羅非魚魚鱗膠原多肽的優(yōu)化制備及其生物活性研究

李 靈,徐梁棕,汪少蕓

(福州大學生物科學與工程學院,福建 福州 350116)

0 引言

我國是羅非魚養(yǎng)殖大國,羅非魚的加工主要以羅非魚片為主,由此產生的下腳料魚鱗通常作為廢棄物處理,不僅浪費資源,且污染環(huán)境[1]. 有研究表明,魚鱗富含膠原蛋白和角蛋白等硬蛋白[2],其中膠原蛋白可廣泛應用于生物材料、 組織工程、 醫(yī)療、 食品、 化妝品、 飼料等領域. 利用酸、 堿或者酶使膠原蛋白降解形成膠原多肽,它比膠原蛋白在消化吸收、 營養(yǎng)、 功能特性等方面都有顯著提高. 近年來,已經有許多關于魚皮膠原蛋白和魚鱗膠原蛋白的提取和生物活性如抗氧化性[3-5],低溫保護活性[6-8],降血壓活性[9]等方面的報道,但利用蛋白酶直接酶解魚鱗制備多肽的工藝研究報道較少. 本研究以羅非魚魚鱗為原料,經超聲和高溫預處理后, 以水解度和DPPH自由基清除率為指標, 利用響應面分析法對羅非魚魚鱗酶解工藝進行優(yōu)化,得到羅非魚魚鱗膠原多肽最佳提取工藝,測定凍干后的酶解多肽的抗氧化活性和細菌低溫保護活性,同時分析其氨基酸組成及相對分子質量分布.

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚鱗,購自廈門源水食品有限公司； 復合風味蛋白酶,購自廣州市華琪生物技術有限公司； 堿性蛋白酶、 中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 胰蛋白酶,購自上海諾維信公司； M17 肉湯培養(yǎng)基,購自青島高科園海博生物技術有限公司； 1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),分析純,購自美國Sigma公司； FeSO4、 水楊酸、 H2O2,購自國藥集團化學試劑有限公司； 嗜熱鏈球菌由上海交通大學農業(yè)與生物學院提供； 其他試劑均為國產分析純.

1.2 主要儀器

HC-700高速多功能粉碎機(永康市天祺盛世工貿有限公司)； KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)； XZ-21K高速冷凍離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)； UV-2600紫外可見分光光度計(上海UNICO設備公司)； FE20 pH計(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)； AUY120電子天平(日本島津公司)； FD-1C-50冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司). YXQ-LS-50S立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊醫(yī)療設備廠)； SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(上海蘇凈實業(yè)有限公司)； 海爾醫(yī)用低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 羅非魚魚鱗酶解工藝流程

魚鱗→清洗,烘干→粉碎成絮狀→50 ℃,200 W功率超聲90 min→121 ℃,0.1 MPa高溫處理1 h→冷卻→調節(jié)pH值→加酶水解→沸水浴滅酶→離心→上清液→冷凍干燥→樣品

1.3.2 中心組合試驗設計

表1 響應面法的因素水平編碼表Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

在單因素試驗基礎上,得到酶添加量2.14 mg·mL-1(其中胰蛋白酶1.44 mg·mL-1,堿性蛋白0.70 mg·mL-1),酶解pH值8.5,且通過SPSS軟件分析得到這兩個因素對酶解效果影響不顯著； 而底物質量濃度、 酶解溫度和酶解時間3個因素對酶解效果影響顯著. 因此將這3個因素作為響應面的優(yōu)化因子,根據(jù)Box-Behnken 實驗中心設計原理,利用軟件Design-Expert V8.0.6 對實驗結果進行響應面分析(見表1),獲得羅非魚魚鱗最佳酶解工藝條件.

1.3.3 水解液游離氨基酸總量

酶解液水解度的測定參照甲醛滴定法[10].

1.3.4 樣品的冷凍干燥

根據(jù)最佳酶解條件酶解羅非魚魚鱗,之后以10 000 r·min-1離心10 min,收集上清液,冷凍干燥得到魚鱗膠原多肽粉末.

