神經(jīng)細(xì)胞分化中microRNA-134靶基因網(wǎng)絡(luò)功能分析*

蘇立寧，尹海峰，宋小青，魏會平

（河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 張家口 075000）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種重要的多功能干細(xì)胞，具有取材方便，分化易控制等特點。研究表明，在合適的誘導(dǎo)條件下BMSCs可向成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多方向分化[1-7]。研究[8-9]發(fā)現(xiàn)在特殊的培養(yǎng)條件下，BMSCs可分化為神經(jīng)細(xì)胞，但有關(guān)其分子機制還有待進(jìn)一步研究。

MicroRNAs，是一種短的非編碼單鏈RNA，長約20～24個核苷酸，通過堿基互補配對原則，與mRNA結(jié)合，直接靶向切割mRNA或抑制靶基因的翻譯對轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。MicroRNAs通過與mRNA結(jié)合可調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能[10]，腦特異性microRNA-134在神經(jīng)突生成及突觸成熟等發(fā)育階段發(fā)揮調(diào)控作用[10-11]。研究[12]表明microRNA-134通過抑制單絲氨酸蛋白激酶1（LIM-kinase 1，LIMK1）控制神經(jīng)突的生成或脊柱的生長，通過降低胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白NANOG和肝受體類似物L(fēng)RH1的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)節(jié)小鼠BMSCs的分化[13]。本實驗推測microRNA-134在神經(jīng)分化過程中發(fā)揮重要作用。

為了進(jìn)一步驗證microRNA-134在BMSCs向神經(jīng)分化過程中的功能，本實驗檢測了神經(jīng)分化過程中microRNA-134表達(dá)量的變化，利用生物信息學(xué)軟件對其靶基因進(jìn)行預(yù)測，結(jié)合所研究的目標(biāo)，分析與神經(jīng)分化相關(guān)的基因。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4～6周齡大鼠3只，購自河北北方學(xué)院實驗動物中心。

1.2 主要試劑

DMEM購自美國Gibco公司，堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）購自上海PrimeGene Bio-Tech公司，RNA提取試劑盒和兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）引物購自日本TaKaRa公司，兔抗巢蛋白（nestin）和NSE購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 BMSCs的分離與培養(yǎng)

頸椎脫臼法處死大鼠，75%的酒精浸泡10 min消毒，無菌條件下取出股骨，置無菌PBS液中清洗2次，露出骨髓腔，用5 ml的無菌注射器吸取含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集洗液，置無菌培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，72 h后換液去除未貼壁的細(xì)胞，每隔3 d換液1次，待細(xì)胞密度達(dá)80%左右時按1∶2進(jìn)行傳代，直至第4代。流式細(xì)胞儀檢測BMSCs的表面標(biāo)志物。

1.4 BMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞

取第4代的細(xì)胞分為兩組，對照組不加任何因子，誘導(dǎo)組加入含20 ng/ml EGF和20 ng/ml bFGF的誘導(dǎo)液。對照組每隔3 d換液1次，誘導(dǎo)組每隔2 d半量換液。

1.5 MicroRNA-134表達(dá)量分析

收集對照組細(xì)胞和誘導(dǎo)組細(xì)胞（誘導(dǎo)1、2、3、4 d）。利用RNA提取試劑盒分別提取兩組總RNA。采用microRNA-134逆轉(zhuǎn)錄引物，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測microRNA-134在兩組不同時間點的表達(dá)量變化，反應(yīng)體系為95℃ 5 min，94℃ 30 s 40個循環(huán)，60℃30 s，72℃ 30 s。成熟 microRNA-134的正向擴增引物為5'-CGTGTGACTGGTTGACC-3'，反向引物5'-GAGCAGGCTGGAGAA-3'。內(nèi)參β-actin 的正向引物為5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，反向引物為5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。采用Ct值比較法[14]，比較兩組的表達(dá)差異。

1.6 MicroRNA-134靶基因預(yù)測及GO功能富集

利用數(shù)據(jù)庫miRWalk[15]對microRNA-134靶基因進(jìn)行預(yù)測。預(yù)測得到的靶基因上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Gene Ontology（GO）功能富集分析，篩選與神經(jīng)分化相關(guān)的基因，應(yīng)用Fisher’s exact test方法選取P＜0.05注釋基因條目。

