香魚HSP90β的克隆、序列特征及表達分析

默立賓, 李長紅, 陳 炯

(寧波大學 海洋學院， 寧波 315211)

熱應激蛋白(heat shock proteins, HSPs)是指細胞在不利環(huán)境因素刺激原特別是高溫環(huán)境下誘導生成的一類特殊蛋白質。HSPs結構高度保守, 廣泛存在于生物體內。根據序列特征及典型分子質量大小, 脊椎動物的HSPs被分為3個大的家族, 包括小HSPs(16～24 ku)、HSP70(68～73 ku)和HSP90(85～90 ku)[1-2]。HSP是一個多功能蛋白, 當環(huán)境發(fā)生異常變化時, HSPs通過阻止非天然蛋白的聚合、促進新合成蛋白的折疊、穩(wěn)定和復性受損蛋白以及促進非天然或聚合蛋白進入降解途徑等方式發(fā)揮細胞防御功能[3]。HSP90家族廣泛表達, 非應激條件下, 約占細胞內總蛋白的1%～2%[4]。目前, HSP90家族蛋白主要分為4類, 包括2個位于細胞質的HSP90AA(也稱HSP90α或可誘導型)和HSP90AB(也稱HSP90β或組成型)亞型、位于內質網的HSP90B亞型Grp94 (葡萄糖調節(jié)蛋白94, 94 ku glucose-regulated protein)以及位于線粒體基質的HSP90同系物TRAP1(腫瘤壞死因子調節(jié)蛋白1, tumor necrosis factor receptor-associated protein-1)[5-6]。

越來越多的研究揭示, HSP90與環(huán)境脅迫密切相關, 主要表現為不同環(huán)境因子下HSP90被不同程度地誘導表達或抑制表達。例如，高溫脅迫[7-10]、鹽度脅迫[7, 11]、食物缺乏[12]、低氧脅迫[13]、有機物污染[14]、砷酸鹽[15]、重金屬[14, 16-17]以及病原微生物感染[10, 18-19]等均能對HSP90表達產生影響。因此，HSP90有望被開發(fā)為環(huán)境監(jiān)測領域新的生物標記分子。目前,HSP90已在包括大西洋鮭(Salmosalar)[7]、草魚(Ctenopharyngodonidella)[9]、鮸魚(Miichthysmiiuy)[10]、史氏鱘(Acipenserschrenckii)[13]、塞內加爾鰨(Soleasenegalensis)[20]和團頭魴(Megalobramaamblycephala)[21]等在內的數種魚類中得到克隆及鑒定。

香魚(Plecoglossusaltivelis, ayu)隸屬胡瓜魚目香魚科, 是東亞地區(qū)中國、日本和朝鮮等國特有的小型名貴經濟魚類。在浙江, 野生香魚主要分布于象山港以南的浙江中部和南部的河川溪流中, 其中寧海鳧溪和南北雁蕩山等地的尤為著名[22]。香魚對環(huán)境水質的要求極高, 尤其對水體污染高度敏感, 可作為反映地方生態(tài)環(huán)境的評價指標。本研究擬對香魚HSP90β(PaHSP90β)進行研究, 明確其序列、結構、進化關系及mRNA組織分布, 并通過測定重金屬及鹽度脅迫對其 mRNA表達的影響, 分析PaHSP90β與環(huán)境適應的相關性, 為進一步研究香魚在抵抗環(huán)境變化方面的分子作用機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

健康香魚購自浙江寧?？h鳧溪陳家香魚養(yǎng)殖場, 體重20～30 g, 暫養(yǎng)于充分曝氣的自來水中, 水溫(20±1)℃。大腸桿菌(Escherichiacoli) TG1由實驗室保存; T4DNA連接酶、pMD19-T Simple Vector、LATaqDNA聚合酶、RNAiso Reagent、AMV逆轉錄酶和SYBRPremixExTaq試劑盒等購自TaKaRa公司(日本); Gel Extraction Kit購自Omega公司(美國)。引物合成、測序由英維捷基貿易有限公司(上海)完成。