1.3.5 抗氧化活性測定

DPPH自由基清除活力參照Wu等[11]的方法進行測定. 用95%(體積分數(shù),以下同)乙醇配置DPPH·固體粉末最終得到濃度為0.1 mmol·L-1的溶液,避光保存?zhèn)溆? 用超純水溶解膠原多肽粉末,分別配成濃度為0.2～10 mg·mL-1樣品,然后取1 mL的各濃度樣品與1 mL DPPH·溶液充分混勻,室溫避光靜置30 min,517 nm測定吸光值； 用1 mL 95%乙醇溶液代替DPPH·溶液為樣品參比組； 空白組為1 mL DPPH·溶液與1 mL 95%乙醇溶液. 樣品的DPPH自由基清除活力根據(jù)下式進行計算：

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

其中：Ai表示樣品組吸光值；Aj表示樣品參比組吸光值；A0表示空白組吸光值.

羥基自由基清除率按Zhang[3]的方法測定. 用超純水將膠原多肽粉末配成濃度為0.2～10 mg·mL-1的樣品,分別取1 mL各濃度樣品與0.3 mL濃度為8 mmol·L-1的FeSO4、 1 mL濃度為3 mmol·L-1的水楊酸以及0.25 mL濃度為20 mmol·L-1的H2O2混勻,37 ℃保溫30 min,流水冷卻后,加入0.45 mL蒸餾水使反應液總體積達3 mL,4 884 r·min-1離心10 min,于510 nm波長下測定上清液吸光值,蒸餾水代替樣品作為空白對照.

羥基自由基清除率(%)=[(Acontrol-Asample)/Acontrol]×100

1.3.6 細菌低溫保護活性

從新鮮的斜面保菌管上接種嗜熱鏈球菌到M17培養(yǎng)基中,活化18 h作為種子液； 再將嗜熱鏈球菌以0.5%的體積比例從種子液接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h,此時菌液的OD600=1.25,取1 mL菌液梯度稀釋至10-5,從中取100 μL菌液再加入900 μL膠原多肽溶液混勻,取40 μL涂布,每個樣品做兩個平行,37 ℃倒置培養(yǎng)24 h,進行菌落計數(shù). 剩余部分于-20 ℃下放置24 h后,按照如前步驟涂布、 培養(yǎng)、 計數(shù). 參照Wang等[12]方法,根據(jù) NA/NB×100%計算存活率,NA是冷凍前菌落數(shù),NB為冷凍后菌落數(shù).

1.3.7 氨基酸組成測定

采用上海交通大學分析測試中心全自動氨基酸分析儀(L-8900,Hitachi 公司). 樣品前處理： 稱樣品于水解管中,加入6 mol·L-1HCl,抽真空吹氮氣,重復3 次后封口,110 ℃水解24 h. 轉移定容后過濾,取濾液在加NaOH 的真空干燥器中蒸干,加鹽酸溶解,上機測定. 色譜柱尺寸： 4.6 mm×60 mm,3 μm； 樹脂： Hitachi 公司氨基酸分析儀專用陽離子交換樹脂； 上樣量為20 μL.

1.3.8 HPLC測定相對分子質量

采用江南大學食品科學與技術國家重點實驗室Waters TM650E 高效液相色譜儀(配2487 紫外檢測器和M32工作站)； 色譜柱： TSKgel 2000 SWXL(300 mm×7.8 mm)； 流動相: 乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1(體積比)； 檢測波長： UV 220 nm； 流速： 0.5 mL·min-1； 柱溫： 30 ℃.

2 結果與分析

2.1 響應面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結果,以DPPH自由基清除率為主要指標,水解度DH為輔助指標作為響應值進行響應面優(yōu)化試驗,實驗方案及結果見表2.

釆用Design Expert 8.05軟件對表2中試驗結果進行方差分析和多元回歸擬合(見表3、 4),分別得到水解度DH和DPPH自由基清除率隨底物質量濃度、 酶解溫度和酶解時間變化的回歸方程:

DH(%)=15.71+0.22×A-0.32×B+0.84×C-0.19×AB-0.34×AC+0.31×BC-0.64×A2-0.80×B2-1.18×C2

DPPH(%)=89.72+0.045×A-0.19×B+1.31×C+0.027×AB+0.18×AC+0.70×BC-0.72×A2-0.81×B2-1.78×C2

為了檢驗模型的實際有效性,對結果進行方差分析與顯著性檢驗,結果見表3、 4. 對回歸方程的失擬項檢驗：F=3.55,P=0.126 4>0.05 和F=0.80,P=0.553 6>0.05,差異不顯著； 通過對兩表分析可知,兩個模型的P分別為0.000 4和0.000 6,說明這兩個模型極顯著； 對水解度和DPPH自由基清除率的回歸方程進行顯著性檢驗,發(fā)現(xiàn)兩個模型的相關系數(shù)分別為R2=0.961 8>0.95 和R2=0.956 6>0.95,說明模型擬合程度較好. 分析這兩個模型各個系數(shù)的P值,發(fā)現(xiàn)因素C、A2、B2、C2對水解度的影響較顯著(P<0.01),因素B對水解度的影響顯著(P<0.05)； 因素C、C2對DPPH自由基清除率的影響極顯著(P<0.001),因素B、BC、A2、B2對DPPH自由基清除率影響顯著(P<0.05). 表明酶解溫度和酶解時間對羅非魚魚鱗酶解效果的主效應明顯.

