抗菌肽LL-37與膀胱尿路上皮癌關(guān)系的初步探討*

朱波，曾琪，潘廣瑞，趙暉

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，云南 昆明 650032）

抗菌肽LL-37是人體內(nèi)固有免疫成員。近來(lái)研究表明，其在抗感染、免疫調(diào)節(jié)、促血管生成、抑癌及促癌等方面均發(fā)揮生物學(xué)作用[1]。且作為泌尿道重要的天然免疫因子，在從腎盂到膀胱黏膜的上皮中均有表達(dá)，并在細(xì)菌侵入時(shí)迅速合成和分泌，提示其與泌尿系感染密切相關(guān)[2]。MICHAUD等[3]發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥可促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生。同時(shí)也有研究顯示膀胱癌會(huì)被急性炎癥抑制[4]。SUTTMANN等[5]還報(bào)道合成抗菌肽天蠶素A、B可抑制膀胱癌的增殖，對(duì)良性的纖維母細(xì)胞則幾乎沒(méi)有影響。這些發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)筆者聯(lián)想到LL-37和膀胱癌間的聯(lián)系，該實(shí)驗(yàn)旨在初步探討兩者的關(guān)系，為今后研究奠定基礎(chǔ)，以期望為膀胱癌的治療找到一條新的途徑。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

T24、EJ和SV-HUC-1細(xì)胞株均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫(kù)，LL-37ELISA試劑盒購(gòu)自荷蘭Hycult公司，LL-37由上海吉爾生化有限公司合成，PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，β-actin多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗人LL-37多克隆抗體由美國(guó)Abcam公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 膀胱癌T24、EJ細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，SV-HUC-1細(xì)胞則僅將基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為DMEM高糖，均置于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱，每2、3天更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)傳代。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)尿液、細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LL-37的水平 2014年1月-2014年6月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院膀胱癌患者30例，并隨機(jī)選取30例健康志愿者，收集他們的新鮮晨尿后照LL-37檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。將3株細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的密度接種于24孔板，300μl/孔，待細(xì)胞匯合度達(dá)60%時(shí)更換無(wú)血清培養(yǎng)液，分別加入1、5和10μg/ ml LPS，各設(shè)3個(gè)副孔及空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)后照LL-37檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書對(duì)各孔進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 免疫組織化學(xué)和RT-PCR檢測(cè)膀胱癌組織及其周圍組織LL-37的表達(dá) 2014年1月-2014年9月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院膀胱癌患者30例，術(shù)中取癌組織標(biāo)本及其周圍1 cm以內(nèi)的黏膜、肌層組織標(biāo)本（外觀上無(wú)明顯炎癥反應(yīng)），作為腫瘤組、癌旁組。依據(jù)免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書操作，反應(yīng)后呈棕黃色判定為L(zhǎng)L-37陽(yáng)性。參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)并合成LL-37引物，正向引物：5'-GATA ACAAGAGATTTGCCCTGCTG-3'，反向引物：5'-TTTC TCAGAGCCCAGAAGCCTG-3'，擴(kuò)增片段大小為173 bp，內(nèi)參照β-actin正向引物：5'-CCCATCTATG AGGGTTACGC-3'，反向引物：5'-TTTAATGTCACGC ACGATTC-3'，擴(kuò)增片段大小為150 bp，均由上海華大基因公司合成。采用Trizol法提取組織總RNA。PCR反 應(yīng) 體 系：模 板 DNA 1μl、10×PCR buffer 5μl、dNTPs 4μl、LL-37正 反 向 引 物 各 0.5μl、ddH2O 15μl、TaqDNA 聚 合酶 0.25μl。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸3 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。反應(yīng)后對(duì)PCR反應(yīng)液行瓊脂糖凝膠電泳以確認(rèn)RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物（約173 bp）。若該位置有條帶，則用瓊脂糖凝膠回收并行克隆和測(cè)序。最后照PCR試劑盒說(shuō)明書行RT-PCR反應(yīng)，結(jié)束后確認(rèn)RT-PCR的擴(kuò)增和融解曲線及PCR定量時(shí)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)LL-37處理的增殖情況將3株細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的密度接種于96孔板，100μl/孔。分別加入22.5、45.0、90.0、180.0和270.0μg/ml LL-37，各設(shè)5個(gè)副孔及空白對(duì)照組。24 h后加入20μl/孔 MTT（5mg/ml），孵育4 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150μl/孔 DMSO混勻10 min。酶標(biāo)儀上測(cè)490 nm處吸光度OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來(lái)表示，兩獨(dú)立樣本比較用t檢驗(yàn)，各組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尿液、組織標(biāo)本及細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LL-37的表達(dá)

