白細(xì)胞介素增強(qiáng)因子3對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制

劉羽，李勇，趙雪峰，檀碧波，賈楠，張萌，王冬

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 1.外三科，2.肝膽外科，河北 石家莊050011）

臨床胃癌患者多處于進(jìn)展期，就診時(shí)往往已存在局部轉(zhuǎn)移甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲和遷移能力，這是導(dǎo)致胃癌轉(zhuǎn)移的重要原因[1-2]。因此，尋找在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要調(diào)控功能的基因?qū)τ谝种颇[瘤細(xì)胞遷移、延緩腫瘤進(jìn)展有益。白細(xì)胞介素增強(qiáng)因子3（interleukin enhancer-binding factor 3，ILF3）是近年來發(fā)現(xiàn)的與生理及病理狀態(tài)有關(guān)的新基因，研究顯示一些疾病中ILF3表達(dá)異常[3-5]，但I(xiàn)LF3在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制迄今報(bào)道極少。故本研究通過對(duì)臨床組織及胃癌細(xì)胞株的研究，探討了ILF3基因與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并對(duì)其中的分子機(jī)制進(jìn)行了初步分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2014年1月-2015年12月，于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院確診并行手術(shù)治療的胃癌患者112例為研究對(duì)象。其中，男性74例，女性38例；年齡34～81歲，平均（56.38±8.79）歲。所有患者均經(jīng)手術(shù)切除原發(fā)腫瘤?；颊咝g(shù)前未經(jīng)過放化療及生物治療。取患者的腫瘤原發(fā)灶石蠟標(biāo)本連續(xù)4μm切片用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。另于患者中取62例陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的淋巴結(jié)及50例癌旁正常胃黏膜的石蠟標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑

人胃癌高分化細(xì)胞株MKN28、中分化胃癌細(xì)胞株SGC7901、低分化胃癌細(xì)胞株BGC823、MGC803取自本院科研中心；胃上皮細(xì)胞株GES-1購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品；噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、Trizol、 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒、蛋白提取試劑盒為美國Sigma公司產(chǎn)品；各基因的引物及ILF3-siRNA由上海生工公司設(shè)計(jì)合成。ILF3、基質(zhì)金屬蛋白酶 7（matrix metalloproteinase-7，MMP-7）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑 1（matrix metallo-proteinase inhibitor-1， TIMP-1）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 SP法檢測(cè)胃癌組織、癌旁組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中ILF3蛋白的表達(dá) 臨床標(biāo)本石蠟組織脫蠟水化，進(jìn)行SP染色。操作步驟嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書操作。結(jié)果判斷由2位病理專業(yè)人員盲法觀察切片結(jié)果，切片均隨機(jī)取5個(gè)400倍視野，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。ILF3、MMP-7、MMP-9、TIMP-1蛋白以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或棕色染色為陽性。采用2次計(jì)分法計(jì)算陽性率：①按染色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分：無色計(jì)為0分，淡黃色計(jì)為1分，棕黃色計(jì)為2分，褐色計(jì)為3分；②按陽性細(xì)胞比例計(jì)分：無陽性細(xì)胞計(jì)為0分，陽性細(xì)胞率＜10%計(jì)為1分，陽性細(xì)胞率11%～50%計(jì)為2分，陽性細(xì)胞率51%～75%計(jì)為3分，陽性細(xì)胞率＞75%計(jì)為4分。細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞比例兩者相乘，結(jié)果≤2為陰性（-），結(jié)果＞2為陽性（+）。