表2 響應面試驗方案與試驗結果Tab.2 Experimental design and results of response surface methodology

表3 回歸模型的方差分析(水解度為響應值)Tab.3 Variance analysis of the regression mode(DH as response value)

注：P<0.001代表極顯著***；P<0.01代表較顯著**；P<0.05代表顯著*；P>0.05代表不顯著

表4 回歸模型的方差分析(DPPH自由基清除率為響應值)Tab.4 Variance analysis of the regression mode (DPPH free radical scavenging rate as response value)

續(xù)表4 Continue table 4

注：P<0.001代表極顯著***；P<0.01代表較顯著**；P<0.05代表顯著*；P>0.05代表不顯著

由Design Expert 8.0.6軟件優(yōu)化得到酶解條件, 再結合單因素優(yōu)化得到的酶添加量和酶解pH值, 得到的最優(yōu)工藝為： 底物質量濃度30.6 mg·mL-1,酶添加量2.14 mg·mL-1,酶解pH值8.5,酶解溫度50 ℃,酶解時間6.35 h,其理論水解度DH為15.88%,對DPPH自由基的清除率高達87.95%. 通過3次平行試驗后測得最佳條件下水解度為(15.78±0.1)%,DPPH自由基清除率為(87.09±0.39)%,與預測值相近,這說明了回歸方程與實際情況擬合良好,通過響應面優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)可靠、 有效,能較好預測羅非魚魚鱗酶解產物的水解度與DPPH自由基清除率.

2.2 羅非魚魚鱗酶解產物抗氧化活性

圖1顯示多肽復合物對DPPH·和·OH清除能力. 由圖1可知,羅非魚魚鱗膠原多肽有較高的DPPH·和·OH清除能力,清除率隨多肽質量濃度的升高而呈逐漸升高趨勢. 當質量濃度為7.0 mg·mL-1時,對DPPH·和·OH的清除率達到89.59%和68.95%； 同時多肽對DPPH·的半數(shù)清除質量濃度(IC50)為2.89 mg·mL-1,對·OH的IC50為3.54 mg·mL-1. 實驗結果與陳星星等[13]研究得到的羅非魚肉及組分蛋白的酶解液對DPPH·和·OH的半數(shù)清除活性結果較一致； 王雨生等[14]研究了黃鰭金槍魚皮膠原肽的抗氧化活性,其DPPH·和·OH的IC50分別為0.43和0.39 mg·mL-1,與之相比,本研究膠原肽的抗氧化活性較低,可能因為酶解產物是粗提物所致.

圖1 多肽復合物對DPPH自由基和羥基自由基清除能力Fig.1 Scavenging activity of peptide complexes on DPPH radical and hydroxyl radical

2.3 羅非魚魚鱗酶解產物細菌低溫保護活性

圖2為低溫處理前后添加空白對照(蒸餾水)、 不同質量濃度膠原多肽(1、 5、 10 mg·mL-1)和20 mg·mL-1蔗糖(商業(yè)抗凍劑)的嗜熱鏈球菌的生長情況. 由圖2可知,未經低溫處理時,對照組和實驗組對應的平板都長出了較多嗜熱鏈球菌的菌落,經過24 h低溫處理后,空白對照組平板的菌落數(shù)顯著下降,而不同質量濃度多肽復合物組和20 mg·mL-1蔗糖組仍有部分嗜熱鏈球菌菌落長出,這表明不同質量濃度酶解產物組和20 mg·mL-1蔗糖在低溫下對嗜熱鏈球菌有保護作用.

