海洋來源褐藻膠裂解酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

韓 偉,許鑫琦,葉秀云,林 娟

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,福建省海洋酶工程重點實驗室,福建 福州 350116)

0 引言

褐藻膠(Alginate)是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古羅糖醛酸(G)兩種單體組成的二元線型嵌段化合物,屬于水溶性酸性海藻多糖. 根據(jù)其聚合方式不同,可分為同聚物G、 同聚物M和異聚物G/M三種[1]. 褐藻膠因粘度大且為生物大分子不易被機體有效吸收,限制了其應(yīng)用. 隨著海藻寡糖生理活性研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)褐藻膠水解后生成的褐藻寡糖在抗凝血,降低血糖、 血脂,抗自由基,抗腫瘤等方面效果良好[2-6],低聚合度的褐藻寡糖還具有調(diào)節(jié)植物生長和防病害的作用. 褐藻膠裂解酶作為一種海藻工具酶[7],相較于物理、 化學(xué)方法制備褐藻寡糖,具有反應(yīng)條件溫和、 專一性強、 副產(chǎn)物少、 酶解產(chǎn)物得率高等優(yōu)點, 同時, 褐藻膠裂解酶在防治肺囊性纖維化病及制備海藻原生質(zhì)體等方面也有重要作用[8-9],因此褐藻膠裂解酶的開發(fā)應(yīng)用引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注.

微生物是產(chǎn)褐藻膠裂解酶的主要類群,包括弧菌(Vibrio)、 產(chǎn)微球莖菌(Microbulbifer)、 假單胞菌(Pseudomonas)、 克雷伯氏菌(Klebsiella)、 白蟻菌(Isoptericola)、 黃桿菌(Flavobacterium)、 芽胞桿菌(Bacillus)等[10-18]. 但微生物來源不同其酶學(xué)性質(zhì)(最適溫度、 pH、 pI、 分子量、 底物特異性等)也會有所差異. 本研究以假交替單胞菌Pseudoalteromonassp. zb7-4發(fā)酵制備褐藻膠裂解酶,用于酶學(xué)性質(zhì)研究及酶動力學(xué)參數(shù)測定,為褐藻膠裂解酶的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 實驗材料

1) 菌株. 假交替單胞菌zb7-4(Pseudoalteromonassp. zb7-4),從舟山群島海水中分離獲得.

2) 主要試劑. ① 褐藻酸鈉購自西隴化工股份有限公司； DNS試劑參照文[19]配制. ② 2216E培養(yǎng)基： 蛋白胨5 g,酵母膏1 g,FeCl3·6H2O 0.018 g,人工海水溶解并定容至1 L,pH 7.0～7.2. ③ 發(fā)酵培養(yǎng)基： 褐藻酸鈉2 g,酵母膏2 g,蛋白胨2 g,(NH4)2SO43 g,人工海水溶解并定容至1 L,pH 7.0. ④ 4份人工海水： MgCl2·6H2O 8.4 g,MgSO4·7H2O 16.8 g,KCl 3.6 g,CaCl2·2H2O 5.48 g,NaCl 106 g,蒸餾水溶解并定容至1 L. ⑤ 緩沖液： 分別配制pH 4.0～7.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(0.1 mol·L-1Na2HPO4/ 0.1 mol·L-1檸檬酸),0.1 mol·L-1pH 7.0～9.0的Tris-HCl緩沖液,0.1 mol·L-1pH 9.0～11.0的甘氨酸-NaOH緩沖液.

3) 主要儀器設(shè)備. AKTA Pure系統(tǒng)和Hi TrapTMDEAE FF預(yù)裝柱,Spectrophotometer(1510,美國 Thermo Fisher Scientific公司)； 高速冷凍離心機(Lynx 4000,美國 Thermo Fisher Scientific公司)； 恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-2101C型,上海智城分析儀器制造有限公司).