1.3.2 胃癌細(xì)胞株及胃上皮細(xì)胞株培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株MKN28、SGC7901、MGC803及胃上皮細(xì)胞株GES-1于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，取生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 ILF3-siRNA轉(zhuǎn)染 ILF3-siRNA序列：5'-GCG GAUCCGACUACAACUACG-3'；無關(guān)對(duì)照siRNA序列：5'-CGGCUGCAAUCGAUUGAUAGC-3’。轉(zhuǎn)染前將MGC803細(xì)胞按4×105個(gè)/ml接種于6孔板中24 h，用無血清無抗生素的DMEM清洗細(xì)胞，按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000試劑說明書，將siRNA轉(zhuǎn)染胃MGC803細(xì)胞，ILF3-siRNA濃度為40μmol/L。轉(zhuǎn)染24 h后，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.3.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 MGC803細(xì)胞以5×104個(gè)/ml接種于96孔板，生長至70%～80%時(shí)轉(zhuǎn)染ILF3-siRNA或control siRNA。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)20 h后加入20μl（5 mg/ml）的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，各孔加入150μl DMSO，室溫振蕩15 min，用酶標(biāo)儀于波長490 nm測(cè)吸光度值（A值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 MGC803細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)濃度為1×106個(gè)/ml接種至6孔板，細(xì)胞生長至60%～70%時(shí)分別轉(zhuǎn)染ILF3-siRNA或?qū)φ誷iRNA。待細(xì)胞生長至100%后棄去培養(yǎng)液，以PBS沖洗。無菌槍頭在6孔板底部劃痕，PBS洗去刮下的細(xì)胞，鏡下觀察傷口愈合情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell小室上室用100μl Matrigel膠包被，紫外線照射。將消化好的MGC803細(xì)胞以1×106個(gè)/ml的濃度接種于6孔板，細(xì)胞生長至60%～70%時(shí)分別轉(zhuǎn)染ILF3-siRNA或?qū)φ誷iRNA。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各組分別取200μl細(xì)胞接種于Transwell小室上室，在下室加入DMEM培養(yǎng)基。24 h后以棉棒拭去上室的Matrigel膠和多余MGC803細(xì)胞，甲醇固定10 min，以結(jié)晶紫染色后計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 qRT-PCR檢測(cè)增殖和遷移侵襲相關(guān)基因mRNA表達(dá) 一步法提取MGC803細(xì)胞的總RNA，鑒定RNA的完整性、純度及含量。取2μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)檢測(cè)ILF3、MMP-7、MMP-9、TIMP-1基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。各引物序列如下。ILF3：5'-GTGTCCAATCACCAGTCCTG-3'，5'-GCTGAAGAA GTGGGAGTGTAGC-3'；MMP-7：5'-GCTGACATCATGA TTGGCTTT-3'，5'-TCTCCTCCGAGACCTGTCC-3'；MMP-9：5'-TCTTCCAAGGCCAATCCTAC-3'，5'-ATCA CCGTCGAGTCAGCTC-3'；TIMP-1：5'-ACTTCCACAGG TCCCACAAC-3'，5'-GCATTCCTCACAGCCAACAG-3'；GAPDH ：5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3'，（R）5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'。

Western blot檢測(cè) ILF3、MMP-7、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)：提取樣本的總蛋白，應(yīng)用Bradford法蛋白定量后，各樣本取40μg檢測(cè)。十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用TBST緩沖液配制的5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，分別加入稀釋好的各一抗抗體。4℃孵育過夜，用TBST緩沖液漂洗3次，加入辣根過氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法（Chemiluminescence，ECLA）顯色，對(duì)條帶進(jìn)行吸光度掃描，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值代表目的蛋白的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率或百分比表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ILF3在胃癌組織、癌旁組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)（IHC）結(jié)果顯示，ILF3蛋白在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)陽性率最高80.65%（50/62），在胃癌組織中次之64.29%（72/112），在癌旁組織中陽性率最低24.00%（12/50），3組陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 胃癌組織、癌旁組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中ILF3蛋白表達(dá)情況 （IHC ×400）

2.2 胃癌組織ILF3蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤較深、分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期不同的ILF3蛋白陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.169、4.865、7.009和6.728，P=0.007、0.027、0.008和0.010）。其他病理參數(shù)的ILF3蛋白表達(dá)情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 胃癌組織ILF3蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 不同細(xì)胞株中ILF3蛋白表達(dá)情況

Western blot結(jié)果顯示，ILF3蛋白在4株胃癌細(xì)胞株表達(dá)均高于胃上皮細(xì)胞株GES-1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（t=10.196、9.277、6.969和 4.812，P=0.000、0.000、0.002和0.009），在MGC803中ILF3蛋白表達(dá)最強(qiáng)。故選擇MGC803細(xì)胞為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料。見表2、圖2。

表2 不同細(xì)胞株中ILF3蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度（n=3，±s）

表2 不同細(xì)胞株中ILF3蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度（n=3，±s）

注：?與GES-1比較，P＜0.05

不同細(xì)胞株 ILF3蛋白強(qiáng)度BGC823 1.012±0.092?MGC803 1.142±0.131?MKN28 0.785±0.084?SGC7901 0.624±0.068?GES-1 0.381±0.055

圖2 不同細(xì)胞株中ILF3蛋白表達(dá)情況

2.4 ILF3-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MGC803細(xì)胞ILF3表達(dá)的影響

Western-blot結(jié)果顯示，以40μmol/L轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中ILF3蛋白表達(dá)低于對(duì)照組及空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.494，P=0.002；對(duì)照組與空白組q=-2.687，對(duì)照組與ILF3-siRNA組q=6.144，空白組與ILF3-siRNA組q=8.831）。見表3、圖3。

表3 干預(yù)后各組ILF3蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度（n=3，±s）

表3 干預(yù)后各組ILF3蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度（n=3，±s）

注：?與對(duì)照組及空白組比較，P＜0.05

組別 ILF3蛋白強(qiáng)度對(duì)照組 0.644±0.084空白組 0.686±0.072 ILF3-siRNA組 0.328±0.041?

