2型糖尿病小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的病理生理變化*

齊艷萍，田孝祥，劉丹，吳鵬，閆承慧，韓雅玲

（1.錦州醫(yī)科大學(xué) 研究生院，遼寧 錦州 121001；2.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是由胰島β細(xì)胞分泌障礙或者胰島素抵抗引起的代謝性疾病，主要分為1型和2型，其中2型糖尿病（T2DM）常見(jiàn)[1]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，2016年我國(guó)T2DM患者已有1.1億，還有5億以上成年人處于糖尿病前期，位居世界首位。T2DM病理改變主要是胰島素抵抗及胰島素分泌不足[2]，而高脂飲食和肥胖是引起胰島素抵抗的主要誘因[3]。本研究采用高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）方法復(fù)制動(dòng)物模型用來(lái)模擬人類T2DM病理改變[4]。既往研究中[5]，雖采用高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)來(lái)復(fù)制T2DM動(dòng)物模型，但是沒(méi)有對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)。本研究在STZ注射的不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)代謝指標(biāo)及心功能等指標(biāo)進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)，明確了各種病理改變發(fā)生的具體時(shí)間，為T2DM干預(yù)治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

STZ（貨號(hào)：S0130）、檸檬酸（貨號(hào) ：791725）、檸檬酸鈉（貨號(hào)：S4641）購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司。檸檬酸2.1 g，溶于100 ml蒸餾水中配成A液，檸檬酸鈉2.94 g溶于100 ml蒸餾水中配成B液，將A、B液按1∶1比例配成100 ml檸檬酸緩沖液，pH≈4.5。高脂鼠糧購(gòu)于美國(guó)Research diets Ins公司，血糖儀和羅氏卓越血糖試紙購(gòu)于羅氏中國(guó)公司，胰島素ELISA試劑盒購(gòu)買于英國(guó)Abcam公司，Masson染色試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。蘇木素、伊紅染液、鹽酸乙醇分化液、二甲苯、濃度梯度酒精，小動(dòng)物超聲機(jī)器、麻醉機(jī)、電子秤等由沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院心血管研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，8周齡，75只，體重（28.89±0.86）g，購(gòu)買于北京維通利華公司。飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室注冊(cè)批文號(hào)：SYXK（軍）2012-0003]，溫度、濕度適宜。小鼠自由攝食，飲水，12 h晝夜交替光照。

1.2.2 復(fù)制T2DM動(dòng)物模型 隨機(jī)將C57BL/6小鼠分為3組，分別為正常飲食對(duì)照組（normal diet，ND）、高脂飲食對(duì)照組（high fat，HF）、HF+STZ組。每組25只，每組小鼠體重平均28.89 g，空腹血糖平均8.5 mmol/L。HF+STZ組和HF組小鼠高脂鼠糧（脂含量60%）喂養(yǎng)4周。4周后，實(shí)驗(yàn)組小鼠給予STZ（25 mg/kg）腹腔注射，連續(xù)注射4 d，對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液[2]。

1.2.3 血糖檢測(cè) 復(fù)制模型前（-4周）、STZ注射時(shí)（0周）、STZ注射后不同時(shí)間點(diǎn)（1、2、3、4、6、8及12周）檢測(cè)小鼠空腹血糖。上午9時(shí)禁食，禁食4 h后麻醉，尾靜脈采血檢測(cè)空腹血糖。

1.2.4 糖耐量和胰島素耐量測(cè)定 葡萄糖耐量測(cè)定：小鼠禁食4 h，以2 g/kg劑量向小鼠腹腔注射總體積0.1 ml的葡萄糖水溶液，測(cè)定注射后15、30、60及120 min鼠尾靜脈血的血糖水平。胰島素耐量測(cè)定：小鼠禁食4 h，以0.75 u/kg劑量腹腔注射總體0.1 ml胰島素溶液，在注射后的15、30、60及120 min測(cè)定空腹血糖水平。采用曲線下面積（AUC）評(píng)價(jià)各組葡萄糖耐量及胰島素耐量改變。AUC計(jì)算公式：相鄰時(shí)間點(diǎn)空腹血糖相加×?xí)r間間隔/2。

1.2.5 血清胰島素測(cè)定 STZ注射后4、8及12周時(shí)，小鼠禁食4 h，麻醉，頸動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min，取上清，ELISA試劑盒檢測(cè)血清胰島素含量。