2 實驗方法

2.1 褐藻膠裂解酶粗酶液制備

將假交替單胞菌zb7-4在2216E固體平板上劃線活化,30 ℃培養(yǎng)24 h； 挑取單菌落于50 mL的2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h (30 ℃,200 r ·min-1),以2%體積比轉(zhuǎn)接至發(fā)酵液體培養(yǎng)基(50 mL/250 mL)中,20 ℃、 200 r ·min-1搖瓶培養(yǎng)24 h. 將菌液于4 ℃、 10 kr ·min-1離心15～20 min,收集上清液即為褐藻膠裂解酶AlgL粗酶液.

2.2 褐藻膠裂解酶分離純化

利用10 ku中空纖維柱對粗酶液進行濃縮,濃縮液采用Hi TrapTMDEAE FF預(yù)裝柱進行分離,上樣和洗脫緩沖液均為20 mmol·L-1磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH6.5),用含有1 mol·L-1NaCl的上述緩沖液進行線性梯度洗脫(洗脫NaCl濃度55%,洗脫時間240 min),上樣流速為4 mL·min-1,洗脫流速為1 mL·min-1,每4 min收集1管,280 nm檢測收集蛋白[20]. SDS-PAGE檢測純度.

2.3 褐藻膠裂解酶比活力測定

采用Easy ⅡProtein Quantitative Kit測定蛋白濃度,DNS法測定酶活力[21],計算比活力. 酶活力單位定義： 每分鐘催化底物產(chǎn)生1 μmol 還原糖所需的酶量作為一個酶活力單位(U),比活力(U·mg-1)=酶活力(U·mL-1)/蛋白濃度(mg·mL-1).

2.4 褐藻膠裂解酶蛋白測序及序列分析

純化的褐藻膠裂解酶經(jīng)SDS-PAGE 電泳后,將單一條帶的膠割下送至廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分析測試中心進行LC-MSMS測序; 采用SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/interactive)在線對褐藻膠裂解酶AlgL進行三維建模； 用NCBI數(shù)據(jù)庫進行褐藻膠裂解酶AlgL的結(jié)構(gòu)域分析； 利用軟件Gromacs 5.0對AlgL的分子動力學(xué)曲線預(yù)測.

2.5 褐藻膠裂解酶最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

在50 ℃條件下,測定該酶在不同pH(4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11)緩沖液體系中的酶活力,以測定的最高酶活力為100%,計算不同pH下的相對酶活力,確定最適反應(yīng)pH.

將酶液與上述不同pH范圍的緩沖液按照一定比例混合,37 ℃水浴中保溫1 h,在最適反應(yīng)條件(50 ℃,緩沖體系pH=7.0)下測定酶活力. 以測得的最高酶活力為100%,計算褐藻膠裂解酶在各pH下的殘余酶活力.

2.6 褐藻膠裂解酶最適反應(yīng)溫度及其熱穩(wěn)定性

在pH=7.0的緩沖體系中,測定酶液在不同溫度(4、 30、 40、 50、 60、 70、 80 ℃)下的酶活力,以測定的最高酶活力為100%,計算不同溫度下的相對酶活力,確定最適反應(yīng)溫度.

將酶液分別于不同溫度水浴中保溫,并在相應(yīng)的時間點取樣,測定該酶在最適反應(yīng)條件(50 ℃,緩沖體系pH=7.0)下的酶活力,將未處理的酶液作為對照,計算各溫度條件下褐藻膠裂解酶的殘余酶活力.

2.7 褐藻膠裂解酶催化動力學(xué)參數(shù)測定

選取褐藻酸鈉、 聚古羅糖醛酸鈉(Poly G)和聚甘露糖醛酸鈉(Poly M)作為底物測定動力學(xué)參數(shù). 改變底物濃度,測定最適反應(yīng)條件下的酶活力,采用Lineweaver-Burk法以1/V對1/[S]作圖,計算動力學(xué)參數(shù)Km、Vmax及Kcat[12,22].

