激活素相互作用蛋白5在急性肝損傷動物模型中的表達變化及意義*

徐元紅，鞠寶玲，聶影，宋傳芳，吳昆，莊彥華，張紅軍

（1.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院 消化內科，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學院 免疫學教研室，黑龍江 牡丹江 157011）

激活素是最早在性腺細胞中發(fā)現的二聚體糖蛋白，是轉化生長因子β（transforming growth factor，TGF-β）超家族的一員，具有廣泛的生物學功能[1-3]。近年研究表明[4-7]激活素與肝纖維化形成密切相關，它以自分泌/旁分泌的形式作用于肝實質細胞，不僅抑制肝細胞再生、誘導肝細胞凋亡、還能活化肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）促進細胞外基質（extracellular matrix，ECM）合成，筆者在前期的研究中發(fā)現激活素及其Ⅱ A型受體，在刀豆蛋白A（concanavalin，ConA）誘導的慢性免疫性肝損傷模型中表達異常，其表達變化與肝組織病理損傷呈平行狀態(tài)，提示激活素及其信號傳導蛋白可能參與了ConA誘導的慢性肝損傷進程[8]。

ConA為T淋巴細胞的多克隆刺激劑，其誘導肝損傷的機制與T淋巴細胞、巨噬細胞活化及相關細胞因子的產生有重要聯(lián)系，ConA誘導引發(fā)的肝損傷模型被認為是經典T細胞介導的急性肝細胞損傷性模型[9-11]，有關激活素及其信號傳導蛋白在Con A誘導的急性肝損傷過程中的作用研究較少。

激活素受體相互作用蛋白5（activin receptorinterating protein 5，ActRIP5）是激活素特異信號傳導調控蛋白，在肝臟組織高表達，具有促進激活素信號傳導的作用，是激活素在肝臟發(fā)揮作用的重要信號傳導蛋白，本研究擬通過ConA誘導復制急性免疫性肝損傷模型，探討ActRIP5在T細胞介導的急性肝損傷進程中的表達變化，進一步揭示激活素及其信號傳導蛋白在急慢性肝損傷及肝纖維化形成進程中的作用，為以病毒性肝炎為主的免疫學性肝損傷的預防和治療提供一定的研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/C純系小鼠，雄性，18～22 g，54只，由牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心SPF級動物房提供。

1.1.2 主要試劑 Con A Ⅳ型（美國Sigma公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒（RevertAid First Strand Cdna Synthesis Kit）、SYBR實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測試劑盒均購自美國Thermo公司，PCR擴增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及模型復制 將54只C57BL/C純系小鼠，適應性喂養(yǎng)1周隨機分為9組，其中對照組6只，ConA給藥組48只，分別為給藥2、4、8、12、24、48、72和96 h組各6只。對照組以15 mg/kg生理鹽水尾靜脈注射，ConA給藥組以15 mg/kg ConA尾靜脈注射，分別于給藥后2、4、8、12、24、48、72和96 h眼球取血后處死，稱重，取肝、脾組織稱重，留取肝臟組織分別行病理形態(tài)學檢查、基因水平檢測。

1.2.2 肝臟指數和脾臟指數 實驗動物處死后稱其體重，取出肝臟和脾臟，借助濾紙吸干后立即稱重、記錄。肝臟指數=肝臟重量/體重×100，脾臟指數=脾臟重量/體重×100。

1.2.3 血清ALT和AST測定 小鼠麻醉后摘眼球取血約1 ml，靜置30 min后2 500 r/min，離心20 min。取上清液用生化法測定丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酶轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）。

1.2.4 肝臟病理學檢測 取小鼠肝組織右葉標本，用4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片。HE染色分析肝臟損傷程度。

1.2.5 qRT-PCR檢測小鼠肝臟組織內激活素、ActRIP5的表達 液氮研磨肝臟組織，Trizol提取肝組織總RNA，取2μg總RNA進行逆轉錄，以GAPDH作為內參，反應條件為：50℃ 2 min，95℃10 min，1個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，39個循環(huán)；M：60～90℃ 30 s，10℃ 10 min，1個循環(huán)。設定3個復孔，進行SYBR qRT-PCR。引物由美國Invitrogen公司合成。引物序列如下：GAPDH正向：5'-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3'，反向：5'-GAGTTGC TGTTGAAGTCGCA-3'；激活素正向：5'-GCTGTATTAC GATGATGGT-3'，反向：5'-TGTCTTCTCTGGACTCT C-3'；ActRIP5 正向：5'-GATGCTGTAGACCTCTTC-3'，反向5'-CTTCACCTCGATGTACTATA-3'。

1.3 統(tǒng)計學方法

運用SPSS24.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，所有數據資料符合正態(tài)分布特征及方差齊性，應用t檢驗和方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清ALT、AST水平

