獨活寄生湯水提物對退變大鼠椎間盤軟骨細胞功能的影響

劉伯齡 ，陳齊勇 ，劉少強 ，葉小偉 ，梁珪清 ，葉錦霞 ，李西海

（1.廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院，福建 福州 350007；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122）

椎間盤的退變是引起椎間盤退變性疾病的重要原因之一，而軟骨終板作為椎間盤的重要組成部分，在椎間盤負荷重新分配和應(yīng)力傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用［1-2］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)提出椎間盤退變重要因素之一是纖維軟骨板細胞數(shù)量減少，軟骨基質(zhì)增多［3］。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為椎間盤退變性疾患屬于中醫(yī)學(xué) “腰痛”“腰腿痛”范疇。益氣補腎是中醫(yī)治療腰痛的基本方略之一，獨活寄生湯具有祛風(fēng)濕、止痹痛、益肝腎、補氣血之功效［4］，發(fā)揮“從本治痿，從標(biāo)治痹”作用。該方長期用于臨床，治療椎間盤退變性疾病有較好療效［5-6］。 前期實驗研究表明其能延緩軟骨退變［7-8］，但其確切作用機制有待進一步研究。因此，本研究擬從Wnt／β-catenin信號通路探討?yīng)毣罴纳鷾嵛镎{(diào)控大鼠椎間盤退變軟骨細胞功能的影響，有目的地調(diào)控其功能，對延緩軟骨終板以及椎間盤退變有著重要的基礎(chǔ)與應(yīng)用價值。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量為（95±5）g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可號：SCXK2014-0001（閩）。

1.2 實驗藥物 獨活寄生湯藥物組成：獨活9 g，桑寄生 6 g，杜仲 6 g，茯苓 6 g，肉桂心 6 g，細辛 6 g，防風(fēng) 6 g，川芎 6 g，牛膝 6 g，當(dāng)歸 6 g，人參 6 g，秦艽 6 g，白芍 6 g，熟地黃 6 g，甘草 6 g，購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院。

1.3 實驗試劑 磷酸鹽緩沖液、低糖DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物有限公司）；TRIZOL（美國 Life公司）；異丙醇、無水乙醇（中國醫(yī)藥集團總公司）；瓊脂糖（西班牙 Biowest Agarose公司）；核酸染料（Solarbio生物有限公司）；DNA MarkerⅡ（北京全式金生物有限公司）；Wnt 4、GSK-3β、β-catenin、GAPDH 引物（上海生工生物工程股份有限公司）；一抗（兔抗）：Wnt 4、GSK-3β、β-catenin、DDK-1（美國 Abcan 公司）；β-actin、二抗（羊抗兔）（美國 CST 公司）；1-Step Transfer Buffer（美國 Thermo公司）；ECL 高效顯影液（美國Thermo公司）。

1.4 實驗儀器 DNA擴增儀（9600型，美國PE公司）；低溫高速離心機（64R型，美國BECKMAN公司）；超純水裝置（MILLI-Q型，美國MILIPORE公司）；熒光倒置相差顯微鏡（Olympus，日本TKO公司）；無菌操作臺（AIRTECH型，蘇州安泰）；超凈工作臺（SW-CJ-1F型，蘇州安泰）；凝膠成像系統(tǒng)（GELDOC2000型，美國BIO-RAD公司）；全自動酶標(biāo)儀（BIO-TEK ELX800型，美國BIO-Tek公司）；CO2 恒溫培養(yǎng)箱（BB16／BB5060 型，德國 Heraus公司）。

