利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記研究東方田鼠的多父權(quán)現(xiàn)象

郭宗明, 王 勇, 郭 聰

(1. 煙臺(tái)南山學(xué)院， 煙臺(tái) 265713； 2. 四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 成都 610064； 3. 中國(guó)科學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所, 長(zhǎng)沙 410125)

動(dòng)物行為是在一定環(huán)境中，為滿足生存、繁衍后代等生理需要而完成的諸多動(dòng)作[1]。而繁殖行為是動(dòng)物諸多行為中極為重要的行為。通過復(fù)雜的繁殖行為，保證繁殖成功，才能維持種族延續(xù)和發(fā)展?；榕渲贫仁莿?dòng)物種群中的個(gè)體在繁殖期為獲得配偶而采取的普遍的行為對(duì)策，其包括以下幾種含義[2]：1)個(gè)體獲得配偶數(shù)量；2)兩性是否有雙親行為；3)配對(duì)關(guān)系的緊密程度及持續(xù)時(shí)間。依據(jù)動(dòng)物個(gè)體在一個(gè)繁殖季節(jié)里與其交配的配偶數(shù)，婚配制度分為單配制和多配制，其中多配制又分為一雄多雌制,一雌多雄制以及混交制3種類型。

田鼠亞科動(dòng)物(Microtine)的婚配制度差異較為明顯，是研究婚配制度的理想動(dòng)物[3]。運(yùn)用活捕和無線電遙測(cè)技術(shù)的研究表明：草原田鼠(Microtusochrogaster)雌雄共巢且巢面積大致相同，顯示單配制特征[4]。邰發(fā)道等[5]通過實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的觀察，結(jié)合野外生態(tài)研究的資料分析后認(rèn)為棕色田鼠(M.mandarinus)也具有單配制特征。泰加田鼠(M.xanthognathus)雌雄鼠很少共巢，雌雄巢面積差異顯著，雄性和多個(gè)雌性巢重疊，顯示一雄多雌特征。而山地田鼠(M.montanus)雌雄巢的特點(diǎn)大致同泰加田鼠，但雌雄巢區(qū)相互重疊，顯示混交制特征[6]。

通過野外和室內(nèi)對(duì)嚙齒類動(dòng)物的觀察來推測(cè)其婚配制度有著一定的局限性。例如，Getz等[7]依據(jù)草原田鼠(M.ochrogaster)的繁殖排他性、領(lǐng)域、單配行為以及雙親關(guān)心行為推斷該鼠為單配制型。然而，分子標(biāo)記的分析表明草原田鼠56%的窩仔中存在多父權(quán)現(xiàn)象[8]。因此，分子生物學(xué)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)解決了傳統(tǒng)方式不能解決的問題。具有高度變異的分子遺傳標(biāo)記，如微衛(wèi)星，已被廣泛用于動(dòng)物婚配制度的研究[9]。

棲息于洞庭湖區(qū)的東方田鼠是近些年來新興的危害性嚙齒動(dòng)物。郭聰?shù)萚10-11]根據(jù)野外和室內(nèi)的行為觀察推測(cè)該鼠的婚配制度是一夫一妻制的可能性極小，為混交制的可能性較大。由于野外不能真實(shí)看到東方田鼠的交配行為，室內(nèi)觀察又受到多種因素的影響，因此，有必要運(yùn)用分子遺傳標(biāo)記的方法進(jìn)一步探究和證實(shí)東方田鼠的婚配行為。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

以葵花籽為誘餌，采用鼠夾捕獲了7只懷孕雌鼠。取母鼠腿部肌肉及其胚胎放入酒精中，編號(hào)記錄?；貙?shí)驗(yàn)室后冷凍保存。

1.2 試劑及儀器

PCRMix、PCR引物(上海生工合成)、聚丙烯酰胺、硝酸銀、尿素、甲叉丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨。

PCR儀、紫外分光光度計(jì)、離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、垂直電泳儀(北京六一)。

1.3 DNA提取

取少許肌肉組織、胚胎組織，用雙蒸水清洗2次后，運(yùn)用酚-氯仿法[12]完成抽提DNA過程。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量。