2.8 褐藻膠裂解酶熱失活動力學(xué)參數(shù)測定

參照酶熱穩(wěn)定性試驗,改變保溫溫度(323、 325、 327、 329 K)測定酶活力,計算不同溫度下酶的熱失活速率常數(shù)k[23],根據(jù)Arrhenius公式,酶熱失活反應(yīng)的速度常數(shù)k與反應(yīng)的活化能關(guān)系為：

(1)

以酶熱失活反應(yīng)速度的對數(shù)(lgk)對1/T作圖,得到直線關(guān)系圖,根據(jù)Eyring的絕對反應(yīng)速度理論,可以求出酶在不同溫度下熱失活的焓變(△H≠)、 自由能(△G≠)和熵變(△S≠).

其計算公式為：

(2)

其中: Ea為酶解反應(yīng)的活化能； R為氣體常數(shù)(8.314J·mol-1·K-1)； T為絕對溫度； k為在溫度T下酶熱失活反應(yīng)的速度常數(shù)； KB為Boltzmann常數(shù)(1.381×10-23J·K-1)； h為Plank常數(shù)(6.626×10-34J·s).

2.9 不同金屬離子對褐藻膠裂解酶活力的影響

在酶促反應(yīng)體系中分別添加終濃度為1和5mmol·L-1的13種金屬離子,以未添加金屬離子的酶促反應(yīng)組作為對照組,在最適反應(yīng)條件下測定酶活力.

2.10 NaCl濃度對褐藻膠裂解酶活力的影響

圖1 褐藻膠裂解酶AlgL的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analyses of alginate lyase AlgL

在酶促反應(yīng)體系中分別添加不同終濃度的NaCl,以未添加NaCl的酶促反應(yīng)組作為對照,在最適反應(yīng)條件下測定酶活力.

為檢測該酶的耐鹽性,將酶液分別置于濃度為2和3mol·L-1NaCl反應(yīng)體系中,37 ℃水浴保溫120min,并在不同時間點取樣測定其剩余酶活力.

3 結(jié)果與分析

3.1 褐藻膠裂解酶的分離純化

采用中空纖維柱濃縮、 硫酸銨分級沉淀、 離子交換層析、 凝膠色譜層析以及親和層析等方法分離純化褐藻膠裂解酶AlgL,最終發(fā)現(xiàn)經(jīng)10ku中空纖維柱濃縮和弱陰離子DEAE交換層析兩步分離,已達到電泳純(圖1). 該酶的相對分子質(zhì)量約為32ku. 采用DNS法測得該酶活力為15.07U·mL-1,在pH為7.0、 50 ℃條件下對0.4%褐藻酸鈉底物的比活力為(208.26±5.87)U·mg-1.

3.2 褐藻膠裂解酶最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性

以0.4% 褐藻酸鈉為底物,測得褐藻膠裂解酶的最適反應(yīng)pH=7.0 (圖2). 將該酶與不同pH緩沖液混合于37 ℃保溫60min,測定其剩余酶活力,結(jié)果(見圖2)顯示,在pH6.0～10.0殘留酶活力大于80%,表明該酶具有較寬廣的pH穩(wěn)定范圍.

3.3 褐藻膠裂解酶最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

以pH=7.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制0.4%的褐藻酸鈉底物,測定不同溫度下褐藻膠裂解酶AlgL活力,圖3顯示該酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃. 熱穩(wěn)定性試驗表明,該酶在40 ℃以下相對穩(wěn)定,殘留酶活力大于80%(圖3)； 溫度升高,酶活力明顯下降,溫度高于60℃時,該酶幾乎完全失活.

