大白菜抗根腫病的抗源篩選和分子標(biāo)記鑒定

朱明釗 張淑江 張 慧 章時(shí)蕃 李 菲 王曉武 武 劍 李國亮魏云曉 岳麗昕 孫日飛

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

大白菜根腫病是由蕓薹屬根腫菌（Plasmodiophora brassicaeWoron.）侵染引起的專性寄生的世界性土傳病害，主要危害十字花科作物，最早發(fā)現(xiàn)于地中海西岸和歐洲南部，現(xiàn)在許多國家都有發(fā)生（楊永林，1990）。根腫菌的休眠孢子可以在土壤中存活7 a以上（Karling，1968），因此，田間一旦受到污染，將長期不再適合十字花科作物的種植。通過田間管理和生物化學(xué)防治的方法不能從根本上防治根腫病，選育抗根腫病的大白菜新品種是最經(jīng)濟(jì)有效的方法（Kuginuki et al.，1999）。

迄今為止，在大白菜中至少有12個(gè)抗根腫病基因被定位出來，其中Crr2位于A01連鎖群（Suwabe et al.，2003），CRc位 于 A02連 鎖 群（Sakamoto et al.，2008），CRa、CRb、CRbkato、CRk、Crr3、PbBa3.1、PbBa3.3和Rcr1都位于A03連鎖群（Hirai et al.，2004；Piao et al.，2004；Sakamoto et al.，2008；Matsumoto et al.，2012；Chen et al.，2013；Kato et al.，2013；Chu et al.，2014），Crr4位于 A06連鎖群（Suwabe et al.，2006），Crr1位于A08連鎖群（Suwabe et al.，2003）；另外，Gao等（2014）將1個(gè)抗病基因定位到了與CRa相同的位置（Ueno et al.，2012），該基因可能與CRa是同一基因；王彤彤等（2012）將1個(gè)抗病基因定位到了A08連鎖群并證明了該基因與Crr1不在同一區(qū)域，是一個(gè)新的抗病基因。

以往的基因定位工作只能定位1個(gè)或2個(gè)抗病基因，而對根腫菌分化的眾多的生理小種，單個(gè)基因往往不起作用，因此，將多個(gè)抗病基因聚合到同一份材料當(dāng)中是提高材料抗病的廣泛性和耐久性的有效方法（Matsumoto et al.，2012；Hatakeyama et al.，2017）。本試驗(yàn)以根腫菌M01、M02和M03為病原菌菌源，對24份大白菜材料進(jìn)行接種鑒定和分子標(biāo)記鑒定，旨在篩選出抗多個(gè)根腫菌的抗源，并明確與之相關(guān)的抗病基因，以期為今后抗根腫病聚合育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試24份大白菜材料（表1）保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所白菜課題組，以感病大白菜作為對照。供試根腫菌M01、M02和M03分別采自遼寧沈陽、云南昆明和河南鄭州，根腫病菌根置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 材料名稱及來源

1.2 接種方法

1.2.1 菌液的制備 2017年3月8日在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所實(shí)驗(yàn)樓406進(jìn)行，制備方法在Kawamura等（2017）的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，取20 g保存于-20 ℃冰箱的根腫病菌根，室溫下解凍后加入200 mL蒸餾水于攪拌器中攪碎，8層紗布過濾，濾液于4℃、4 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，用無菌水懸浮沉淀，用血球計(jì)數(shù)板將濃度調(diào)至2×107個(gè)·mL-1，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 接種 2017年3月在本所南圃場春化室進(jìn)行，采用浸根法（柴阿麗 等，2015）接種。3月2日在鋪有單層濾紙的培養(yǎng)皿中對大白菜種子進(jìn)行催芽，6 d后將根系浸入配制好的根腫菌懸浮液中，30 min后將幼苗栽入提前裝好基質(zhì)并灌透底水的50孔穴盤中，每穴1株，每處理6穴，3次重復(fù)。42 d后進(jìn)行病情調(diào)查。

1.3 病情調(diào)查

病 情 分 級 標(biāo) 準(zhǔn) 參 考 Kuginuki等（1999）、Suwabe等（2006）、Kato等（2013）的方法：0級，根部無腫大現(xiàn)象；1級，側(cè)根根部有少量小腫瘤；2級，側(cè)根根部有較大腫瘤或主根上有小腫瘤；3級，主根和側(cè)根都出現(xiàn)嚴(yán)重的腫大（圖1）。

