不同年生鳳丹根際AM真菌與土壤酶活性的相關(guān)性分析

李志雅， 楊安娜， 湯冬梅， 汪建中， 楊 帆

(安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級重點實驗室， 蕪湖 241000)

鳳丹(Paeoniaostii)是牡丹野生種楊山牡丹的栽培品種，主要應(yīng)用于牡丹丹皮和籽油的生產(chǎn)，是一種很好的藥食兼?zhèn)渲参颷1]。其根皮有鎮(zhèn)痛、解熱、抗過敏、免疫等藥用，而其籽油作為一種新型木本植物油，具有抗腫瘤、抗炎、改善心血管和調(diào)節(jié)免疫等醫(yī)療保健功能[2-5]。鳳丹在安徽南陵已有1600多年的栽培歷史，因其質(zhì)地優(yōu)良，逐漸成為優(yōu)良道地藥材，為藥用牡丹中的主流品種[6]，并享受地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)。

AM是AM真菌和植物根系一起形成的互惠共生體，大約80%的陸生植物都能與AM真菌共生形成菌根，AM是自然界中分布最廣泛的內(nèi)生菌根[7]。叢枝是AM最重要的結(jié)構(gòu)之一，是AM真菌與植物之間進(jìn)行物質(zhì)交換的場所。研究表明，AM真菌能夠促進(jìn)植物幼苗生長[8-10]和對礦質(zhì)營養(yǎng)尤其是P的吸收，減少施肥量[11-14]；提高藥用植物有效成分的含量[15-19]；增強(qiáng)藥用植物的抗環(huán)境脅迫能力和抗病性，促進(jìn)藥用植物健康生長[20]。

土壤酶是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分之一，通常認(rèn)為土壤酶在很大程度上起源于土壤微生物, 也有一部分來源于植物和土壤動物, 這些生物通過生理代謝向土壤分泌酶，并且它們的殘體亦可溶出胞內(nèi)酶進(jìn)入土壤[21-22]。有研究表明，接種AM真菌后可以增強(qiáng)植物根圍土壤磷酸酶、脲酶和蛋白酶活性[23-24]，各種酶活性的增加幅度與宿主菌根侵染率顯著相關(guān)。因此，根際土壤酶活性是土壤因子被植物有效利用的關(guān)鍵，是AM真菌活力的重要體現(xiàn)，研究鳳丹根際AM真菌與土壤酶活性之間的關(guān)系，在一定程度上可以從根土界面揭示AM真菌對宿主營養(yǎng)吸收的貢獻(xiàn)，為鳳丹的栽培研究和道地保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

所選樣地為安徽省蕪湖市南陵鳳丹種植栽培基地(30°48.18.9′N，118°00.08.3′E，海拔80 m)，是生產(chǎn)鳳丹的主要地區(qū)之一。供試土壤樣品選取自然條件基本一致，鳳丹種植年限為2、3、4年的3個樣田，每個樣田采集4個樣品，將根樣放入有1/2的FAA固定液中，土樣去除石子及腐敗的落葉，然后封袋，帶回實驗室。將土樣分成二份，一份濕土用于測定土壤的菌絲量，另一份自然風(fēng)干，用于測定土壤中的孢子密度和土壤酶活性，并放入4℃冰箱中保存。

1.2 測定方法

根樣用堿解離-酸性品紅染色法[25]進(jìn)行處理并制成封片，于OLYMPUS-BX51光學(xué)顯微鏡下觀察AM真菌在各種植物根系上的侵染情況并估算定殖率[26]，并對叢枝菌根典型形態(tài)結(jié)構(gòu)如泡囊、叢枝、菌絲圈進(jìn)行攝影。土樣自然風(fēng)干后，采用濕篩沉淀法[27]收集AM真菌孢子和孢子果，于體視鏡下進(jìn)行計數(shù)。將根部的皮剝下，采用HPLC法測定鳳丹根部丹皮酚含量。

土壤酶活性測定均采用比色法，酸性磷酸酶、脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶的活性測定分別采用磷酸苯二鈉比色法、苯酚—次氯酸鈉比色法、3,5-二硝基水楊酸比色法、鄰苯三酚比色法[28]，在分光光度計下進(jìn)行測定，讀取吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)分析中的參數(shù)

定殖率(colonization rate)：指AM真菌在植物根中定殖的比率，H(%)是菌絲定殖率，A(%)是叢枝定殖率，HC(%)是菌絲圈定殖率，V(%)是泡囊定殖率，DSE(%)是黑格菌絲定殖率。

孢子密度(spore density，SD):指生物個體在單位面積中的數(shù)目，本文指20 g干土樣中AM真菌孢子數(shù)。

菌絲量(hyphae quantity，HQ)：指菌絲在單位面積中的個數(shù)，本文指5 g干土樣中所含菌絲的比率，單位mm/g。

2 結(jié)果

2.1 鳳丹根際AM真菌結(jié)構(gòu)