注射ConA分不同時相測定小鼠血清中ALT和AST的生化檢測結果，小鼠血清ALT水平ConA給藥組與對照組比較，給藥后4 h開始升高，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.976，P=0.002），8、12、24 h均高于對照組（t=8.702、19.076和 34.000，均P=0.000），至24 h達到峰值后開始下降，但給藥48、72、96 h后仍高于對照組（t=31.853、11.154 和 7.275，P=0.000、0.000和0.001），96 h仍未恢復至正常水平。小鼠血清AST水平ConA給藥組與對照組比較，自給藥后4 h開始升高，差異有統(tǒng)計學意義（t=13.191，P=0.000），至24 h達到峰值后開始下降，至給藥后96 h未恢復正常水平（t8h=19.895、t12h=47.647、t24h=38.676、t48h=51.946、t72h=20.633 和t96h=10.976，P8h=0.000、P12h=0.000、P24h=0.000、P48h=0.000、P72h=0.000 和P96h=0.024）。小鼠血清ALT、AST水平給藥后4～96 h均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，這說明ConA給藥4 h開始造成肝細胞受到損傷，至24～48 h肝細胞損傷最重，隨著給藥時間的延長ALT、AST有所下降，肝細胞損傷未再繼續(xù)加重但96 h未恢復至正常水平。見圖1。

圖1 ConA誘導急性肝損傷模型鼠小鼠血清ALT（A）和AST（B）水平變化

2.2 組織學改變

2.2.1 肝臟、脾臟大體標本肉眼觀 對照組小鼠肝臟體積正常，質地軟，有光澤，表面光滑。2、4、8 h組小鼠肝臟未見明顯變化，12 h以后各給藥組小鼠肝臟腫大，質地變韌、發(fā)白，表面粗糙，呈小結節(jié)狀增生及模糊可見條紋狀、片狀壞死灶，且以72 h組為重。72 h組至96 h組小鼠損傷有減輕趨勢，給藥96 h組后肝損傷未恢復至正常水平。對照組小鼠脾臟體積正常，質地軟，色澤紅潤，表面光滑，給藥組2 h后小鼠脾臟出現充血水腫，體積增大，包膜緊張，色澤變暗發(fā)黑，質地變硬，24 h達高峰，隨著給藥時間的延長，逐漸恢復，至給藥后96 h恢復接近正常水平。見圖2。

2.2.2 肝臟組織病理檢查結果 對照組肝細胞形態(tài)正常，無胞質疏松，肝細胞索清晰可見，小葉結構正常。給藥后2 h組肝組織無明顯病理變化；給藥后4 h組可見肝細胞輕度腫脹，肝細胞索形態(tài)正常；給藥后8 h組肝細胞進一步腫脹，胞質略疏松，細胞間隙變窄；給藥后12 h組可見肝細胞腫脹，胞質疏松，肝細胞索形態(tài)仍正常；給藥后24 h組肝臟切片可見明顯的點狀壞死，壞死處胞質疏松見大量中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，部分組織肝小葉結構紊亂，肝細胞索排列紊亂，部分肝細胞索消失；給藥后48 h組病變持續(xù)加重組織肝小葉結構紊亂，肝細胞索消失；給藥后72 h組肝臟組織損傷較前好轉，仍有炎癥細胞浸潤但較前減輕，細胞腫脹較前減輕，可見肝細胞索結構存在；給藥后96 h組肝損傷減輕但仍未恢復至正常，肝細胞略腫脹，胞質略疏松，偶見炎癥細胞浸潤，肝細胞索結構清晰，肝小葉結構完整。見圖3。

圖2 ConA誘導急性肝損傷模型小鼠肝臟、脾臟形態(tài)變化

圖3 ConA誘導急性肝損傷模型小鼠肝臟組織病理學變化 （HE染色×100）

2.2.3 肝臟指數、脾臟指數 肝臟指數檢測顯示自給藥后12 h肝臟指數開始增大，至24～48 h達到峰值，72 h開始下降。脾臟指數檢測顯示自給藥后8 h脾臟指數開始增大，至24 h達到峰值，48 h開始下降，96 h恢復正常水平。見附表。

2.3 急性肝損傷模型鼠肝組織內激活素、ActRIP5 mRNA的表達變化

ActRIP5 mRNA的表達水平與激活素mRNA的表達水平呈平行變化趨勢，兩者均在Con A給藥后8 h出現突現1個高峰表達，然后表達逐漸下降，但仍高于正常對照組，呈現高水平表達，激活素mRNA的表達在96 h降至正常水平，而ActRIP5 mRNA水平于48 h降至正常水平。見圖4。由此可見激活素及ActRIP5的表達于肝損傷進展期處于較高水平，于損傷恢復期表達逐漸下降，直至恢復至正常。