圖3 ILF3-siRNA對(duì)MGC803細(xì)胞ILF3蛋白表達(dá)的影響

2.5 ILF3-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MGC803細(xì)胞活性的影響

40μmol/L轉(zhuǎn) 染 MGC803細(xì) 胞 48 h后，ILF3-siRNA組細(xì)胞活性（0.426±0.062）低于對(duì)照組（0.778±0.079）及空白組（0.792±0.081），3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=56.369，P=0.000；對(duì)照組與空白組q=-2.495，對(duì)照組與ILF3-siRNA組q=11.576，空白組與ILF3-siRNA組q=14.071）。見表4、圖4。

表4 干預(yù)后各組細(xì)胞活性情況 （n=6，±s）

表4 干預(yù)后各組細(xì)胞活性情況 （n=6，±s）

注：?與對(duì)照組及空白組比較，P＜0.05

組別 細(xì)胞活性對(duì)照組 0.778±0.079空白組 0.792±0.081 ILF3-siRNA 組 0.426±0.062?

圖4 ILF3-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MGC803細(xì)胞活性的影響

2.6 ILF3-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MGC803細(xì)胞侵襲遷移能力的影響

ILF3-siRNA轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞后，劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ILF3-siRNA的MGC803細(xì)胞遷移能力明顯低于對(duì)照組和空白組，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=75.713，P＜0.05；對(duì)照組與空白組q=0.027，對(duì)照組與ILF3-siRNA組q=15.085，空白組與ILF3-siRNA組q=15.058）。Transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ILF3-siRNA的MGC803細(xì)胞侵襲能力低于對(duì)照組和空白組，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=52.771，P＜0.05；對(duì)照組與空白組q=-3.001，對(duì)照組與ILF3-siRNA組q=10.810，空白組與ILF3-siRNA組q=13.812）。見表5。

2.7 ILF3-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MGC803細(xì)胞MMP-7、MMP-9、TIMP-1基因表達(dá)的影響

以40μmol/L轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞48 h后，MMP-7、MMP-9基因mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，而TIMP-1基因mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。對(duì)照組與空白組各基因表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

表5 ILF3-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MGC803細(xì)胞侵襲遷移能力的影響 （n=6，±s）

表5 ILF3-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MGC803細(xì)胞侵襲遷移能力的影響 （n=6，±s）

注：?與對(duì)照組及空白組比較，P＜0.05

組別 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果ILF3-siRNA組 22.17±2.23? 13.33±1.97?對(duì)照組 39.50±4.04 25.17±2.79空白組 40.67±2.58 26.50±3.02

圖5 ILF3-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞MMP-7、MMP-9、TIMP-1基因表達(dá)的影響

3 討論

胃癌患者的預(yù)后較差，目前進(jìn)展期胃癌患者5年生存率低于40%[6]。雖然胃癌的診治技術(shù)已取得了很大進(jìn)展，但胃癌治療的遠(yuǎn)期效果改善依然不能令人滿意。胃癌預(yù)后差的重要原因在于胃癌細(xì)胞有較強(qiáng)的侵襲及遷移能力[7]，這種能力使胃癌早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移；而且在轉(zhuǎn)移過程中腫瘤細(xì)胞還會(huì)發(fā)生進(jìn)一步變化[8]，導(dǎo)致治療措施失效，從而成為胃癌復(fù)發(fā)及進(jìn)一步轉(zhuǎn)移的原因。因此，確定在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的基因?qū)ξ赴┚C合診治有重要意義。ILF3是近年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤關(guān)系密切的新基因。有研究發(fā)現(xiàn)ILF3/p21通路與調(diào)控細(xì)胞周期有關(guān)，從而參與B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病的進(jìn)展[9]。還有研究發(fā)現(xiàn)ILF3基因編碼的NF90蛋白對(duì)周期素E1（Cyclin E1）有直接調(diào)控作用，可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期而參與肝細(xì)胞癌的增殖[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中ILF3蛋白的表達(dá)比正常胃黏膜明顯增強(qiáng)，且與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，提示ILF3蛋白可能在胃癌的進(jìn)展中發(fā)揮了作用。研究還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中ILF3蛋白表達(dá)陽性率高于原發(fā)灶，說明ILF3蛋白可能在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中通過增強(qiáng)表達(dá)促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移。