2 實驗方法

2.1 獨活寄生湯水提物提取 獨活寄生湯水回流提取2次，每次2 h，合并提取液，抽濾，濃縮成浸膏，60℃水浴蒸干至恒重；在低溫下研磨成粉末狀，精確稱量浸膏50 mg，加入5%FBS培養(yǎng)基5 mL溶解，超聲10 min，再經(jīng)0.22 μm無菌濾嘴濾過后配成10 mg／mL獨活寄生湯水提物母液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 軟骨細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 麻醉下脫頸錐處死SD大鼠，分離頸、腰椎椎間盤軟骨終板，收集后經(jīng)剪碎至1 mm3／單位體積，PBS緩沖液沖洗至少3次后移至無菌小培養(yǎng)皿中，按2.5 mL／皿的體積加入0.2%Ⅱ型膠原酶進行消化，15 mL離心管收集消化后的上清液（2 h／次），1500 r／min 離心后棄上清液，使用移液器吸取含10%胎牛血清的DMEM，緩慢吹勻沉淀，經(jīng)計數(shù)板計數(shù)（2×105／mL）后接種原代軟骨細胞于培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)，經(jīng)48 h后初次換液，鏡下觀察細胞匯合度達80%時，經(jīng)胰酶消化進行細胞傳代，本實驗使用第2代軟骨細胞。

采用Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色法進行鑒定，軟骨細胞（經(jīng)計數(shù) 2 500個／mL）爬片后，經(jīng) PBS沖洗3次，4%多聚甲醛進行固定30 min，再經(jīng)沖洗、裂解（0.1%破膜劑 50 μL） 20 min，沖洗后加入50 μL 3%H2O2反應(yīng)20 min，再次沖洗后經(jīng)5%BSA封閉 30 min，陽性組加入含Ⅱ型膠原1∶200的一抗反應(yīng)過夜，陰性組加入PBS作為對照，后經(jīng)PBS沖洗 3 遍后加入 50 μL 體積二抗（1∶200）反應(yīng) 30 min，再次沖洗后以每張玻片50 μL DAB體積進行浸潤10 min，再依次經(jīng)過漂洗、蘇木素復(fù)染、沖洗（PBS）、返藍2 s、常溫晾干、梯度酒精、二甲苯進行脫水與透明后封片與觀察［6］。

2.3 實驗分組 本實驗使用第2代軟骨細胞，經(jīng)鑒定后共分4組：正常組、模型組（經(jīng)10 ng／mL濃度IL-1β造模），實驗組經(jīng)10 ng／mL濃度IL-1β造模后根據(jù)干預(yù)方式不同，又分為實驗1組（獨活寄生湯水提物組 200 μg／mL干預(yù) 24 h）、 實驗 2組（獨活寄生湯水提物組 200 μg／mL 干預(yù) 48 h）。

2.4 軟骨細胞 Wnt 4、GSK-3β、β-catenin、DDK-1 mRNA表達 使用Trizol試劑進行Total RNA提取，并使用核酸蛋白檢測儀進行濃度檢測；逆轉(zhuǎn)錄后進行 PCR，反應(yīng)體系：Mix 10 μL、上游引物 1 μL、下游引物 1 μL、DEPC 水 7 μL、cDNA 1 μL。PCR 反應(yīng)條件為 94 ℃，4 min；94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，45 s；共循環(huán)35次，后置于72℃ 10 min，并于 4℃保存；制備1.5%瓊脂糖凝膠，上樣后，在100 V、70 mA、15 min條件下電泳，使用BIO-RAD Fluor-S TM MultiImager圖象分析儀下掃描，經(jīng)分析后拍照存檔。Wnt 4：上游5'-GGTCAGCCCACAGGGTTT CCA-3'，下游 5'-ACCGCTCGCCAGCATGTCTTT-3'；GSK-3β：上游 5'-TAGTCCGATTGCGGTATTT-3'，下游 5'-CTCCCTTGTTGGTGTTCCT-3'；β-catenin：上游 5'-TCCGCATGGAGGAGATAGTTG-3'，下游 5'-GCTGGAGAACCCATGAGGT-3'；DKK-1：上游 5'-GCCTCCGATCATCAGACGGT-3'，下游 5'-GCAGGT GTGGAGCCTAGAAG-3'；GAPDH：上游 5'-ACGGCA AGTTCAACGGCACAG-3'，下游 5'-GAAGACGCCAG TAGACTCCACGAC-3'。