1.4 引物來源及篩選

本研究使用與東方田鼠親緣關(guān)系較近的屬種的微衛(wèi)星引物以及GenBank中的微衛(wèi)星序列自行設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。所有引物經(jīng)優(yōu)化、擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇條帶單一、且穩(wěn)定擴(kuò)增的6對(duì)引物為下一步使用的引物(表1)。

1.5 PCR體系

用篩選的引物分別對(duì)母鼠及其胚胎的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)PCRMix，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增體系為15 μL(包括約100 ng模板DNA，0.3 mmol/L dNTP，上下游引物各0.24 mmol/L，30 mmol/L KCl，6 mmol/L Tris-HCl，0.9～1.2 mmol/L MgCl2，0.75 UTaqDNA 聚合酶)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，54℃～63℃退火溫度(依據(jù)每對(duì)引物而定)50 s，延伸1 min，完成30個(gè)循環(huán)反應(yīng)；最后延伸10 min結(jié)束。取PCR產(chǎn)物各10 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增情況。

1.6 聚丙烯酰胺凝膠制備

將配套的玻璃板放入NaOH溶液中浸泡一晝夜，然后沖洗后晾干備用。將晾干的玻璃板放平，用酒精擦3次。無耳玻璃板用親和硅烷擦2次，有耳玻璃板用剝離硅烷擦2次。將隔板放在兩玻璃板之間，然后固定。用水平儀將玻璃板調(diào)節(jié)呈水平狀態(tài)。再將配制好的凝膠液[丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺混合液(45%)，10×TBE，1.6%過硫酸銨]徐徐灌入玻璃板中。膠灌好后，小心插入梳子,放置1.5～2 h，凝膠即可制備好。

表1 微衛(wèi)星引物及重復(fù)序列，退火溫度，等位基因數(shù)

1.7 PAGE電泳、銀染

1.7.1 電泳

將制備好的凝膠放入豎直電泳槽，固定。然后加入1×TBE緩沖液，預(yù)電泳3 h。將變性的PCR產(chǎn)物取5 μL 點(diǎn)樣，最后點(diǎn)上PUC18 Marker，1600 V，50 W狀態(tài)下電泳3 h。

1.7.2 銀染

電泳完畢后將膠與玻璃板放入固定液中固定20 min，然后用雙蒸水漂洗2次，再放入硝酸銀溶液中染色約15 min。染色結(jié)束后漂洗2次，放入顯色液中，觀察條帶清晰時(shí)取出漂洗2次，拍照保存。

1.8 微衛(wèi)星分析

將所有樣品在同一凝膠上電泳、銀染、顯色。觀察每一母鼠與其胎仔在每個(gè)位點(diǎn)上的條帶情況，若判斷有多父權(quán)的可能，再重復(fù)一次PCR、電泳、銀染、顯色過程，保證判斷的準(zhǔn)確性。運(yùn)用Labwork軟件進(jìn)行等位基因大小的判斷。

1.9 多父權(quán)分析

對(duì)每一母鼠的等位基因和其胎仔的等位基因進(jìn)行比較，判斷每一窩胎仔其可能父親的等位基因數(shù)，進(jìn)而判斷父權(quán)數(shù)。若每一窩胎仔中雄鼠的等位基因超過2個(gè)，證明此窩仔擁有多父權(quán)現(xiàn)象。

2 結(jié)果

本研究中每窩平均窩仔數(shù)為5.29±1.60，除2窩胎仔的父權(quán)數(shù)明顯超過一個(gè)外，其他窩仔的父權(quán)數(shù)判斷至少為1個(gè)(表2)。

圖1 顯示，03M組母鼠有A、B等位基因，是雜合子，胎仔04個(gè)體與母鼠相同。01、03、05和06 個(gè)體都有一個(gè)不同于母鼠的等位基因C，而02個(gè)體有不同于母鼠的等位基因D，表明02個(gè)體與01、03、05和06有不同的父權(quán)，因此判斷03組胎仔中至少擁有2個(gè)父權(quán)。