圖2 AlgL在不同pH時的酶活Fig.2 AlgL activity at different pH

圖3 AlgL在不同溫度時的酶活Fig.3 AlgL activity at different temperature

3.4 褐藻膠裂解酶催化動力學(xué)參數(shù)測定

褐藻膠裂解酶AlgL對聚甘露糖醛酸鈉(PM)、 聚古羅糖醛酸鈉(PG)和褐藻酸鈉三種底物的催化動力學(xué)參數(shù)見表1. 根據(jù)Km值的大小可以判斷酶對底物的親和力強弱,由結(jié)果可知該酶對3種底物的親和力大小為：PG>PM>褐藻酸鈉； Kcat是酶的催化常數(shù),酶催化底物的能力大小順序為PM>褐藻酸鈉>PG,說明AlgL是PM偏好型的雙功能酶,作用于聚甘露糖醛酸片段的效果大于聚古羅糖醛酸片段.

表1 AlgL對不同底物的米氏常數(shù)和特異性Tab.1 Kinetic constants of AlgL for hydrolysis of various substrates

3.5 褐藻膠裂解酶熱失活動力學(xué)參數(shù)測定

紅色部分為209至217位氨基酸片段圖4 褐藻膠裂解酶AlgL三維結(jié)構(gòu)圖 Fig.4 Three-dimensional structures of alginate lyase AlgL

經(jīng)LC-MSMS測序獲得純化酶AlgL蛋白序列,利用SWISS-MODEL在線進行同源建模,以細菌Pseudoalteromonassp. SM0524來源的蛋白(PDB編號為4q8k.1.A)為模板,對AlgL中第174～400個氨基酸進行結(jié)構(gòu)模擬,得到一個高同源性的蛋白結(jié)構(gòu)(相似性99%,見圖4),序列一致性達100%. 利用Gromacs 5.0對AlgL的分子動力學(xué)曲線進行預(yù)測,結(jié)果見圖5. RMSF值的高低表明該氨基酸構(gòu)象的穩(wěn)定性,Gln209-Gly217氨基酸的RMSF值最高,柔性較大,構(gòu)象不穩(wěn)定,并且其位于AlgL的催化活性中心Asp197-Glu385,該段構(gòu)象不穩(wěn)定的區(qū)段(見圖4紅色線型)很可能影響到蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性. 對此,測定了AlgL在不同絕對溫度(323、 325、 327、 329 K)反應(yīng)體系中,酶活隨時間變化曲線(見圖6),測得失活速率常數(shù),從而計算出該酶在不同溫度下的熱失活動力學(xué)參數(shù),包括活化能(Ea)、 焓(ΔH≠)、 自由能(ΔG≠)和熵(ΔS≠),純化酶AlgL的Ea為328.527 kJ·mol-1,隨著絕對溫度升高,該酶的失活速率常數(shù)k逐漸增大,ΔH≠和ΔG≠逐漸降低而ΔS≠的數(shù)值保持相對穩(wěn)定(見表2).

圖5 AlgL酶蛋白分子動力學(xué)模擬結(jié)果Fig.5 Results of the kinetics calculate of AlgL

圖6 AlgL的溫度穩(wěn)定性Fig.6 Temperature stability of AlgL表2 AlgL的熱失活動力學(xué)參數(shù)Tab.2 Thermal inactivation kinetics parameters of AlgL

T/Kk/s-1Ea/kJ·mol-1ΔH≠/kJ·mol-1ΔG≠/kJ·mol-1ΔS≠/kJ·mol-13230.635×10-3328.527325.84299.0910.7023251.250×10-3328.527325.82597.8920.7013272.680×10-3328.527325.80896.4370.7013295.875×10-3328.527325.79294.8970.702

3.6 金屬離子及化學(xué)試劑對褐藻膠裂解酶活力的影響

13種氯化物金屬離子對AlgL活性的影響見表3. 終濃度為1 mmol·L-1時,Cu2+、 Cr3+、 Co2+、 Ba2+、 Sr2+、 Hg2+對該酶具有不同程度的抑制作用,Hg2+抑制作用最為明顯； Ca2+、 Mg2+、 Zn2+、 Fe3+對該酶具有一定促進作用,但促進程度較低； 終濃度為5 mmol·L-1時,Cu2+、 Cr3+、 Co2+、 Ba2+、 Sr2+、 Hg2+、 Fe3+、 Ni2+、 Ca2+對該酶的抑制作用增強,在Hg2+作用下酶幾乎完全失活.