2.5 軟骨細胞 Wnt 4、GSK-3β、β-catenin、DDK-1蛋白表達 采用Western Blot法檢測，提取各組軟骨細胞總蛋白，并進行BCA蛋白定量。將蛋白變性后進行電泳、轉(zhuǎn)膜，取封閉后的膜依次放入預(yù)先配置好的 β-actin（1∶1000）、Wnt 4（1 μg／mL）、GSK-3β（1∶5000）、β-catenin（1∶4000）、DDK-1（1∶5000）一抗中4℃冰箱搖床震蕩過夜，漂洗后置于二抗（1∶5000）封閉袋中室溫反應(yīng)1 h，再次漂洗，最后配制ECL發(fā)光液進行顯影，在凝膠成像儀下曝光成像并分析儲存。

2.6 軟骨細胞Sox9表達 在微孔中將各個濃度標(biāo)準(zhǔn)品按50 μL／每孔依次加入；將處理后的待測樣品按每孔各25 μL依次加入，并在樣品孔中依次加入25生物素標(biāo)記抗體，在標(biāo)準(zhǔn)溶液孔及待測樣品孔中分別加入100辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體，充分混勻，將包被微孔板覆膜平穩(wěn)放置在37℃溫箱中孵育反應(yīng)60 min后，充分棄盡孔內(nèi)液體并扣干孔內(nèi)剩余殘液，用預(yù)先稀釋好的清洗液反復(fù)沖洗5次后，每孔依照次序加入50 μL TMB，再加入TMBⅡ50 μL進行充分混勻，終止反應(yīng)，并使用酶標(biāo)儀在450 nm下讀取各孔吸光度值。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布以（）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 軟骨細胞觀察與鑒定 第2代大鼠椎間盤軟骨細胞增殖速度快，呈現(xiàn)多邊形，胞核清晰，且含有1～2個核仁，融合后出現(xiàn)“鋪路石”狀（圖1D）；鑒定如圖2示，經(jīng)Ⅱ型膠原法染色后，陽性對照組胞漿區(qū)為棕黃色（圖2A），陰性對照組胞漿區(qū)顏色透明（圖 2B）

圖1 大鼠椎間盤軟骨細胞形態(tài)圖（×200）

3.2 4 組軟骨細胞 Wnt 4、GSK-3β、β-catenin、DKK-1 mRNA表達比較 見圖3、表1。

3.3 4 組軟骨細胞 Wnt 4、GSK-3β、β-catenin、DKK-1蛋白表達比較 見圖4、表2。

3.4 4組軟骨細胞Sox 9含量比較 見表3。

圖2 大鼠椎間盤軟骨細胞免疫組化圖（×200）

圖 3 4 組軟骨細胞 Wnt 4、GSK-3β、β-catenin、DKK-1電泳圖

圖 4 4 組軟骨細胞 Wnt 4、GSK-3β、β-catenin、DKK-1蛋白電泳圖

4 討 論

Wnt通路是一個在生物進化過程中高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)，在細胞生存、增殖、分化、極化、凋亡等過程中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。Wnt／β-catenin信號通路作為Wnt信號通路的經(jīng)典通路之一，其動態(tài)激活與椎間盤形態(tài)形成、生長和退變過程密切相關(guān)［9］。 研究還發(fā)現(xiàn) Wnt／β-catenin 信號參與軟骨損傷后修復(fù)也具有反向調(diào)控關(guān)系，抑制該信號通路能夠促進軟骨的修復(fù)［11-12］。 鑒于Wnt／βcatenin信號途徑在軟骨生成中的重要作用，其是否也在椎間盤軟骨終板退變過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，如促進軟骨細胞鈣化等是我們關(guān)注的焦點。因此，闡明椎間盤軟骨細胞內(nèi)Wnt／β-catenin信號通路的具體作用機理，有目的的調(diào)控軟骨細胞的鈣化，增加椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)，將是預(yù)防軟骨終板乃至整個椎間盤退變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