圖2 顯示，07M組母鼠有A、B等位基因，是雜合子，胎仔06個(gè)體與母鼠相同。02、04和05個(gè)體有一個(gè)不同于母鼠的等位基因C，而01個(gè)體擁有不同于等位基因A、B、C的等位基因基因D。由于母鼠擁僅有A、B 2個(gè)等位基因，而胎仔個(gè)體中出現(xiàn)與母鼠不同的等位基因C和D。01和02分別擁有一個(gè)不同于母鼠的等位基因C和D，表明01和02個(gè)體擁有不同的父權(quán)，06個(gè)體擁有A、B兩個(gè)等位基因，其父權(quán)與01、02個(gè)體不同，因此可判斷07M組胎仔中至少擁有3個(gè)父權(quán)。

表 2 7組胎仔的父權(quán)分析結(jié)果

圖 3中，06M組母鼠有A、B 2個(gè)等位基因，母鼠是雜合子。02、05和06胎仔個(gè)體也是雜合子，而01、03和04胎仔個(gè)體都只有等位基因B，是純合子。來自雄性鼠的等位基因有2個(gè)，推斷06M組胎仔中至少擁有1個(gè)父權(quán)。

圖1 Moe4位點(diǎn)引物擴(kuò)增03M組母鼠與其胎仔的電泳圖

字母表示每個(gè)個(gè)體的等位基因

圖 2 Ma11位點(diǎn)引物擴(kuò)增07M組母鼠與其胎仔的電泳圖

圖 3 Moe4位點(diǎn)引物擴(kuò)增06M組母鼠與其胎仔的電泳圖

3 討論

Jennion和Petrie[14]綜述了多父權(quán)帶給子代的遺傳優(yōu)勢(shì)：多父權(quán)不僅增加子代遺傳多樣性，還增加選擇上的適合度和繁殖成功率。多父權(quán)也影響有效種群的大小，多父權(quán)比單父權(quán)能增加種群大小，是保證種群多樣性降低近交繁殖的一種策略。這些理論研究可以解釋東方田鼠具有多父權(quán)婚配行為的生物學(xué)意義。洞庭湖每年有季節(jié)性洪水發(fā)生，形成了盛水期與枯水期交替出現(xiàn)的景觀變化格局。伴隨這種變化，東方田鼠也周期性在湖灘和垸內(nèi)農(nóng)田、崗地之間往返遷移。遷移至農(nóng)田的東方田鼠，受到夏季高溫及遷移時(shí)體力消耗過大的影響，表現(xiàn)出很低的繁殖力[15]。不同生境中，東方田鼠的繁殖力差別較大。避難于稻田、崗地的東方田鼠其繁殖強(qiáng)度遠(yuǎn)低于湖灘生境。郭聰?shù)萚16]研究洪水期東方田鼠的遷移機(jī)理，發(fā)現(xiàn)不同年份遷入垸內(nèi)的東方田鼠的雄性比例差異顯著。當(dāng)湖水位下降，湖灘逐漸顯露時(shí)，東方田鼠回遷湖灘。回遷時(shí)雄性的回遷比率大于雌性，且個(gè)體較大。洞庭湖特殊景觀生境周期性變更、不同年份雄性比的顯著差異及洪水期種群數(shù)量的減少可能是東方田鼠形成混交制的外部影響因素。東方田鼠采取混交婚配制度可能是適應(yīng)湖灘生境的一種繁殖行為策略。

如圖3所示，06M組中的窩仔擁有來自父權(quán)的2個(gè)等位基因，但不能排除是多父權(quán)的可能，因?yàn)槎鄠€(gè)不同的父親可以傳遞相同的等位基因[17]。另外，同一物種種群隨環(huán)境條件的差異多父權(quán)也有所變化，種群密度和生境結(jié)構(gòu)的不同也影響婚配行為[18-19]。分布在洞庭湖和長(zhǎng)沙市區(qū)的東方田鼠在種群密度和生境結(jié)構(gòu)上存在著差異，這些差異是否影響著洞庭湖和長(zhǎng)沙東方田鼠的婚配行為有待進(jìn)一步研究探討。此外，本研究在微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇上僅選擇擴(kuò)增條帶單一的位點(diǎn)，沒有研究微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性情況。因此，對(duì)洞庭湖東方田鼠婚配行為上表現(xiàn)的多父權(quán)行為的研究有待進(jìn)一步深入。

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