2.1.1 膀胱癌患者尿液中LL-37水平 膀胱癌組和健康對(duì)照組的LL-37水平分別為（24.32±0.02）和（2.02±0.06）ng/ml，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1 931.240，P=0.000），膀胱癌患者尿液中LL-37水平較健康對(duì)照組升高。

2.1.2 各組織中LL-37的表達(dá) LL-37在膀胱癌組織中表達(dá)陰性，而在癌組織周圍的炎癥細(xì)胞、血管壁及平滑肌內(nèi)卻呈陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖1。

2.1.3 各組織中LL-37的表達(dá) 以β-actin的PCR產(chǎn)物條帶亮度作為陽(yáng)性對(duì)照，亮度越高提示LL-37表達(dá)越高，可見(jiàn)膀胱癌旁組織中LL-37的表達(dá)比癌組織相對(duì)較高。見(jiàn)圖2。

經(jīng)過(guò)RT-PCR得出膀胱癌組織和膀胱癌旁組織中LL-37基因表達(dá)的Ct值Ct癌、Ct癌旁，分別與內(nèi)參β-actin的Ct值Ct內(nèi)參比較，經(jīng)過(guò)公式2ΔCt=2Ct癌/癌旁-Ct內(nèi)參計(jì)算后可見(jiàn)膀胱癌旁組織中LL-37的表達(dá)約是癌組織的30倍。見(jiàn)圖3。

2.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LL-37的表達(dá) SVHUC-1、T24、EJ細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LL-37濃度均升高，提示隨著LPS濃度增加，3株細(xì)胞中LL-37表達(dá)升高。見(jiàn)表1。

2.2 體外LL-37作用后細(xì)胞的增殖情況

如表2所示，各濃度LL-37的T24、EJ、SVHUC-1細(xì)胞的吸光度值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)T24、EJ細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且呈一定劑量依賴性，而LL-37在濃度達(dá)270μg/ml時(shí)才表現(xiàn)出對(duì)SV-HUC-1細(xì)胞的抑制作用。

圖1 各組織中LL-37的表達(dá) （免疫組織化學(xué)法×100）

圖2 各組織中LL-37的表達(dá)

圖3 癌及癌旁組織LL-37的相對(duì)表達(dá)

表1 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LL-37的表達(dá)（n=4，ng/ml，±s）

表1 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LL-37的表達(dá)（n=4，ng/ml，±s）

注：? 與 0μg/ml組比較，P＜0.05

組別 SV-HUC-1 T24 EJ 0μg/ml 8.09±0.12 5.32±1.84 7.53±0.12 1μg/ml 9.41±0.67 20.78±2.84? 7.99±0.55 5μg/ml 41.41±3.28? 50.15±4.07? 10.27±0.59?10μg/ml 54.00±2.89? 62.51±0.54? 13.33±0.34?F值 435.308 389.821 144.225 P值 0.000 0.000 0.000

表2 MTT檢測(cè)細(xì)胞的吸光度值比較 （n=6，±s）

表2 MTT檢測(cè)細(xì)胞的吸光度值比較 （n=6，±s）

注：? 與 0.0μg/ml組比較，P＜0.05

T24 EJ SV-HUC-1 0.0μg/ml 0.703±0.0461 0.922±0.0592 0.342±0.0056 22.5μg/ml 0.579±0.0469? 0.773±0.1096? 0.339±0.0096 45.0μg/ml 0.555±0.0229? 0.708±0.0939? 0.336±0.0077 90.0μg/ml 0.541±0.0331? 0.576±0.0485? 0.329±0.0104 180.0μg/ml 0.505±0.0236? 0.413±0.0311? 0.330±0.0061 270.0μg/ml 0.384±0.0239? 0.226±0.0664? 0.289±0.0074?F值 54.720 83.360 35.830 P值 0.000 0.000 0.000組別