1.7 神經(jīng)分化相關(guān)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將選取的神經(jīng)分化相關(guān)基因輸入到STRING 10[16]數(shù)據(jù)庫中，選取交互作用評分＜0.7（高等可信度）的互作關(guān)系構(gòu)建神經(jīng)分化相關(guān)基因的蛋白互作網(wǎng) 絡(luò)（protein- protein interaction network，PPI）。 網(wǎng)絡(luò)分析采用生物圖表可視化工具Cytoscape3.2.1軟件[17]進(jìn)行，且利用“Network Analyzer”工具對各節(jié)點的“度”進(jìn)行計算?！岸取贝砹伺c目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白的數(shù)量。網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點越大，“度”越大。利用 Cytoscape3.2.1軟件中的“ClusterONE”工具對蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能模塊分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為minimum size=6，minimum density=0.05，P＜0.05。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各指標(biāo)間比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的鑒定結(jié)果

大鼠骨髓中獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后半量換液，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%傳代，3代細(xì)胞生長較穩(wěn)定，密度較均勻，形態(tài)以長梭形為主，符合BMSCs的細(xì)胞形態(tài)特征。待細(xì)胞傳至4代，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的表面標(biāo)志物，檢測結(jié)果顯示，標(biāo)志物CD29和CD90表達(dá)陽性，CD34和CD45表達(dá)弱陽性，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特點（見圖1）。

圖1 BMSLs的鑒定結(jié)果

2.2 BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化結(jié)果

向傳至第4代的BMSCs中加入含20 ng/ml EGF和20 ng/ml bFGF的誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)2～3 d后，出現(xiàn)少量的神經(jīng)樣細(xì)胞；繼續(xù)誘導(dǎo)4 d，大部分已分化為神經(jīng)樣細(xì)胞（見圖2A）。免疫組織化學(xué)法檢測分化后神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物nestin和NSE的表達(dá)量，結(jié)果為陽性（見圖2B）。收集對照組誘導(dǎo)1～4 d的細(xì)胞，利用qRTPCR進(jìn)行NSE基因表達(dá)量的檢測，結(jié)果顯示誘導(dǎo)4 d后，NSE基因的表達(dá)量達(dá)到高峰。與對照組相比，誘導(dǎo)組1～4 d后表達(dá)量分別升高1.08、1.25、2.01和2.94倍（見圖2C），其中，誘導(dǎo)組第3和4天表達(dá)量與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 BMSCs誘導(dǎo)分化后microRNA-134表達(dá)量的變化

誘導(dǎo)組與對照組細(xì)胞培養(yǎng)1、2、3及4 d的microRNA-134表達(dá)量比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點間的microRNA-134表達(dá)量有差別（F=69.711，P=0.003），②誘導(dǎo)組與對照組細(xì)胞的microRNA-134表達(dá)量有差別（F=18.096，P=0.021），誘導(dǎo)組與對照組相比microRNA-134表達(dá)量較高，可誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，③不同誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)方法間存在交互作用，誘導(dǎo)組與對照組的不同誘導(dǎo)時間有差別（F=5.390，P=0.014）。見表1。

2.4 MicroRNA-134靶基因網(wǎng)絡(luò)相互作用分析

為了進(jìn)一步研究microRNA-134在神經(jīng)分化中的作用，利用在線數(shù)據(jù)庫miRWalk預(yù)測microRNA-134靶基因，得到1 220個靶基因。將靶基因輸入到DAVID軟件6.7中進(jìn)行GO（P＜0.05）功能富集分析，選取與神經(jīng)分化相關(guān)的GO功能組：GO 0030182和GO 0048667（見表2）。

2.5 GO 0030182和GO 0048667 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

圖2 BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞的鑒定結(jié)果

表1 microRNA-134表達(dá)量的變化 （±s）

表1 microRNA-134表達(dá)量的變化 （±s）

組別 第1天 第2天 第3天 第4天對照組 0.018±0.002 0.019±0.002 0.021±0.002 0.021±0.001誘導(dǎo)組 0.037±0.003 0.041±0.003 0.045±0.003 0.050±0.002