1.2 PaHSP90β cDNA序列獲得及序列分析

從香魚肝cDNA文庫中獲得PaHSP90βcDNA序列, 并通過PCR擴增、TA克隆和序列測定進行驗證。同源蛋白序列比對采用BLASTP 軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), 蛋白分子質量大小及等電點預測采用Compute pI/Mw程序 (http://web.expasy.org/compute_pi/), 信號肽序列預測采用SignalP 4.1軟件 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 保守結構域預測采用SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)和PROSITE軟件(http://kr.expasy.org/prosite/)。多重序列比對采用ClustalW軟件(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/), 系統(tǒng)進化樹構建采用MEGA 5.0軟件[23]。氨基酸多重序列比對及進化樹構建所用序列詳見表1。

表1 多重比對及系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建采用序列

注：a和b分別表示虹鱒HSP90β的2個亞型；下同

1.3 健康香魚樣品采集

暫養(yǎng)2周后, 隨機選取 5 尾香魚, 分別取肝、脾、腎、腦、心、鰓、肌肉和腸8個組織,分別置于1.5 mL離心管中并立即投入液氮中, 全部收集完畢后轉存-70℃超低溫冰箱保存。

1.4 香魚鎘脅迫

實驗設置對照組和鎘脅迫組, 對照組香魚飼養(yǎng)于無鎘的曝氣自來水中, 鎘脅迫組以5.0 mg/L的鎘濃度蓄養(yǎng)香魚[24]。實驗開始后分別于4、8、12和24 h采集兩組香魚的肝、脾、腎、鰓和腸等組織樣品, 每組每次取4尾香魚。組織收集方法同上。

1.5 香魚鹽度脅迫

實驗設置對照組和鹽度脅迫組, 對照組香魚飼養(yǎng)于曝氣自來水中, 鹽度脅迫組香魚在淡水中暫養(yǎng)2 周后, 采用3 d 內逐步升高鹽度的方式到達指定鹽度10‰[25]。實驗開始后于7、14和21 d時分別取兩組香魚的肝、脾、腎、鰓和腸等組織樣品。組織收集方法同上。

1.6 不同組織中PaHSP90β mRNA的表達

采用qPCR分析健康香魚不同組織中PaHSP90βmRNA的表達, 鎘脅迫以及鹽度脅迫后不同時間點PaHSP90β在各組織中轉錄水平的變化?？俁NA的抽提、DNase I處理、第一鏈cDNA的合成及qPCR檢測參考黃左安等[26]的方法進行。根據獲得的PaHSP90β全序列設計qPCR引物, 引物序列如下：PaHSP90β(+): 5′-TGACAAAGCGGTGAAGGACT-3′和PaHSP90β(-): 5′-TTAGTCCACTTCCTCCATGC-3′, 預期擴增片段為240 bp。以香魚β-actin作為內參[27],β-actin登錄號為AB020884。每個樣品重復檢測3次, 包括PaHSP90β和β-actin。利用相對熒光定量PCR法[28]對定量結果進行計算，分析各樣本PaHSP90βmRNA的相對表達。實驗結果采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA), 以P<0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 PaHSP90β cDNA序列分析

PaHSP90βcDNA序列長2726 bp(GenBank登錄號為：KY073361)，包括一個完整ORF，起始于第114～116 位的一個起始密碼子ATG，終止于2286～2288位的一個終止密碼子TAA，預測編碼1個含有724個氨基酸、分子質量約為83.30 ku的蛋白，理論等電點為4.83，N-末端無信號肽序列(圖1)。對香魚及其他魚類的HSP90β氨基酸序列進行分析，發(fā)現均具有HSP90 家族的5個保守信號區(qū)(圖1，分別標記為Ⅰ～Ⅴ)。根據SMART 軟件推測，PaHSP90β在34～188處具有HATPase(histidine kinase-like ATPases)結構域(圖1)。通過PROSITE工具預測，PaHSP90β在32～41位存有HSP90蛋白家族信號(Heat shock hsp90 proteins family signature) YsNKEIFLRE(圖1)。