表3 金屬離子對AlgL活性的影響Tab.3 Effects of metal ions on AlgL activity

3.7 不同濃度NaCl對褐藻膠裂解酶活力的影響

由于本研究的褐藻膠裂解酶來自于海洋環(huán)境,因此分析了NaCl濃度對AlgL活力的影響. 結(jié)果表明,該酶在0～1 mol·L-1NaCl反應(yīng)體系中,隨著NaCl濃度升高,酶活力增大(相對酶活力達134.8%)； NaCl濃度繼續(xù)升高,酶活力明顯下降(見圖7(a)). 鹽耐受性實驗表明,該酶在不同濃度(2、 3 mol·L-1) NaCl反應(yīng)體系中保溫2 h,酶活力保持在66%以上(見圖7(b)),這可能與該酶產(chǎn)生菌的生存環(huán)境相適應(yīng).

圖7 NaCl濃度對AlgL活力的影響Fig.7 Effects of NaCl on AlgL activity and stability

4 討論

以Pseudoalteromonassp. zb7-4發(fā)酵制備褐藻膠裂解酶粗酶液,從中分離純化出褐藻膠裂解酶AlgL,表觀分子質(zhì)量約為32 ku,其與海洋細菌來源的褐藻膠裂解酶性質(zhì)相符[24]； 比活力為(208.26±5.87)U·mg-1,高于已報道孫麗萍等[25]從銹凹螺中分離純化出的褐藻膠裂解酶(33.3 U·mg-1).

純化酶AlgL的酶學(xué)性質(zhì)研究表明： 該酶最適反應(yīng)pH為7.0,最適反應(yīng)溫度為50 ℃,在pH 6.0～10.0、 40 ℃以下穩(wěn)定性較好, 但AlgL在高于50 ℃時酶活力明顯降低. 測定了其高溫變性的熱力學(xué)參數(shù),計算發(fā)現(xiàn)該酶最不穩(wěn)定肽段位于催化中心內(nèi)部,表明溫度對該酶的催化中心構(gòu)象的穩(wěn)定性具有十分顯著的影響. 熱力學(xué)參數(shù)反映的酶失活速率也體現(xiàn)出溫度對酶活性的影響機理,即在較低溫度下溫度升高酶活性中心柔性加大,使對底物催化效率增加,但較高溫度下(如325 K)活性中心構(gòu)象由于柔性較高容易受高溫作用失去作用于酶催化底物水解所需空間構(gòu)型,從而導(dǎo)致酶熱變性失活.

另外,研究了金屬離子對AlgL活性的影響,發(fā)現(xiàn)Cu2+、 Cr3+、 Co2+、 Ba2+、 Sr2+、 Hg2+對該酶具有不同程度的抑制作用,Hg2+抑制作用最為明顯； 但具有較好的耐鹽性,對降解海藻廢物再利用及開發(fā)生物能源有著重要意義[26]； 測定該酶對褐藻酸鈉、 PG、 PM三種底物的酶促反應(yīng)參數(shù)Km值、Vmax值、Kcat值表明,AlgL對PG具有很好的親和力但對PM具有較高的催化效率,AlgL活性與底物親和力大小并沒有直接關(guān)系； 結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)AlgL具有典型的結(jié)合底物的CBM區(qū)域和催化中心域,通過本研究發(fā)現(xiàn)獲得的AlgL的CBM片段與PG結(jié)合能力最好. 但另一方面,Kcat測定發(fā)現(xiàn)AlgL的催化中心結(jié)構(gòu)域?qū)M的水解能力最高,這與Vibriosp. W13[27]來源的褐藻膠裂解酶表現(xiàn)出的動力學(xué)參數(shù)是相似的,這也為后續(xù)分子結(jié)構(gòu)的改造奠定理論基礎(chǔ).

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