病情指數(shù)計(jì)算及抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考Zhang等（2015）的方法：抗病（R），病情指數(shù)≤26；感?。⊿），病情指數(shù)＞26。

病情指數(shù)=Σ（各病級株數(shù)×相應(yīng)級數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×3）×100

圖1 根腫病病情分級標(biāo)準(zhǔn)

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件對調(diào)查結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析：① 針對每1份材料對3種根腫菌的抗性表現(xiàn)進(jìn)行方差分析；② 分別計(jì)算出24份材料對3種根腫菌病情指數(shù)的平均值，然后進(jìn)行方差分析。

1.5 分子鑒定

1.5.1 DNA的提取 采集24份大白菜材料的幼嫩葉片，采用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法（Murray & Thompson，1980）提取單株DNA，用Nanodrop 2000分光光度計(jì)測定DNA濃度。

1.5.2 分子標(biāo)記檢測 對24份大白菜材料進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，共用到22個(gè)標(biāo)記，涉及10個(gè)基因。其中，標(biāo)記HC352b-SCAR、SC2930-T-FW/-RV、SC2930-Q-FW/-RV、CRaim-T與 基 因CRa連 鎖（Hayashida et al.，2008；Matsumoto et al.，2012；Ueno et al.，2012），標(biāo)記 TCR05、TCR09、TCR79、TCR108、K-3與 基 因CRb連 鎖（Piao et al.，2004；Zhang et al.，2014；Chen et al.，2016）， 標(biāo)記KBrH129J18R與基因CRbkato連鎖（Kato et al.，2013）， 標(biāo) 記 B50-C9-FW/-RV、B50-6R-FW/-RV與 基 因CRc連 鎖（Matsumoto et al.，2012）， 標(biāo)記 HC688-4-FW/-6-RV、HC688-4-FW/-7-RV與基 因CRk連 鎖（Matsumoto et al.，2012）， 標(biāo) 記BRMS-088和BRMS-096分別與基因Crr1和Crr2連鎖（Suwabe et al.，2003），標(biāo)記OPC11-2S與基因Crr3連鎖（Saito et al.，2006），標(biāo)記M8、M9、M10與基因CR-A3連鎖（Gao et al.，2014），標(biāo)記BrID11683、BrID90269與1個(gè)尚未定位的基因連鎖（王彤彤 等，2012）。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為10 μL：PCR mix 5 μL，1.0 μmol·L-1上下游引物各0.2 μL，50 ng·L-1模板 DNA 2 μL，ddH2O 補(bǔ)齊至10 μL。PCR擴(kuò)增片段長度≥600 bp的標(biāo)記利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，PCR擴(kuò)增片段長度＜600 bp的標(biāo)記利用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種鑒定

從圖2可以看出，感病對照CK對3種根腫菌都表現(xiàn)感病，說明本試驗(yàn)采用的接種方法準(zhǔn)確可靠。24份大白菜材料中，有10份抗病材料，14份感病材料。其中，材料CR004、CR007、CR013、CR015和CR016對3種根腫菌都表現(xiàn)抗病，材料CR012、CR014和CR018對根腫菌M01和M02表現(xiàn)抗病，材料CR021只對根腫菌M01表現(xiàn)抗病，材料CR023只對根腫菌M02表現(xiàn)抗病。3個(gè)根腫病小種對24份大白菜材料平均病情指數(shù)的單因素方差分析結(jié)果表明：根腫菌M01和M02在24份材料中的致病力差異不顯著，根腫菌M03在24份材料中的致病力與M01和M02差異顯著，從材料CR014、CR017和CR018的表現(xiàn)也可以看出，根腫菌M01和M02之間的致病力差異不顯著，而根腫菌M03的致病力與M01、M02差異顯著。

圖2 不同大白菜材料對3種根腫菌的抗性鑒定結(jié)果

表2 不同大白菜材料的根腫病抗性及對應(yīng)的抗性基因

2.2 分子標(biāo)記鑒定

鑒定結(jié)果表明，本試驗(yàn)用到的22個(gè)分子標(biāo)記中只有10個(gè)具有多態(tài)性，分別是SC2930-T-FW/-RV、SC2930-Q-FW/-RV、KBrH129J18R、B50-C9-FW/-RV、B50-6R-FW/-RV、HC688-4-FW/-6-RV、HC688-4-FW/-7-RV、BRMS-088、BRMS-096和OPC11-2S，共涉及7個(gè)基因，分別是CRa、CRbkato、CRc、CRk、Crr1、Crr2和Crr3。