序列分析表明, PaHSP90β與其他魚類HSP90β具有較高的氨基酸序列同源性 (89.7%～95.8%), 其中與白鮭HSP90β同源性最高, 達95.8%, 其次是虹鱒HSP90β亞型a, 同源性為95.3%。系統(tǒng)進化樹分析表明, 哺乳動物、鳥類、爬行類、兩棲類和魚類的HSP90β分別成簇, PaHSP90β位于魚類HSP90β簇中, 且與白鮭、大西洋鮭及虹鱒形成一個小簇, 與白鮭HSP90β進化相關性最高(圖2)。

圖2 基于鄰接法構建各物種全長HSP90β氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

分支上數值為重復抽樣1000次得到的置信度, 僅大于60%的顯示；標尺表示每一位點發(fā)生0.1次置換；各物種全長HSP90β氨基酸序列的登錄號見表1

2.2 PaHSP90β mRNA組織差異表達特征

QPCR檢測結果表明, 健康香魚PaHSP90βmRNA在肝中表達量最豐富, 其次是脾, 在腎、腦、心、鰓和腸中表達量相對較少, 在肌肉中表達量微弱(圖3)。

圖3 健康香魚PaHSP90β mRNA的組織表達特征

1～8分別為：肝臟、脾、腎、腦、心、鰓、肌肉和腸；以PaHSP90β與β-actinmRNA的比值作為PaHSP90βmRNA的相對表達量；n=5

2.3 鎘脅迫對香魚各組織PaHSP90β mRNA表達的影響

與對照組相比，鎘處理4 h時，肝、脾、腎、鰓和腸中PaHSP90βmRNA的表達量顯著增加，分別為對照組的15.51、2.39、8.70、1.68和7.17倍(P<0.05)；在8 h時，肝PaHSP90βmRNA表達量開始降低，但仍顯著高于對照組，腎、鰓和腸中PaHSP90βmRNA表達量達到峰值，分別為對照組的33.23、5.73和13.80倍(P<0.05)；在12 h，肝中PaHSP90βmRNA表達量繼續(xù)降低，在24 h時與對照組無明顯差異，腎和腸中PaHSP90βmRNA仍顯著高于對照組，鰓中PaHSP90βmRNA表達量與對照組無明顯差異，脾中PaHSP90βmRNA顯著高于對照組，為對照組的2.55倍(P<0.05)(圖4)。

圖 4 鎘脅迫對香魚各個組織PaHSP90β mRNA表達的影響

A：肝; B：脾; C：腎; D：鰓; E：腸。以PaHSP90β與β-actinmRNA的比值作為PaHSP90βmRNA的相對表達量。*：與對照組比較差異顯著(P<0.05)；n=4

2.4 鹽度脅迫對香魚各組織PaHSP90β mRNA表達的影響

與對照組相比，鹽度脅迫7 d時，肝、脾、腎和鰓中PaHSP90βmRNA的表達量顯著增加，分別為對照組的2.28、3.8、2.63和1.68倍(P<0.05)；在14 d時，肝PaHSP90βmRNA表達量開始降低，21 d時與對照組無明顯差異，而脾和腎中PaHSP90βmRNA表達量繼續(xù)增加，達到峰值，分別為對照組的4.73和4.81倍(P<0.05)，然后開始降低，21 d時脾PaHSP90βmRNA表達量與對照組相比無明顯差異，但腎PaHSP90βmRNA表達量仍顯著高于對照組，為對照組的2.25倍；在14 d時，鰓中PaHSP90βmRNA表達量顯著低于對照組，為對照組的2.36倍，21 d時與對照組相比均無明顯差異。在整個脅迫期間，腸中PaHSP90βmRNA的表達與對照組相比差異均不顯著(圖5)。