表2 與神經(jīng)分化相關(guān)的microRNA-134靶基因

為了預(yù)測與神經(jīng)元分化相關(guān)的靶基因（GO 0030182和GO 0048667）及與其他基因之間的蛋白質(zhì)相互作用，利用STRING10數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，然后利用生物圖表可視化工具Cytoscape3.2.1軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，且利用“Network Analyzer”工具對各節(jié)點的“度”進(jìn)行計算（見圖3）。構(gòu)建結(jié)果顯示，21個靶基因蛋白均與STRING數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)匹配，這21個基因為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3，CASP3）、靶向整合素β1（Integrinβ1，ITGB1）、血小板激活因子乙酰水解酶bata1（plateletactivating factor acetylhydrolase，PAFAH1B1）、蛋白激酶C（Protein kinase C alpha，PRKCA）、酪氨酸蛋白激酶A4（tyrosine protein kinase A4，EPHA4）、肝配蛋白A2（Ephrin-A2，EFNA2）、NK6 同源框蛋白 1（NKX6-1）、神經(jīng)細(xì)胞黏著分子（neural cell adhesion molecule，NRCAM）、突觸融合蛋白結(jié)合蛋白1基因（synaptic fusion protein binding protein 1 gene，STXBP1）、鉀離子通道相關(guān)作用蛋白2（Kv channel-interacting protein 2，KCNIP2）、蛋白磷酸酶ABI2、腺嘌呤核苷A2a受體（adenine nucleoside both A2a receptors，ADORA2A）、接觸蛋白2（contactin-2，CNTN2）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子DST、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子 FOXA1（forkhead box A1）、SEPT2（septin-2）、微管相關(guān)蛋白 Doublecortin（DCX）、ETS變異基因1（ETS gene variant 1，ETV1）、腱蛋白樣蛋白1（cordin-like 1，CHRDL1）、生長休止蛋白7（growth arrest-specific，GAS7）和蛋白酪氨酸磷酸酶受體M（protein tyrosine phosphatase receptor type M，PTPRM）。利用Cytoscape3.2.1軟件中的“ClusterONE”工具進(jìn)行了模塊分析，結(jié)果12個基因被聚集在模塊中（見圖4）。

圖3 MicroRNA-134靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)分析

圖4 MicroRNA-134靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)的11個模塊 黃色節(jié)點代表靶基因，紅色節(jié)點代表與靶基因蛋白相互作用的蛋白。節(jié)點越大，“度”越大

3 討論

MicroRNAs通過作用于靶基因調(diào)控細(xì)胞分化等各種生物學(xué)過程。

MicroRNA-134具有腦特異性，在神經(jīng)中樞中高表達(dá)。而microRNA-134在BMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞過程中的作用機制還有待研究。

許多研究已證明EGF和bFGF聯(lián)合作用可以誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化[18]，因此本實驗選擇的誘導(dǎo)劑為EGF和bFGF。利用qRT-PCR檢測microRNA-134在各實驗組的表達(dá)量變化，誘導(dǎo)組隨誘導(dǎo)時間的遞增表達(dá)量升高。因此初步假設(shè)microRNA-134在促進(jìn)BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞過程中發(fā)揮作用。以往的研究證明[19]，microRNA-134通過降低轉(zhuǎn)錄因子蛋白FOXM1的表達(dá)量調(diào)控人類多能干細(xì)胞分化發(fā)揮作用。神經(jīng)系統(tǒng)中，LIMK1通過抑制microRNA-134的表達(dá)量調(diào)節(jié)神經(jīng)突的生成、脊柱的生長及樹突棘的大小[12，20]。另外還有研究發(fā)現(xiàn)沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1通過轉(zhuǎn)錄抑制因子復(fù)合體作用于microRNA-134調(diào)控神經(jīng)突觸的可塑性[21]。本實驗初步驗證了在神經(jīng)分化過程中microRNA-134表達(dá)量升高，與前人的結(jié)論一致。MicroRNA-134以哪些基因為靶基因調(diào)控神經(jīng)分化，在本文中進(jìn)行了理論的預(yù)測。

本文以miRWalk和DAVID數(shù)據(jù)庫為依據(jù)，以GO功能為基礎(chǔ)篩選了與神經(jīng)分化相關(guān)的microRNA-134靶基因（GO 0030182和GO 0048667），并構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)圖，通過ClusterONE功能模塊分析發(fā)現(xiàn)CASP3，ITGB1，PAFAH1B1，PRKCA，EFNA2，NKX6-1，NRCAM，STXBP1，KCNIP2，ABI2，CNTN2，F(xiàn)OXA1等12個基因聚集在11個模塊中發(fā)揮作用，說明這12個基因作用在神經(jīng)分化中比較重要。NKX6-1，是一種同源框轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控3個神經(jīng)元軸突導(dǎo)向分子的表達(dá)量控制神經(jīng)元軸突的生長[22]，且通過與PR結(jié)構(gòu)域蛋白12的交叉抑制作用促進(jìn)中間神經(jīng)元的生長[23]。FOXA1，作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控中腦多巴胺能神經(jīng)元的分化[24]，CNTN2在早期腦神經(jīng)節(jié)和脊髓運動神經(jīng)元中不表達(dá)，而在成熟神經(jīng)元中表達(dá)[25]。

綜上所述，本文初步驗證了microRNA-134在促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的過程中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用生物信息學(xué)的方法分析了在神經(jīng)分化中發(fā)揮作用的microRNA-134的靶基因，并篩選了與神經(jīng)分化相關(guān)的12個關(guān)鍵蛋白，但這些蛋白的作用還需實驗的進(jìn)一步驗證。

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