附表 小鼠肝臟指數、脾臟指數 （n=6，%，±s）

附表 小鼠肝臟指數、脾臟指數 （n=6，%，±s）

注：1）與對照組相比，P＜0.05，2）與ConA 24 h峰值相比，P＜0.05

項目 對照組 ConA 2 h ConA 4 h ConA 8 h ConA 12 h ConA 24 h ConA 48 h ConA 72 h ConA 96 h肝臟指數 4.26±0.19 4.30±0.16 4.20±0.30 4.52±0.57 5.47±0.121） 5.93±0.121） 5.74±0.141） 5.15±0.071）2）4.96±0.321）2）脾臟指數 0.35±0.03 0.40±0.05 0.46±0.07a 0.51±0.04a 0.56±0.021） 0.58±0.091） 0.48±0.091）2）0.47±0.021）2） 0.38±0.072）

圖4 Con A誘導急性肝損傷模型與對照組小鼠肝組織激活素（A）及ActRIP5 mRNA（B）水平變化

3 討論

病毒性肝炎一直是危害人類健康的常見疾病，在我國HBsAg陽性率可高達為9.75%[12]，病毒性肝炎是引起肝硬化的最常見原因，部分慢性乙肝患者最終將發(fā)展為肝癌[13-14]。ConA是一種T細胞絲裂原，由其誘導的免疫性肝損傷模型與病毒性肝炎的病理機制最為接近，被認為是研究人類病毒性肝炎及自身免疫性肝病等病理機制的理想模型[9，15]。

激活素在神經細胞分化誘導、造血細胞增殖和分化、內分泌中樞垂體性激素分泌調節(jié)等多方面發(fā)揮重要作用，同時激活素還是組織修復、再生和分化的重要調節(jié)因子，基于激活素的這些生物學活性，研究人員對激活素及其信號傳導在慢性肝損傷及肝纖維的形成過程中的作用做了較多的研究，近年來研究發(fā)現在慢性肝炎、肝纖維化、肝癌及肝功能衰竭等疾病發(fā)生發(fā)展過程中均有激活素表達異常，研究表明激活素與肝纖維化形成密切相關，可由肝實質細胞自分泌或旁分泌、抑制肝細胞再生、誘導肝細胞凋亡、促進HSC合成和分泌ECM，阻斷激活素在肝臟的信號傳導途徑可以抑制肝纖維化的形成[4-6]。

ConA為T淋巴細胞的多克隆刺激劑，能引起特異性的肝損傷，其誘導肝損傷的機制與T淋巴細胞、巨噬細胞活化及相關細胞因子的產生有重要聯(lián)系，ConA誘導的急性肝損傷，起病急損傷可逆，數小時即有明顯的病理改變。有文獻報道[16]觀察脂多糖造模誘導的急性肝損傷模型的肝組織中JNK信號通路可誘導肝損傷，而有關激活素及其信號傳導在ConA誘導的急性肝損傷過程中的作用研究較少，未見有相關的文獻報導。

研究表明Smads蛋白家族分布在激活素與TGF作用的所有靶細胞中，從Smads信號蛋白的角度，無法明確闡述激活素作用的組織學特異性。而ActRII受體活性的調控，可能是決定激活素作用組織學特異性的關鍵。ActRIPs是最近發(fā)現的一組信號傳導調控蛋白[17]，作為Smad上游信號調控蛋白可特異結合激活素Ⅱ型受體，影響激活素誘導的細胞內信號傳導。ActRIPs主要的特點在于其存在組織分布以及生物學活性的差異，可能是決定激活素組織學作用特異性的關鍵分子[18]。研究發(fā)現AcRIP5可通過與激活素Ⅱ型受體作用，促進激活素的細胞內信號傳導，在肝細胞內高表達，激活素受體相互作用蛋白擁有組織特異性，ActRIP 1、3、4在肝細胞不表達。因此，ActRIP5是促進激活素發(fā)揮生物學功能，介導激活素在肝損傷發(fā)揮作用的關鍵分子。本實驗選用C57BL/6小鼠尾靜脈注射ConA（15 mg/Kg），分別于給藥后2、4、8、12、24、48、72、96 h分批次通過血清酶學改變、肝臟脾臟形態(tài)及指數變化、及肝臟組織病理學改變判斷肝損傷進展情況，應用qRT-PCR方法分析激活素及ActRIP 5的表達變化，結果顯示肝損傷在ConA給藥4 h出現，24 h達高峰，后逐漸恢復。激活素及ActRIP5 mRNA的表達水平呈平行變化趨勢，兩者均在ConA給藥后8 h出現突現1個高峰表達，然后表達逐漸下降，但在24 h內仍高于正常對照組呈現高水平表達。激活素mRNA的表達在96 h降至正常水平，而ActRIP5 mRNA水平于48 h將至正常水平。雖然激活素及ActRIP5的表達變化，未與病理損傷一致，其表達峰值位于給藥后8 h早于病理損傷的高峰24 h出現，但激活素及ActRIP5的異常高表達集中于肝損傷進展期，兩者表達下降直至恢復正常則體現在損傷恢復期。

由此可見激活素及其在肝臟的特異信號傳導可能參與了ConA誘導的急性肝損傷進程，但有關激活素及其肝內特異信號傳導蛋白ConA誘導的急性免疫性肝損傷中的確切作用及其機制，有待進一步探討。

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