通過對南陵丫山采集的鳳丹根樣進(jìn)行染色制片與鏡檢，發(fā)現(xiàn)所采集的根樣全部被AM真菌侵染，形成了Arum-type類型的AM結(jié)構(gòu)，即菌絲在宿主皮層細(xì)胞間隙生長，產(chǎn)生大量的胞間菌絲，并且側(cè)向分支進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其頂端不斷分叉而發(fā)育成典型的叢枝結(jié)構(gòu)(圖1-1、1-2)。在鏡下可看到叢枝菌根真菌中的泡囊、菌絲圈、黑隔菌絲和根內(nèi)孢子，其中當(dāng)菌-植共生體生長達(dá)到頂峰時，菌絲的頂部開始膨大，從而形成了貯存器官泡囊結(jié)構(gòu)(圖1-3)，泡囊有不同的形狀，如卵圓形、橢圓形等；也有菌絲在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間彎曲閉合形成了大量的菌絲圈結(jié)構(gòu)(圖1-6)[29]；在個別菌根內(nèi)還觀察到了根內(nèi)孢子結(jié)構(gòu)(圖1-5)。

2.2 鳳丹根際黑隔菌絲結(jié)構(gòu)

在光鏡下，還可以看到一些菌絲沒有被染液染上顏色，而且菌絲還被一小段一小段地隔開，顯示出明顯的隔斷，稱它為黑隔菌絲(dark septate endophytes，DSE)(圖1-4)，DSE是指定居在植物根組織細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙，在分類學(xué)上較為混雜的一群子囊菌和無性繁殖的真菌[30]，它并不屬于叢枝結(jié)構(gòu)。

圖1 鳳丹根皮組織中AM真菌的定殖情況(1 bar = 30 μm)Fig 1 Structure of AMF in roots of Paeonia ostii(1 bar = 30 μm)

A：叢枝(arbuscules)；V：泡囊(vesicules)；DSE：黑隔菌絲(dark septate endophytes)；D：孢子(spores)；HC：菌絲圈(hyphal coil)

2.3 鳳丹根際AM真菌的定殖狀況

從定殖上看，不同年生的鳳丹全部被侵染，但是定殖程度不同，其中兩年生鳳丹的叢枝定殖率最高，達(dá)32%；三年生鳳丹的叢枝定殖率最低，為14.5%，叢枝定殖率在不同年生鳳丹中的差異不明顯(表1)。

2.4 鳳丹根際土中孢子密度

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的樣品中均有孢子產(chǎn)生，但不同年生鳳丹根際土中孢子密度不同。從高到低為：2年生鳳丹、4年生鳳丹、3年生鳳丹，且不同年生孢子密度之間差異不顯著(表1)。

2.5 鳳丹根際土壤中的菌絲含量

在研究的樣品中，實驗結(jié)果為3年生鳳丹根際土的菌絲量最多，4年生的鳳丹菌絲量最低，并且2年生、3年生、4年生的鳳丹根際土中菌絲量沒有差異(表1)。

2.6 鳳丹根部丹皮酚含量

如圖2所示，鳳丹根部丹皮酚含量為3年生<4年生<2年生，其中2年生丹皮酚含量為0.174mg，且不同年生之間無顯著差異。

2.7 鳳丹根際土壤中酶活性變化

由實驗可知，不同年生鳳丹根際多酚氧化酶活性存在顯著差異，其中，4年生鳳丹活性最強(qiáng)，2年生鳳丹活性最弱，表明其根際多酚氧化酶活性呈逐年增長的趨勢(圖3-b)；不同年生鳳丹根際蔗糖酶活性無規(guī)律性變化，2年生鳳丹活性最強(qiáng)(圖3-d)；土壤酸性磷酸酶的活性隨著鳳丹種植時間的增加活性逐漸降低，且差異達(dá)到了顯著水平(圖3-a)；在土壤脲酶活性測定中，3年生鳳丹根際土壤活性最高，2年生最低，酶活在不同年生鳳丹中無規(guī)律性變化，且4年生鳳丹土壤脲酶活性在P<0.05水平上差異顯著(圖3-c)。