3 討論

近年來(lái)研究顯示，LL-37與腫瘤的關(guān)系很微妙，其可抑制胃癌、結(jié)腸癌細(xì)胞的增值，又能促進(jìn)乳腺癌、卵巢癌、肺癌的生長(zhǎng)[7]，更值得一提的是LL-37可在同一腫瘤中表現(xiàn)為抗癌和促癌作用。VON等[8]發(fā)現(xiàn)，20～30 ng/ml LL-37可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增值，而將其濃度調(diào)為20μg/ml后癌細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。LI等[9]發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞分泌的Cathelicidin類抗菌肽可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)；與REN等[10]的研究結(jié)論不同之處也在于其所用的LL-37濃度為生理水平甚至更低，用于人、鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的各為1μg/ml、100 ng/ml，而文獻(xiàn)中LL-37的濃度為20～60μmol/l。由此可見(jiàn)LL-37濃度的差異對(duì)腫瘤的影響。

該實(shí)驗(yàn)中LL-37在膀胱癌患者尿液中的濃度較健康志愿者高，那么這一升高的LL-37來(lái)源于何處呢？結(jié)合免疫組織化學(xué)法結(jié)果來(lái)看，LL-37主要表達(dá)在癌組織周圍的平滑肌、炎癥細(xì)胞及血管壁等處，而在癌組織中表達(dá)陰性，提示這一升高的LL-37很可能來(lái)自于這些癌旁組織或者說(shuō)是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境中的炎癥細(xì)胞等分泌。且最近有研究表明，胰腺導(dǎo)管腺癌微環(huán)境中的LL-37在胰腺腫瘤干細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生中起著關(guān)鍵性的作用[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)，髓細(xì)胞表達(dá)的鼠同源Cathelicidin抗菌肽CLAMP可通過(guò)募集炎癥細(xì)胞促進(jìn)肺癌的生長(zhǎng)，且腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌可溶性因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中LL-37的表達(dá)，提示LL-37、炎癥和腫瘤有著密切的聯(lián)系[12]。朱小丹等[13]在體外將巨噬細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞共同培養(yǎng)以構(gòu)建簡(jiǎn)化的腫瘤微環(huán)境模型時(shí)，也發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞可通過(guò)增強(qiáng)抗菌肽LL-37的表達(dá)和分泌促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。這些研究提示，腫瘤微環(huán)境中LL-37的存在及其對(duì)腫瘤的影響。該研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織的微環(huán)境中有明顯的LL-37表達(dá)，且經(jīng)LPS刺激后膀胱癌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中也有其濃度的升高，提示這些濃度范圍內(nèi)的LL-37對(duì)膀胱尿路上皮癌是沒(méi)有害處的。然而，當(dāng)在體外使用22.5～270μg/ml LL-37時(shí)，其可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，而對(duì)正常尿路上皮細(xì)胞的抑制作用則不明顯，表明在一定的濃度范圍內(nèi)LL-37對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更大。同時(shí)研究表明，多西他賽搭載LL-37后的溫敏凝膠顆?？商岣邔?duì)大腸癌腹膜轉(zhuǎn)移癌的抗癌效果，提示治療腫瘤時(shí)可聯(lián)合使用LL-37[14]。對(duì)于該研究中提示的體內(nèi)外LL-37的不同作用，筆者認(rèn)為和前述的LL-37在同一腫瘤中表現(xiàn)為抗癌和促癌一樣，是由濃度的差異所引起的。

另外，有學(xué)者在探討LL-37對(duì)卵巢癌的作用時(shí)，采用基因芯片技術(shù)對(duì)LL-37在膀胱癌的表達(dá)也進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，1例膀胱癌組織中有明顯的LL-37表達(dá)，這可能是由于其在采集腫瘤組織標(biāo)本中的同時(shí)也包含了膀胱平滑肌、血管等組織，且只有1例，而與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果有出入[15]。而最新研究結(jié)果顯示，膀胱癌細(xì)胞可通過(guò)分泌LL-37來(lái)抑制BCG的內(nèi)化，在加入LL-37抗體后，BCG的抗腫瘤效應(yīng)又明顯增強(qiáng)，提示一定濃度的LL-37可能更適應(yīng)膀胱腫瘤的生長(zhǎng)，這在某些方面上與該研究結(jié)論有著相似之處[16]。然而，該研究中關(guān)于LL-37和膀胱尿路上皮癌的探討還僅限于初級(jí)階段，尚需后期進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)闡釋兩者間復(fù)雜的關(guān)系。