表 1 4 組軟骨細胞 Wnt 4、GSK-3β、β-catenin、DKK-1 mRNA 表達比較（）

表 1 4 組軟骨細胞 Wnt 4、GSK-3β、β-catenin、DKK-1 mRNA 表達比較（）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別正常組模型組實驗1組實驗2組Wnt 4／β-actin 0.378±0.071 0.540±0.0281）0.444±0.0281）2）0.438±0.0011）2）GSK-3β／β-actin 0.287±0.033 0.561±0.0151）0.442±0.0211）2）0.394±0.0471）2）β-catenin／β-actin 0.326±0.025 0.618±0.0351）0.524±0.0241）2）0.431±0.0091）2）DKK-1／β-actin 0.408±0.043 0.261±0.0471）0.333±0.0041）2）0.398±0.0331）2）

表 2 4 組軟骨細胞 Wnt 4、GSK-3β、β-catenin、DKK-1 蛋白表達比較（）

表 2 4 組軟骨細胞 Wnt 4、GSK-3β、β-catenin、DKK-1 蛋白表達比較（）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別正常組模型組實驗1組實驗2組Wnt 4／β-actin 0.329±0.015 0.536±0.0221）0.445±0.0271）2）0.385±0.0191）2）GSK-3β／β-actin 0.235±0.023 0.386±0.0231）0.321±0.0011）2）0.264±0.0011）2）β-catenin／β-actin 0.228±0.019 0.349±0.0201）0.303±0.0271）2）0.242±0.0251）2）DKK-1／β-actin 0.341±0.017 0.234±0.0221）0.361±0.0301）2）0.404±0.0371）2）

表3 4組軟骨細胞Sox 9含量比較（）ng／mL

表3 4組軟骨細胞Sox 9含量比較（）ng／mL

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別正常組模型組實驗1組實驗2組Sox 9 10.451±0.558 44.057±2.3121）28.616±1.9151）2）20.107±0.7941）2）

Dickkof族（DKK-1）可通過間接減少可利用的輔助受體LRP的數(shù)量來間接抑制Wnt與膜受體結(jié)合而發(fā)揮作用，常被作為Wnt／β-catenin信號通路的抑制劑，因此本實驗采用5 μg／mL濃度的DKK-1 來影響 Wnt／β-catenin 信號通路［12-13］。 研究表明IL-1β抑制軟骨終板細胞的細胞活性、蛋白聚糖和Ⅱ型膠原基因表達，并促進細胞外基質(zhì)蛋白酶、炎癥因子和NO產(chǎn)物產(chǎn)生，因此本實驗使用10 ng／mL濃度IL-1β來塑造椎間盤軟骨細胞退變模型［14-15］。

前期研究發(fā)現(xiàn)，獨活寄生湯水提物200 μg／mL可顯著促進正常軟骨細胞內(nèi)Cyclin D1，CDK4，CDK6及P21 mRNA的表達［16］，故本實驗在前期基礎(chǔ)上，進一步探究獨活寄生湯水提物200 μg／mL分別作用于經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)退變的椎間盤軟骨細胞24 h、48 h后對大鼠椎間盤軟骨細胞中Wnt4、GSK-3β、βcatenin、DKK-1的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)獨活寄生湯水提物可下調(diào) Wnt 4、GSK-3β、β-catenin，上調(diào) DKK-1 mRNA與蛋白含量表達，且以干預(yù)48 h后變化顯著（P＜0.05），同時降低大鼠椎間盤軟骨細胞上清液中 Sox 9 水平（P＜0.05）。

綜上，獨活寄生湯水提物延緩大鼠椎間盤軟骨細胞退變的機制為下調(diào)軟骨細胞Wnt 4、GSK-3β、β-catenin，上調(diào)DKK-1 mRNA與蛋白含量表達，并可降低大鼠椎間盤軟骨細胞上清液中Sox 9水平發(fā)揮作用，其發(fā)揮調(diào)控作用的內(nèi)在機制，如是否通過相關(guān)長鏈非編碼RNA進行靶點調(diào)控仍需深入研究。

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