2的平臺(tái)上，在體視鏡下分離頭和身體。

2)果蠅大腦的解剖。在盛滿PBS緩沖液(最好是冰的PBS緩沖液，保證果蠅大腦解剖在低溫下進(jìn)行)的解剖盤中解剖，用一只鑷子夾住果蠅頭，防止漂浮到水面，另一只鑷子拔去果蠅的口器，漏出一個(gè)小洞，隨后用鑷子A按住頭部，鑷子B的一個(gè)鑷瓣從這個(gè)小孔的中間穿入并貼著果蠅大腦內(nèi)壁達(dá)到一邊的眼睛，然后鑷子A迅速上來(lái)和鑷子B 一起小心扯去包裹在其上面的角質(zhì)膜，另一半也同樣操作。此時(shí)果蠅大腦正面完全浮現(xiàn)出來(lái)，果蠅成年大腦上有很多氣管和白色的絲，要小心清除腦組織外面的氣管和其他臟東西(注意：扯角質(zhì)膜的力不能太大，以免大腦被扯破；清除氣管時(shí)一定要小心，不要將大腦弄壞)。

3)取出果蠅。將果蠅從解剖盤移到小孔板中(此處采取的方法是用200 μL的移液槍調(diào)到很小的量程然后吸出)。

圖2 果蠅大腦解剖圖

A：果蠅大腦的概要圖，前衛(wèi)像[10]，灰色的區(qū)域就是果蠅大腦所在區(qū)域，紅色標(biāo)記為果蠅嗅覺(jué)附件；B～E：果蠅解剖過(guò)程圖；F：解剖出來(lái)的果蠅大腦

A：Schematic of theDrosophilahead (anterior view), with the brain in dark gray. Olfactory appendages are shown in red.(Joy S Wu & Liqun Luo，2006)；B-E：The process ofDrosophilabrain dissection；F：The Drosophila brain after dissection

2.3 果蠅大腦免疫染色

1)固定。取出事先分裝好的4%的PA(多聚甲醛)，將大腦固定20～30 min(多聚甲醛覆蓋大腦即可，但要小心大腦干掉，多聚甲醛有劇毒，戴手套操作)。

2)抽真空。吸去4%的PA，加入PBST緩沖液(0.2% Triton x-100+4% PA)，置于抽真空的干燥器內(nèi)，抽取真空2次，每次10 min。抽真空的目的是抽取果蠅氣管內(nèi)的空氣，使成像效果更好。

3)封閉。棄去PBST，加入適量Penetration/Blocking buffer，4℃處理2 h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

4)孵育一抗。棄去Penetration/Blocking buffer，將一抗以1∶100的比例在Penetration/Blocking buffer中稀釋后，加到放置大腦的皿中，放到4℃冰箱孵育過(guò)夜。

5)孵育二抗。棄去一抗的孵育液，用PBST洗3遍，每次10 min，然后加入以1∶100的比例在Penetration/Blocking buffer中稀釋的二抗，加到放置大腦的皿中，放到4℃冰箱孵育過(guò)夜?？稍谥車砑铀址乐构壌竽X干燥(超過(guò)6 h即可)；用鋁箔覆蓋,減少熒光漂白。

6)棄去二抗的孵育液，用PBST洗3遍，每次10 min。

7)加入DAPI，室溫下孵育10 min。

8)棄去DAPI，用PBST洗3遍，每次10 min。

9)封片：用兩層中間有孔的圓形標(biāo)簽紙貼在一起做個(gè)小槽，滴加VECTASHIELD mounting media，用微量移液槍將大腦吸出放在載玻片上，蓋上蓋玻片，然后用指甲油封片。

2.4 共聚焦顯微鏡檢測(cè)果蠅腦熒光圖譜

圖3 MB247Gal4與UAS-GFP-RpL-10A，repoGAL4品系與UAS-CD8::GFP;MB247-dsred雜交的果蠅大腦中表達(dá)的熒光圖譜

Fig 3 Immunofluorescence of MB247Gal4>UAS-GFP-RpL-10A and repo Gal4>UAS-CD8::GFP;MB247-dsred flies

A、B、E為果蠅大腦蘑菇體形狀，A和B用的mouse anti-nc82抗體；C～H為果蠅大腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，C使用的是anti-repo抗體，D使用的anti-GFP抗體,F是染的DAPI(染所有細(xì)胞核)，G為C、D、E、F的合并圖，H為放大倍數(shù)后的圖

(A,B,E) Structure of mushroom body inDrosophila，mouse anti-nc82 was used in A andB(C-H)Glial cells ofDrosophila；mouse anti-repo was used in C; Rabbit anti-GFP antibody was used in D.(F)DAPI was used in theDrosophilabrain.(G)The merge of C,D,E,F.(H)Enlarged view of G. Scale bars,100μm

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)描述的解剖果蠅大腦及對(duì)果蠅大腦免疫染色的方法可以看到成年果蠅大腦內(nèi)蘑菇體和膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可以對(duì)單個(gè)果蠅大腦單個(gè)神經(jīng)元染色。另外應(yīng)注意幾個(gè)事項(xiàng)：

在解剖的時(shí)候，果蠅大腦會(huì)漂浮在緩沖液里而不沉下去，這可能是空氣進(jìn)入果蠅大腦氣管所導(dǎo)致的，所有解剖的時(shí)候要小心地去掉這層氣管；解剖最好在冰上進(jìn)行，果蠅大腦固定的時(shí)間最好不超過(guò)1 h，因?yàn)闀?huì)導(dǎo)致組織的降解，固定的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致圖像模糊；成像的時(shí)候背景信號(hào)過(guò)強(qiáng)，這可能是二抗稀釋的不夠造成的，所以二抗盡量濃度低一點(diǎn)；熒光信號(hào)變?nèi)?，可能是因?yàn)檠b片暴露在燈光下或者熒光下過(guò)長(zhǎng)時(shí)間導(dǎo)致了熒光猝滅，所以要保證樣品不要在房間放太久；樣品置于盛放冰的PBS解剖盤中解剖時(shí)，可保持果蠅大腦不渙散，所以要使解剖過(guò)程處于較低溫度。

該方法除了可作為果蠅腦科學(xué)研究的新解剖技術(shù)外，由于能夠完整地收集果蠅大腦，能夠直接觀察到頭部大腦處于果蠅頭部的位置，因此也可作為教學(xué)上果蠅解剖的一種新方法，從而增強(qiáng)學(xué)生對(duì)腦部結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)。

對(duì)于果蠅大腦研究領(lǐng)域來(lái)說(shuō)，熒光染色顯得尤為重要，這也可以作為一種基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)為以后各種實(shí)驗(yàn)做鋪墊。

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