3 討論

HSP90家族蛋白結構高度保守, 廣泛表達, 非應激條件下呈組成型表達, 除具有“分子伴侶”(molecular chaperones)重要的“細胞管家”作用, 還參與協(xié)同免疫、調控細胞凋亡、應激損傷和炎癥保護等生理過程。本文通過香魚肝cDNA文庫測序獲得了PaHSP90β全長cDNA序列。氨基酸序列分析顯示, PaHSP90β與白鮭HSP90β同源性最高, 達95.8%。系統(tǒng)進化樹分析表明, 哺乳動物、鳥類、爬行類、兩棲類和魚類的HSP90β分別成簇, PaHSP90β位于魚類HSP90β簇中, 與白鮭HSP90β進化相關性最高。

圖5 鹽度脅迫對香魚各個組織PaHSP90β mRNA表達的影響

A：肝; B：脾; C：腎; D：鰓; E：腸。以PaHSP90β與β-actinmRNA的比值作為PaHSP90βmRNA的相對表達量; *：與對照組比較差異顯著(P<0.05)；n=4

組織表達特征分析顯示,PaHSP90β在健康香魚被檢組織中表達水平不同, 在肝中表達量最高, 與已報道的鮸魚[10]、史氏鱘[13]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[16]和唐魚(Tanichthysalbonubes)[17]等物種研究結果較為一致, 但與草魚[29]等魚類研究結果有較大差異。草魚HSP90β在性腺、心臟和鰓組織中表達量均較高, 其次是肝、脾和腦。HSP90β在魚類中不同的表達模式, 提示其可能參與魚類多種生理過程。

在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)中, A6腎上皮細胞經10～20 μmol/L氯化鎘處理2 h,HSP90βmRNA的表達無明顯變化[30]; 在鯉魚中, 10 mg/L鎘脅迫96 h內, 腎中HSP90βmRNA的表達均無明顯變化[16]; 在唐魚中, 1.15和2.31mg/L鎘在脅迫72 h和96 h時均顯著抑制肝中HSP90βmRNA的表達[17]。上述研究結果與本研究結果有明顯差異。本研究中, 香魚經鎘脅迫4～24 h內, 肝、脾、腎、鰓和腸等組織中PaHSP90βmRNA表達量顯著增加, 且在不同時間點達到峰值。造成這種差別的原因, 可能由于物種本身的差異, 也可能由于脅迫方式、鎘濃度及取樣時間點不同所致。進一步研究發(fā)現, 香魚經10‰鹽度脅迫后, 各組織中PaHSP90β的表達總體呈現上調趨勢, 與Pan等和Yang等的研究結果相似[7, 11]。Pan等研究發(fā)現[7], 大西洋鮭從淡水中轉至海水(30‰～35‰)中馴化養(yǎng)殖24 h后, 鰓片中HSP90βmRNA的表達量顯著上調, 腎組織中HSP90βmRNA的表達無明顯變化; 在體外實驗中, 鰓片和腎組織經125 mmol/L氯化鈉處理12 h后, 鰓片和腎組織中HSP90βmRNA的表達模式與整體實驗結果相似。Yang等研究發(fā)現, 吳郭魚(Poecilialatipinna)從半咸水(15‰)轉至海水(35‰)中馴化養(yǎng)殖4周后, 肝和鰓中HSP90蛋白的表達量均顯著上調[11]。綜上, 魚類HSP90的表達與重金屬以及鹽度脅迫密切相關, 推測可能由于重金屬或鹽度脅迫引起機體內發(fā)生蛋白質損傷, 從而誘導具有“分子伴侶”功能的HSP90表達增加, 以增強機體細胞對重金屬或氯化鈉的耐受性。然而, 具體作用機制有待于進一步研究。

4 結論

本研究測定了香魚PaHSP90βcDNA序列, 序列分析揭示其與白鮭HSP90β序列最相似。健康香魚中,PaHSP90βmRNA在肝中表達量最豐富; 鎘脅迫后, 香魚肝、脾、腎、鰓和腸中PaHSP90βmRNA表達量顯著上調, 鹽度脅迫后, 除腸組織外, 其他組織中PaHSP90βmRNA表達量總體上調，揭示HSP90β與重金屬及鹽度脅迫密切相關, 可能作為環(huán)境監(jiān)測領域新的生物標記分子。研究結果為進一步研究魚類HSP90的功能及其在環(huán)境脅迫中的作用機制提供了基礎資料。

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