由表2可以看出，感病材料中有的不含抗病基因，有的含有抗病基因CRk、Crr1或Crr2。材料CR012、CR014和CR018對根腫菌M01和M02表現(xiàn)出抗性，其中CR012含有基因抗病基因CRa和CRbkato，CR014和CR018含有抗病基因CRa、CRbkato和CRk； 材 料 CR004、CR007、CR013、CR015和CR016對根腫菌M01、M02和M03表現(xiàn)出抗性，其中CR004和CR007只含有抗病基因CRk，CR013含有抗病基因CRa、CRbkato、CRk和Crr3，CR015和CR016含有抗病基因CRa、CRbkato和Crr3；材料CR021只抗根腫菌M01且含有抗病基因Crr2和CRk，材料CR023只抗根腫菌M02且含有抗病基因CRc和CRk。

3 結(jié)論與討論

明確根腫菌各生理小種在我國不同地區(qū)的分布，對提高抗病品種選育的效率具有非常重要的意義。根腫菌存在生理小種的分化，目前已經(jīng)鑒定出的生理小種超過24個(gè)（孫保亞 等，2005）。我國主要的生理小種有2號、4號、7號、10號和11號，其中以4號生理小種為主（沈向群 等，2009；丁云花 等，2013）。彭沙莎等（2013）鑒定出湖南大白菜根腫菌生理小種有1號、4號、9號和13號；劉峰等（2013）鑒定出云南和西藏大白菜根腫菌生理小種有1號、2號、4號、6號、7號、10號、11號和12號；李寧等（2015）鑒定出陜西太白縣根腫菌生理小種為7號。因此，明確抗源對不同生理小種或不同地區(qū)生理小種的抗性對育種工作十分重要。

分子標(biāo)記在輔助選擇育種、遺傳多樣分析和基因定位及克隆等方面的應(yīng)用具有十分明顯的優(yōu)越性（McCouch et al.，1997；Liu et al.，2013）。孫保亞等（2005）從國外引進(jìn)的大白菜品種中分離出48個(gè)抗根腫病大白菜自交系；樸鐘云等（2010）通過分子標(biāo)記輔助選擇的方法加速回交選育，培育出大白菜優(yōu)良自交系BJN3的9份抗根腫病近等基因系。Matsumoto等（2012）利用分子標(biāo)記輔助選擇和傳統(tǒng)育種相結(jié)合的方法實(shí)現(xiàn)了3個(gè)抗根腫病基因CRa、CRc和CRk的聚合，并證明了聚合之后作物的抗病能力有所加強(qiáng)。本試驗(yàn)中，抗病基因CRk、Crr1和Crr2也存在于感病材料中，筆者推測這3個(gè)基因?qū)Σ牧系目共⌒詻]有貢獻(xiàn)。材料CR012、CR014和CR018對根腫菌M01和M02表現(xiàn)出抗性，其中CR012含有抗病基因CRa和CRbkato，CR014和CR018含有抗病基因CRa、CRbkato和CRk，由此推測材料對M01和M02的抗性可能與CRa或CRbkato有關(guān)，也可能與兩者都有關(guān)。材料CR013、CR015和CR016對根腫菌M01、M02和M03都表現(xiàn)出抗性，其中CR013含有抗病基因CRa、CRbkato、CRk和Crr3，CR015和CR016含有抗病基因CRa、CRbkato和Crr3，推測基因Crr3對M03具有特異抗性。材料CR023只抗根腫菌M02且含有抗病基因CRc和CRk，因此認(rèn)為基因CRc可能對M02具有特異抗性。CR004、CR007和CR021是3份比較特殊的材料，其中CR004和CR007對根腫菌M01、M02和M03都表現(xiàn)出抗性但只含有抗病基因CRk，CR021只抗根腫菌M01且含有抗病基因Crr2和CRk；由于本試驗(yàn)感病材料中也含有基因Crr2和CRk，因此推測這3份材料中可能還含有其他抗病基因，有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)對24份大白菜材料進(jìn)行接種鑒定，首次明確了它們對3個(gè)不同地區(qū)根腫菌的抗性，并篩選出10份抗病材料。同時(shí)，利用已經(jīng)開發(fā)出的與抗病基因連鎖的分子標(biāo)記對24份材料進(jìn)行了分子鑒定，明確了與材料抗病性相關(guān)的基因，對今后抗病材料的篩選和抗病基因的分子聚合育種具有較高的參考價(jià)值。

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