1.2.6 心功能測(cè)定 在STZ注射后4、6、8及12周時(shí)，應(yīng)用小動(dòng)物超聲檢測(cè)左心室舒張功能及收縮功能。

1.2.7 心肌組織學(xué)檢測(cè) STZ注射4、8及12周，麻醉小鼠，取心臟組織，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅染色，顯微鏡下觀察心臟大體情況，Masson染色觀察心肌纖維化程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同時(shí)間比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，若方差齊則組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。所有P值均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 代謝水平比較

3組在STZ注射不同時(shí)間點(diǎn)體重比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的體重有差異（F=5.189，P=0.000），②3組體重有差異（F=20.279，P=0.000），HF+STZ組小鼠體重低于HF組，高于ND組，HF組小鼠體重高于ND組，③3組體重變化趨勢(shì)有差異（F=5.723，P=0.000）。見(jiàn)圖1A。

3組在STZ注射不同時(shí)間點(diǎn)空腹血糖比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的空腹血糖有差異（F=46.047，P=0.000），②3組空腹血糖有差異（F=14.700，P=0.000），HF+STZ組小鼠空腹血糖高于HF組及ND組，HF組小鼠空腹血糖略高于ND組，③3組空腹血糖變化趨勢(shì)有差異（F=20.126，P=0.000）。見(jiàn)圖 1B。

STZ注射2周后，HF+STZ組小鼠糖耐量出現(xiàn)異常，曲線下面積（AUC）高于HF組和ND組（P=0.000和0.012），HF組AUC高于ND組（P=0.038）（見(jiàn)圖1C、1D）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，STZ注射2周后，HF+STZ組小鼠胰島素耐量出現(xiàn)異常，AUC低于HF組和ND組（均P=0.000），HF組胰島素耐量較ND組出現(xiàn)異常（P=0.000）（見(jiàn)圖 1E、1F）。

圖1 STZ注射不同時(shí)間點(diǎn)3組小鼠體重、空腹血糖、葡萄糖耐量及胰島素耐量比較 （n=8，±s）

2.2 血清胰島素含量比較

STZ注射后的4、8及12周時(shí)，小鼠禁食4 h，頸動(dòng)脈取血，離心，取上清，用ELISA胰島素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血胰島素含量。ND組、HF組與HF+STZ 3組血清胰島素含量比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)血清胰島素?zé)o差異（F=0.680，P=0.470），②3組血清胰島素有差異（F=46.445，P=0.006），HF+STZ組小鼠血清含量低于HF組，HF組胰島素含量高于ND組，③3組血清胰島素變化趨勢(shì)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.813，P=0.242），見(jiàn)圖2。

2.3 心肌組織學(xué)改變

STZ注射8周時(shí)，心肌組織HE染色，發(fā)現(xiàn)HF+STZ組小鼠左心室室壁較HF組及ND組肥厚，心腔減小。STZ注射12周時(shí)，心肌組織Masson染色結(jié)果顯示HF+STZ小鼠心臟較HF組及ND組發(fā)生纖維化改變。見(jiàn)圖3。

2.4 左心室功能比較

STZ注射后4、6、8周，應(yīng)用小動(dòng)物超聲檢測(cè)小鼠左心室功能。3組小鼠左心室E/A，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)3組小鼠左心室E/A有差異（F=28.888，P=0.002），②3組小鼠左心室E/A有差異（F=11.283，P=0.009），HF+STZ組小鼠左心室E/A低于HF組及ND組，HF組小鼠左心室E/A低于ND組，③3組小鼠左心室E/A變化趨勢(shì)有差異（F=5.885，P=0.002）。見(jiàn)圖 4A。

STZ注射8周后，HF+STZ組小鼠左心室E/A降低，較ND組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），雖然低于HF組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；STZ注射12周后，HF+STZ組左心室舒張功能障礙明顯，E/A比值低于HF組和ND組（P=0.024和0.001），HF組E/A低于ND組（P=0.026），見(jiàn)圖4A。

圖2 STZ注射后不同時(shí)間點(diǎn)3組小鼠血清胰島素含量 （n=8，±s）

3組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)左心室射血分?jǐn)?shù)有差異（F=52.300，P=0.000），②3組左心室射血分?jǐn)?shù)有差異（F=6.171，P=0.035），HF+STZ組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)低于HF組及ND組，HF組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)低于ND組，③3組左心室射血分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)有差異（F=7.453，P=0.024）。見(jiàn)圖 4B。