圖2 低溫處理前后添加多肽復合物的嗜熱鏈球菌生長情況Fig.2 Growth of bacteria before and after cold treatment with the addition of peptide complexes

圖3 多肽復合物對嗜熱鏈球菌存活率的影響Fig.3 Effect of peptide complexes on the viability of Streptococcus thermophiles

圖3為空白對照、 不同質量濃度多肽復合物和20 mg·mL-1蔗糖的嗜熱鏈球菌低溫保護活性. 由圖3可知,加無菌水和20 mg·mL-1蔗糖的對照組經過-20 ℃、 24 h的低溫處理后存活率分別為21.2%和61.3%,而添加了1、 5、 10 mg·mL-1的多肽復合物實驗組的嗜熱鏈球菌存活率分別達到75.6%、 82.8%和86.1%,與阮功成等[15]利用堿性蛋白酶水解膠原蛋白得到的復合物對大腸桿菌的低溫保護效果相比,羅非魚鱗酶解物對乳酸菌的低溫保護活性相對較好. 同時,本研究制備得到的膠原肽的抗凍活性低于趙珺等[16]從鯊魚皮明膠中制備的抗凍多肽,有可能是因為酶解產物為粗提物,未經過分離純化. 這表明多肽復合物在低溫下對嗜熱鏈球菌有一定的保護作用,且保護效果優(yōu)于商業(yè)抗凍劑.

2.4 羅非魚魚鱗酶解產物的相對分子質量分布

通過HPLC測定羅非魚魚鱗經復合酶解后多肽的相對分子質量分布,結果如圖4所示. 多肽復合物主要由相對分子質量小于2 000 u(見圖4(a))的小肽組成,主要分布在180～2 000 u之間,共占78%左右(見圖4(b)). 因此,多肽復合物富含由10個氨基酸組成的低聚肽,短肽更有利于發(fā)揮抗氧化和低溫保護細胞等生物活性.

圖4 多肽復合物相對分子質量分布圖Fig.4 Molecular mass distribution profile of peptide complexes as determined by HPLC

2.5 羅非魚魚鱗酶解產物氨基酸組成

表5 多肽復合物的氨基酸組成分析Tab.5 Amino acid compositions of peptide complexes (%)

膠原蛋白一級結構由許多重復單元(Gly-X-Y)n組成,其中X和Y是除Gly之外的任意氨基酸,X多為Pro,Y多為Hyp. 酶解產物中氨基酸組成的測定結果如表5所示,其中甘氨酸(Gly)、 脯氨酸(Pro)和羥脯氨酸(Hyp)的質量百分含量最豐富,這與膠原蛋白氨基酸組成的特點相一致. 同時可以發(fā)現(xiàn)酶解產物中丙氨酸(Ala)、 谷氨酸(Glu)、 精氨酸(Arg)、 天冬氨酸(Asp)和絲氨酸(Ser)的質量百分含量較豐富. Duman等[17]研究發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白或冰結構蛋白的抗凍活性與Gly、 Ala、 Thr、 Asp、 Ser相關,這些氨基酸可能是提高多肽復合物抗凍活性的關鍵. 張英等[18]研究了19種氨基酸對超氧陰離子和羥基自由基的抑制作用,結果發(fā)現(xiàn)Tyr、 Asp、 Lys、 Glu、 Met、 Gly和Asn等氨基酸對自由基的清除能力較強,而本實驗中發(fā)現(xiàn)這類氨基酸的質量百分含量達48.35%,從而使魚鱗膠原多肽具有較強抗氧化活性.

3 結語

采用響應面試驗設計優(yōu)化堿性蛋白酶和胰蛋白酶復合酶解制備羅非魚魚鱗活性肽,得到的最優(yōu)制備條件為： 底物質量濃度30.6 mg·mL-1,酶添加量2.14 mg·mL-1,酶解時間6.35 h,酶解pH值8.5,酶解溫度50 ℃. 在此條件下制備得到的膠原多肽水解度為15.88%,DPPH自由基清除率達到87.95%. 羅非魚魚鱗膠原肽對DPPH自由基和羥基自由基半數(shù)清除濃度(IC50)分別為2.89和3.54 mg·mL-1,表現(xiàn)出較好的抗氧化活性. 在細菌低溫保護活性實驗中,該膠原肽分別與空白對照和20 mg·mL-1蔗糖相比, 表現(xiàn)出了對嗜熱鏈球菌較顯著的低溫保護活性(P<0.01). 膠原肽相對分子質量主要分布在180～2 000 u之間,占總量的78%左右,富含甘氨酸(Gly)、 丙氨酸(Ala)、 脯氨酸(Pro)和羥脯氨酸(Hyp),與膠原蛋白氨基酸組成特點相一致. 羅非魚魚鱗酶解物的抗氧化活性和乳酸菌低溫保護活性表明,其具有在醫(yī)藥和食品行業(yè)中作為抗氧化劑和商業(yè)抗凍劑的潛力.

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