表1鳳丹AM真菌的定殖率

Table1 Colonization an of AMF ofPaeoniaostii

數(shù)值為平均值，±為標(biāo)準(zhǔn)差；表中的字母代表在不同年生時P<0.05的水平上差異是否顯著

圖 2 不同年生鳳丹根部丹皮酚含量變化

注：同一表格中的不同字母表示在P<0.05水平上差異顯著

圖 3 不同年生鳳丹根際土壤酶的活性變化

同一表格中的不同字母表示在P<0.05水平上差異顯著

2.8 鳳丹根際AM真菌的參數(shù)與土壤酶活性的冗余分析

為進(jìn)一步驗證鳳丹根際AM真菌的參數(shù)與土壤酶活性之間的關(guān)系，把AM真菌的參數(shù)與土壤酶活性進(jìn)行了冗余分析(圖4)。該圖由兩部分組成一部分是黑色的向量，為AM真菌及黑隔菌絲的參數(shù)(HC，SD，H，V，A，HQ，DSE)，另一部分是紅色的向量為土壤酶活參數(shù)(PPO，PCA，S，U)。向量越長代表各參數(shù)越重要，AM真菌的參數(shù)與土壤酶活的夾角的余弦值代表他們之間的相關(guān)系數(shù)，兩者之間的向量同方向代表有較強(qiáng)的正相關(guān)反方向代表有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，垂直表明不相關(guān)。由圖4可以看出，酸性磷酸酶、脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶與土壤菌絲量呈正相關(guān)，酸性磷酸酶、脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶與泡囊密度呈負(fù)相關(guān)，孢子密度和菌絲圈與酸性磷酸酶、蔗糖酶、多酚氧化酶呈正相關(guān)，脲酶呈負(fù)相關(guān)；菌絲與AM真菌與酸性磷酸酶呈正相關(guān)，與脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶呈負(fù)相關(guān)。

圖 4 鳳丹AM真菌參數(shù)與土壤酶活性的冗余分析

圖中字母HQ為菌絲量；HC為菌絲圈；SD為孢子密度；V為泡囊密度；H為菌絲定殖率；A為叢枝定殖率；DSE為黑隔菌絲；PPO為多酚氧化酶；PCA為酸性磷酸酶；S為蔗糖酶；U為脲酶

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)鳳丹與AM真菌的共生現(xiàn)象十分普遍，所采取樣地的全部根樣都被AMF不同程度的侵染，說明鳳丹能與AM真菌形成良好的共生關(guān)系。鳳丹與AM真菌都能形成良好的共生關(guān)系可能與其是多年生木本及其遺傳背景復(fù)雜的生物學(xué)特性相關(guān)。根內(nèi)形成典型的Arum-type類型的AM結(jié)構(gòu)，這與賀學(xué)禮等[31]研究的沙棘根圍與AM真菌共生形成的AM結(jié)構(gòu)類型相同。在不同年生的鳳丹中， AM真菌侵染率、菌絲侵染率與孢子密度均表現(xiàn)為2年生>4年生>3年生，說明三者在不同年生間的變化趨勢相同，它們在生態(tài)系統(tǒng)中是相互促進(jìn)的。由于叢枝定殖率、孢子密度和菌絲定殖率在不同年生間無顯著差異性，說明它們在不同年生時侵染能力較穩(wěn)定。

實驗結(jié)果表明土壤中菌絲量為180～200 mm/g(表1)，大量的根外菌絲對促進(jìn)植物養(yǎng)分和水分的吸收有重要作用。鳳丹通過形成良好的菌根定殖率和大量的根外菌絲對土壤貧瘠地區(qū)鳳丹的種植具有重要的意義。

鳳丹根部丹皮酚含量隨不同年生產(chǎn)生的變化趨勢與根際AM真菌在不同年生的侵染趨勢相同，說明當(dāng)叢枝定殖率增高時，丹皮酚的平均含量也會增加，可能是當(dāng)侵染能力增強(qiáng)時，會提高宿主植物對土壤中礦質(zhì)元素及水分的吸收，使鳳丹皮中活性成分之一的丹皮酚平均含量增加。

黑格菌絲作為一種內(nèi)生真菌并不屬于AM真菌，但是在鳳丹根部卻同時看到了這兩類真菌，說明這兩類真菌可以同時生存，但是二者之間的關(guān)系還有待研究。

土壤酶與AM真菌結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系。酸性磷酸酶、脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶的活性與土壤菌絲含量呈正相關(guān)，說明這4種酶對土壤中微生物的活動有著促進(jìn)的作用；酸性磷酸酶、脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶的活性與泡囊定殖率呈負(fù)相關(guān)，可能是由于這4種酶參與土壤微生物與植物間的營養(yǎng)循環(huán)而使AM真菌沒有形成貯藏營養(yǎng)的泡囊；菌絲定殖率、AM真菌定殖率與酸性磷酸酶的活性呈正相關(guān)，與脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶的活性呈負(fù)相關(guān)，可能是P對AM真菌的侵染有促進(jìn)作用，N、糖類與酚類物質(zhì)對AM真菌的侵染有抑制作用，還有待進(jìn)一步研究。

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