STZ注射12周時(shí)，HF+STZ組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)低于HF組及ND組（P=0.038和0.001），HF組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)低于ND組（P=0.016）。HF+STZ組及HF組小鼠在STZ注射12周時(shí)較STZ注射8周時(shí)左心室射血分?jǐn)?shù)降低（t=8.657和18.041，P=0.013和0.003），上述結(jié)果提示HF+STZ組小鼠在STZ注射8周時(shí)出現(xiàn)左心室舒張功能障礙，12周時(shí)出現(xiàn)左心室收縮功能障礙。

圖3 STZ注射8和12周心肌組織HE和Masson染色 （n=3）

圖4 STZ注射后不同時(shí)間點(diǎn)3組心功能情況 （n=8）

3 討論

T2DM主要表現(xiàn)為胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能障礙[6]。研究證實(shí)[7-8]高脂飲食和肥胖是引胰島素抵抗的主要誘因。高脂可導(dǎo)致細(xì)胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體和脂轉(zhuǎn)運(yùn)體分布異常，細(xì)胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體減少，脂轉(zhuǎn)運(yùn)體增多，從而引起糖攝取障礙，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)期慢性炎癥反應(yīng)，使胰島功能受損，并產(chǎn)生胰島素抵抗[9]。

既往糖尿病研究中，多采用高脂飲食聯(lián)合STZ方法誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型。STZ劑量可以決定復(fù)制的糖尿病動(dòng)物模型分型。一次性大劑量STZ注射，可以破壞大量胰島β細(xì)胞，引起胰島素分泌不足，復(fù)制1型糖尿病動(dòng)物模型[10]。小劑量STZ多次注射，對(duì)胰島β細(xì)胞的破壞作用較小，可復(fù)制T2DM動(dòng)物模型[11]。為研究T2DM動(dòng)物模型的病理改變，本實(shí)驗(yàn)采用25 mg/kg的小劑量STZ連續(xù)腹腔注射4 d方法復(fù)制T2DM動(dòng)物模型。單純高脂喂養(yǎng)，雖會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗及糖耐量異常[12]，但是空腹血糖仍低于糖尿病臨界值16.7 mmol/L。提示單純高脂喂養(yǎng)不能復(fù)制T2DM模型，因此，在小鼠高脂喂養(yǎng)4周時(shí)，給予腹腔注射25 mg/kg的STZ，連續(xù)注射4 d。本研究發(fā)現(xiàn)，在STZ注射1周后，小鼠空腹血糖增加，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，血糖水平逐漸增加。在STZ注射2周后，小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗及糖耐量異常。同時(shí)為充分證實(shí)模型復(fù)制是否成功，本研究還監(jiān)測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清胰島素水平。結(jié)果顯示，與HF組和ND組相比，HF+STZ組血清胰島素水平下降。上述結(jié)果均提示，本研究中高脂飲食聯(lián)合STZ成功復(fù)制T2DM小鼠模型。

研究發(fā)現(xiàn)[13-15]，糖尿病小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，線粒體功能障礙，心肌細(xì)胞損傷，導(dǎo)致心功能異常。長(zhǎng)期高糖高脂病理刺激，可導(dǎo)致心肌中膠原纖維Ⅰ和膠原纖維Ⅲ堆積，纖維化通路重要因子TGF-β表達(dá)增加，引起心肌重塑，功能障礙，影響收縮功能[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與HF組和ND組比較，在STZ注射8周時(shí)，HF+STZ組小鼠左心室明顯肥厚并左心室舒張障礙。在STZ注射12周時(shí)，HF+STZ組小鼠心肌出現(xiàn)纖維化，收縮功能明顯障礙。然而，在本研究中，高脂聯(lián)合STZ導(dǎo)致哪條信號(hào)通路異常進(jìn)而導(dǎo)致心肌收縮功能和舒張功能出現(xiàn)嚴(yán)重障礙還尚不清楚，有待于進(jìn)一步的深入研究。

本實(shí)驗(yàn)在STZ注射的不同時(shí)間點(diǎn)，連續(xù)檢測(cè)T2DM病理改變，明確了各種病理改變出現(xiàn)的時(shí)間，提示T2DM早期主要表現(xiàn)為糖代謝異常及左心室舒張功能障礙，晚期出現(xiàn)心肌纖維化，左心室收縮功能障礙。因此，為預(yù)防T2DM引起心臟功能改變，應(yīng)盡早進(jìn)行干預(yù)治療。

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