該研究通過(guò)LPS刺激可誘發(fā)T24、EJ和SVHUC-1細(xì)胞分泌LL-37，表明除了正常尿路上皮細(xì)胞，膀胱尿路上皮癌細(xì)胞同樣可以產(chǎn)生LL-37。同時(shí)，筆者還發(fā)現(xiàn)膀胱腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中存在著一定濃度的LL-37，提示其可能在腫瘤的發(fā)病中起到一定作用，然而是腫瘤細(xì)胞促進(jìn)LL-37的產(chǎn)生，還是LL-37誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，尚需進(jìn)一步證實(shí)。且該研究中僅檢測(cè)30例膀胱癌患者的腫瘤組織標(biāo)本，樣本數(shù)不是很大，但其還是在一定程度上提示LL-37與膀胱尿路上皮癌的相關(guān)性。另外，體外高濃度的LL-37可抑制膀胱癌T24、EJ細(xì)胞的增殖。

[1]WONG J H,YE X J,NG T B.Cathelicidins: peptides with antimicrobial,immunomodulatory,anti-in fl ammatory,angiogenic,anticancer and procancer activities[J].Curr Protein Pept Sci,2013,14(6): 504-514.

[2]CHROMEK M,SLAMOVA Z,PETER BERGMAN P,et al.The antimicrobial peptide cathelicidin protects theurinary tract against invasive bacterial infection[J].Nature Medicine,2006,6(12): 636-641.

[3]MICHAUD D S.Chronic in fl ammation and bladder cancer[J].Urol Oncol,2007,25(3): 260-268.

[4]OFFERSEN B V,KNAP M M,MARCUSSEN N,et al.Intense inflammation in bladder carcinomais associated with angiogenes is and indicates goodprognosis[J].British Journal Ofcancer,2002,87(12): 1422-1430.

[5]SUTTMANN H,RETZ M,PAULSEN F,et al.Antimicrobial peptides of the Cecropin-family show potent antitumor activity against bladder cancer cells[J].BMC Urology,2008,8(1): 5.

[6]GENNARO R,ZANETTI M.Structural features and biological activities of the cathelicidin-derived antimicrobial peptides[J].Biopolymers,2000,55(l): 31-49.

[7]KURODA K,OKUMURA K,ISOGAI H,et al.The human cathelicidin antimicrobialpeptide LL-37 and mimics are potential anticancer drugs[J].Frontiers in Oncology,2015,5(144): 1-10.

[8]VON H J,KOCZULLA R,SHAYKHIEV R,et al.The host defence peptide LL-37/hCAP-18 is a growth factor for lung cancer cells[J].Lung Cancer,2008,59(1): 12-23.

[9]LI D,LIU W F,WANG X,et al.Cathelicidin,an antimicrobial peptide produced by macrophages,promotes colon cancer by activating the Wnt/β-catenin pathway[J].Oncotarget,2015,6(5):2939.

[10]REN S X,CHENG A S,TO K F,et al.Host immune defense peptide LL-37 activates caspase-independent apoptosis and suppresses coloncancer[J].Cancer Research,2012,72(24): 6512-6523.

[11]SAINZ B,ALCALA S,GARCIA E,et al.Microenvironmental hCAP-18/LL-37 promotes pancreatic ductal adenocarcinoma by activating its cancer stem cell compartment[J].Gut,2015,64(12):1921-1935.

[12]LI D,BEISSWENGER C,HERR C,et al.Expression of the antimicrobial peptide cathelicidin in myeloid cells is required for lung tumor growth[J].Oncogene,2014,33(21): 2709.

[13]朱小丹,許文娟,嚴(yán)曉,等.巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌抗菌肽 LL-37/hCAP-18調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2016,45(1): 120-125.

[14]FAN R R,TONG A P,LI X L,et al.Enhanced antitumor effects by docetaxel/LL37-loaded thermosensitive hydrogel nanoparticles in peritoneal carcinomatosis of colorectal cancer[J].International Journal of Nanomedicine,2015,10: 7291.

[15]COFFELT S B,WATERMAN R S,FLOREZ L,et al.Ovarian cancers overexpress the antimicrobial protein hCAP-18 and its derivative LL-37 increases ovarian cancer cell proliferation and invasion[J].Intanaional Journal of Cancer,2008,122(5): 1030-1039.

[16]CHOI S Y,KIM S J,CHI B H,et al.Modulating the internalization of bacille Calmette-Guérin by cathelicidin in bladder cancercells[J].Urology,2015,85(4): 964.