為了解ILF3基因在胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用，本研究進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)。通過Western blot篩選，發(fā)現(xiàn)低分化黏液腺癌來源的MGC803細(xì)胞中ILF3蛋白表達(dá)最強(qiáng)，故進(jìn)一步研究中對(duì)MGC803細(xì)胞的ILF3基因進(jìn)行了抑制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MGC803細(xì)胞中內(nèi)源性ILF3基因受到抑制后腫瘤細(xì)胞的活性減弱，侵襲遷移能力也降低。說明ILF3基因在胃癌細(xì)胞的侵襲遷移過程中發(fā)揮了促進(jìn)作用，抑制ILF3基因表達(dá)可能抑制腫瘤進(jìn)展。

為初步了解ILF3基因參與胃癌侵襲遷移的機(jī)制，本研究檢測(cè)了抑制ILF3基因前后腫瘤侵襲遷移相關(guān)基因MMP-7、MMP-9、TIMP-1基因的表達(dá)變化。MMPs-TIMPs是影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要基因家族，MMP-7、MMP-9、TIMP-1是其中重要成員，MMP-7、MMP-9對(duì)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲遷移有重要作用，而TIMP-1則具有抑制MMP-9等基因的作用[11-14]。本研究顯示，抑制MGC803細(xì)胞中ILF3表達(dá)后細(xì)胞的MMP-7、MMP-9表達(dá)降低，而TIMP-1的表達(dá)升高，提示胃癌細(xì)胞中ILF3基因可能通過調(diào)節(jié)MMP-7、MMP-9、TIMP-1參與了胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程，但深入的分子機(jī)制還有待深入研究。

[1]YANG Z G,GAO L,GUO X B,et al.Roles of long non-coding RNAs in gastric cancer metastasis[J].World J Gastroenterol,2015,21(17): 5220-5230.

[2]SHI Z,WEI Q,SHE J.MicroRNAs in gastric cancer metastasis[J].Crit Rev Eukaryot Gene Expr,2014,24(1): 39-53.

[3]CASTELLA S,BERNARD R,CORNO M,et al.Ilf3 and NF90 functions in RNA biology[J].Wiley Interdiscip Rev RNA,2015,6(2): 243-256.

[4]LI Y,MASAKI T,SHIMAKAMI T,et al.hnRNP L and NF90 interact with hepatitis C virus 5’-terminal untranslated RNA and promote ef fi cient replication[J].J Virol,2014,88(13): 7199-7209.

[5]WEN X,HUANG X,MOK BW,et al.NF90 exerts antiviral activity through regulation of PKR phosphorylation and stress granules in infected cells[J].J Immunol,2014,192(8): 3753-3764.

[6]LI Y,ZHAO Q,FAN L Q,et al.Analysis of lymph node dissection range-related factors for early gastric cancer operation[J].Hepatogastroenterology,2013,60(125): 971-974.

[7]WANG J,QU J,LI Z,et al.A prognostic model in metastatic or recurrent gastric cancer patients with good performance status who received fi rst-line chemotherapy[J].Transl Oncol,2016,9(3): 256-261.

[8]LI Y,TAN B B,FAN L Q,et al.Heterogeneity for COX-2,multidrugs resistance between primary tumors and regional lymph node metastases of gastric cancer[J].Tumori,2012,98(4): 516-522.

[9]AGNOLETTO C,BRUNELLI L,MELLONI E,et al.The antileukemic activity of sodium dichloroacetate in p53mutated/null cells is mediated by a p53-independent ILF3/p21 pathway[J].Oncotarget,2015,6(4): 2385-2396.

[10]JIANG W,HUANG H,DING L,et al.Regulation of cell cycle of hepatocellular carcinoma by NF90 through modulation of cyclin E1 mRNA stability[J].Oncogene,2015,34(34): 4460-4470.

[11]SUI H,XU H,JI Q,et al.5-hydroxytryptamine receptor(5-HT1DR) promotes colorectal cancer metastasis by regulating Axin1/β-catenin/MMP-7 signaling pathway[J].Oncotarget,2015,6(28): 25975-25987.

[12]MERDAD A,KARIM S,SCHULTEN H J,et al.Expression of matrix metalloproteinases (MMPs) in primary human breast cancer: MMP-9 as a potential biomarker for cancer invasion and metastasis[J].Anticancer Res,2014,34(3): 1355-1366.

[13]AN H J,LEE Y J,HONG S A,et al.The prognostic role of tissue and serum MMP-1 and TIMP-1 expression in patients with nonsmall cell lung cancer[J].Pathol Res Pract,2016,212(5): 357-364.

[14]FAN H,JIANG W,LI H,et al.MMP-1/2 and TIMP-1/2 expression levels,and the levels of collagenous and elastic fi bers correlate with disease progression in a hamster model of tongue cancer[J].Oncol Lett,2016,11(1): 63-68.